藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理中組分及抗氧化活性變化

李亞輝， 周劍忠， 馬艷弘， 張宏志， 王 英

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

藍(lán)莓，俗稱越桔，是杜鵑科越橘屬野生落葉灌木漿果，果實球形或橢圓形，成熟后為藍(lán)紫色，果皮表面有白霜[1]。藍(lán)莓原產(chǎn)于歐美，世界上有450多個品種，我國有91個種28個變種，主要分布于東北和西南地區(qū)，共中兔眼品種藍(lán)莓在我國南方地區(qū)有較大面積的種植[2]。藍(lán)莓果實色澤鮮艷、酸甜可口、營養(yǎng)物質(zhì)豐富，尤其是花色苷和多酚含量位居果蔬之首[3-4]。藍(lán)莓具有抗氧化、防衰老等多種功效，不僅可以防治各種疾病還可以增強(qiáng)人體健康，具有較高的營養(yǎng)價值和保健功能[5]。

藍(lán)莓酒是一種新興果酒，是以藍(lán)莓為原料的生物發(fā)酵制品。其不僅最大程度地保留了藍(lán)莓原果中的營養(yǎng)成分，而且通過發(fā)酵還產(chǎn)生了大量生物活性物質(zhì)，因此被譽(yù)為“液體黃金”、“酒中皇后”和“口服的人類化妝品”[6]。渾濁沉淀是藍(lán)莓酒生產(chǎn)中常見的問題，尤其是裝瓶后產(chǎn)生渾濁沉淀將會大大影響其品質(zhì)和商品形象。澄清穩(wěn)定處理是藍(lán)莓酒生產(chǎn)中的重要步驟，也是解決果酒渾濁沉淀的主要方法，它可使果酒獲得良好的澄清度和穩(wěn)定性[7]。澄清穩(wěn)定處理的方法主要有離心、下膠、過濾、熱處理、冷處理、添加穩(wěn)定劑等[8-9]。通過澄清穩(wěn)定處理，酒體獲得良好澄清度，變得清澈透亮，并且處于穩(wěn)定狀態(tài)長期保持這一澄清度。但在果酒發(fā)酵結(jié)束后，任何的處理都是以犧牲果酒的質(zhì)量為代價的，因此應(yīng)將對酒的處理降至最小程度。

本文作者在課題組前期對藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理方法優(yōu)化的基礎(chǔ)上，研究了澄清穩(wěn)定處理過程中藍(lán)莓酒組分和生物活性的變化，以期為在藍(lán)莓酒后處理中保證藍(lán)莓酒品質(zhì)奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓酒（兔眼藍(lán)莓釀造，12.1%），句容萬山紅遍生物科技有限公司提供。

硅藻土、皂土，上海杰兔工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、碘標(biāo)準(zhǔn)液、NaOH標(biāo)準(zhǔn)液、菲林試劑，深圳市博林達(dá)科技有限公司產(chǎn)品；沒食子酸標(biāo)品，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；福林試劑，上海荔達(dá)生物科技有限公司產(chǎn)品；FeSO4、VC、鄰苯三酚、鐵氰化鉀，天津科密歐試劑公司產(chǎn)品；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

酒精計、玻璃整流器、密度瓶，上海玻璃儀器廠制造；控溫冰箱，北京福意聯(lián)電器有限公司產(chǎn)品；pH酸度計，梅特勒-托利多產(chǎn)品；砂芯過濾器，德州潤昕實驗儀器有限公司產(chǎn)品；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺，蘇州蘇凈凈化設(shè)備廠制造；LRH-150生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；DSX-280B手提式蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠制造；7890氣相色譜儀、5975C質(zhì)譜儀，美國Agilent公司產(chǎn)品；萃取頭，美國Supelco公司產(chǎn)品；UV-3802H紫外可見分光光度儀，上海尤尼柯儀器有限公司產(chǎn)品；數(shù)顯加熱磁力攪拌器，上海越眾儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 澄清穩(wěn)定處理步驟

發(fā)酵結(jié)束→自然澄清→硅藻土過濾→下膠處理→冷凍處理→硅藻土過濾→微濾

操作要點(diǎn)：自然澄清溫度為15～20℃，時間為1個月；硅藻土松散密度為0.10～0.20；微濾濾膜孔徑為 0.45 μm。

其他操作要點(diǎn)及參數(shù)參照李亞輝等優(yōu)化的藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理方法[10]。

1.3.3 全瓷貼面試戴與粘接臨床試戴、粘接 制作完成后試戴貼面，檢查其形態(tài)、質(zhì)地、顏色和邊緣適合性，必要時對貼面作適當(dāng)?shù)恼{(diào)改。通過試戴后，選用合適的樹脂水門汀進(jìn)行粘接，調(diào)整咬合，并進(jìn)行打磨拋光。記錄每單位修復(fù)體試戴、調(diào)改至患者滿意或可接受所花費(fèi)的時間。所有入選病例的臨床操作均由同一位高年資主治醫(yī)師完成，瓷貼面的制作及拋光、上釉等均由同一位技師完成。2組患者在治療結(jié)束后均予以口腔衛(wèi)生健康指導(dǎo)，使其掌握正確的刷牙方法，并養(yǎng)成良好的口腔衛(wèi)生習(xí)慣。

通過上述處理的藍(lán)莓酒澄清度和色度分別為0.749和1.128，和沒有進(jìn)行處理的相比具有良好的澄清度、無潛在的蛋白質(zhì)破敗和色素沉淀，且在長時間瓶儲中具有良好的澄清度和色度穩(wěn)定性。

取樣：每個處理步驟結(jié)束后取樣一次，除測定微生物指標(biāo)外，其余樣品放－4℃冰箱待測。

1.4 試驗方法

1.4.1 理化指標(biāo)測定 pH值采用酸度計進(jìn)行測定。

酒精度、總糖、總酸、總SO2、游離SO2和干浸出物參照國標(biāo)GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行檢測。

1.4.2 微生物指標(biāo)測定 菌落總數(shù)測定：參照GB 4789.2-2010《菌落總數(shù)測定》；酵母菌數(shù)測定：參照GB 4789.15-2010《霉菌和酵母計數(shù)》。

1.4.3 揮發(fā)性香氣物質(zhì)測定 參照曹雪丹等所述方法[11]。氣相色譜條件為：程序升溫，40℃ 保持3 min，以3℃/min升至160℃，2 min后，以8℃/min升至220℃ ，3 min后，進(jìn)樣口溫度達(dá)250℃。質(zhì)譜條件：電子能量 70 eV，離子源溫度 230℃。定性分析：氣相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行分析鑒定，計算各個色譜峰的保留指數(shù)，運(yùn)用計算機(jī)譜庫進(jìn)行檢索及分析，確認(rèn)檢測物成分。

1.4.4 多酚質(zhì)量濃度測定 總酚質(zhì)量濃度測定。參照牛雪等所述福林酚法[12]：取樣品0.1 mL，蒸餾水為空白，加濃度為1 mol/L的福林酚試劑0.1 mL和60 g/L碳酸鈉溶液0.8 mL，在微波爐中檔下處理20 s后，在765 nm波長下測定其吸光值。結(jié)果以每升樣品中含有相當(dāng)沒食子酸的克數(shù)表示。

總花色苷質(zhì)量濃度測定。參照孫婧超等所述pH示差法進(jìn)行花色苷含量測定[13]。計算公式如（1）

1.4.5 抗氧化活性測定 DPPH自由基清除能力測定。參照Atoui et al.所述方法[14]：取1 mL樣品，蒸餾水為空白，對照組用0.4 mg/mL的Vc溶液代替樣品。

式（2）中A1為樣品組的吸光值；A0為對照組的吸光值。

超氧陰離子自由基清除能力測定。參照胡翠珍等所述方法[15]：以Tris-HCl緩沖液作參比，在320 nm波長處測定樣品吸光度A1，以等體積的蒸餾水代替樣品和鄰苯三酚溶液，測對照吸光度A0，計算清除率，如式（3）。

還原力測定。參照黃曉杰等所述方法[16]：取樣品0.1 mL，蒸餾水為空白，加磷酸鈉緩沖液2.5 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合均勻，置于50℃水浴20 min后冷卻。然后加體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液2.5 mL，混合均勻。取反應(yīng)液5 mL，加蒸餾水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%氯化鐵溶液各5 mL，混合均勻，于700 nm處測量吸光值A(chǔ)。吸光度值越高表明還原力越強(qiáng)。

總抗氧化活性測定。參照李亞輝等所述FRAP法[17]：取1 mL樣品，蒸餾水為空白，對照用0.4 mg/mL的VC溶液代替，每個樣品重復(fù)3次。以1.0 mmol/L FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)，樣品抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光值所需FeSO4的濃度（μmol/L）表示，定義為FRAP值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每個樣品重復(fù)測定3次，利用Excel和SPSS18.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)的變化

藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理中理化指標(biāo)的變化如表1所示。由表1可知，pH值和總酸質(zhì)量濃度在處理過程中有一定的變化，但變化較小，冷凍處理后pH值有較小的增加，總酸質(zhì)量濃度有較小的減少，但沒有顯著性差異。冷凍處理后pH值和總酸質(zhì)量濃度較小的變化，可能是因為冷凍處理導(dǎo)致酒中部分酸鹽達(dá)到飽和狀態(tài)，并結(jié)晶析出，從而使總酸質(zhì)量濃度降低、pH值升高[18]。這說明冷凍處理可在一定程度上降低藍(lán)莓酒的酸度，改善藍(lán)莓酒的口感，但效果不明顯。發(fā)酵結(jié)束后，總糖質(zhì)量濃度在4 g/L以下，達(dá)到了干酒的標(biāo)準(zhǔn)，在整個處理過程中總糖質(zhì)量濃度幾乎沒有變化，一直維持在3.75 g/L左右。酒精度在處理過程中逐漸降低，硅藻土過濾對酒精度的變化影響較大，可能是在過濾過程中酒精揮發(fā)引起的酒精度降低。這說明在處理過程中應(yīng)盡量減少硅藻土過濾的次數(shù)和時間，以避免酒精的損失。總二氧化硫和游離態(tài)二氧化硫質(zhì)量濃度在處理過程中有較顯著的降低，硅藻土過濾對總二氧化硫質(zhì)量濃度有較大的影響，使其顯著降低；硅藻土過濾和下膠處理對游離態(tài)二氧化硫質(zhì)量濃度有較大的影響，使其顯著降低；處理結(jié)束后總二氧化硫質(zhì)量濃度降低了28.6%，游離態(tài)二氧化硫質(zhì)量濃度降低了55.6%，處理過程對游離態(tài)二氧化硫質(zhì)量濃度的影響顯著大于對總二氧化硫質(zhì)量濃度的影響。二氧化硫是果酒釀造中重要的輔料，可以起到殺菌和抗氧化的作用。酒中二氧化硫分為結(jié)合態(tài)和游離態(tài)，只有游離態(tài)二氧化硫才具有抗氧化性和殺菌性，因此要在保持總二氧化硫質(zhì)量濃度一定的情況下，盡量提高游離態(tài)二氧化硫的質(zhì)量濃度[19]。此結(jié)果說明，澄清穩(wěn)定處理對二氧化硫質(zhì)量濃度尤其是游離態(tài)二氧化硫含量有較大影響，因此要進(jìn)一步優(yōu)化澄清穩(wěn)定處理條件使其對游離態(tài)二氧化硫的影響降到最低，或是在處理后及時補(bǔ)加一定量的二氧化硫，提高游離態(tài)二氧化硫質(zhì)量濃度，使藍(lán)莓酒保持一定的抗菌能力和抗氧化能力。干浸出物在處理過程中也有顯著降低，其中自然澄清、第一次硅藻土過濾和下膠處理對其影響較大，使其質(zhì)量濃度顯著降低。發(fā)酵結(jié)束時酒體較為渾濁，含有大量雜質(zhì)，因此自然澄清后干浸出物有較大的降低；第一次硅藻土過濾除去了部分色素和一些較小顆粒的固形物因此造成干浸出物質(zhì)量濃度降低；下膠處理除去了不穩(wěn)定色素、蛋白質(zhì)和其他懸浮性雜質(zhì)從而造成干浸出物質(zhì)量濃度降低。此結(jié)果說明應(yīng)盡量簡化澄清穩(wěn)定處理步驟，以減少對酒中干物質(zhì)質(zhì)量濃度的影響。

表1 澄清穩(wěn)定處理中藍(lán)莓酒理化指標(biāo)的變化Table 1 Changes of physical and chemical index during clarification and stabilization process of blueberry wine

2.2 微生物指標(biāo)的變化

藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理中微生物指標(biāo)的變化如圖1所示。由圖1可知，酵母菌和總菌落數(shù)量、變化趨勢均一致，沒有顯著差異，說明發(fā)酵結(jié)束后酵母菌是酒中主要微生物。酵母菌在澄清穩(wěn)定處理過程中數(shù)量逐漸減少，自然澄清、硅藻土過濾和微濾使酵母菌數(shù)量顯著減少，下膠和冷處理使酵母菌數(shù)量有一定的減少，但不顯著。自然澄清階段酒中碳源已基本被耗盡，大量酵母菌死亡，因此其數(shù)量大大減少；硅藻土過濾可除去部分酵母菌，因此也使其數(shù)量大大減少；下膠和冷處理促使部分酵母菌絮凝沉淀，從一定程度上抑制了酵母菌活性；微濾起到除菌作用，使酒處于無菌狀態(tài)。此結(jié)果說明澄清穩(wěn)定處理可以除去酒中微生物，使其達(dá)到較好的生物穩(wěn)定性。

2.3 揮發(fā)性香氣物質(zhì)的變化

圖1 澄清穩(wěn)定處理中微生物數(shù)量的變化Fig.1 Changes of microbe quantity during clarification and stabilization process

揮發(fā)性香氣物質(zhì)是葡萄酒和其他果酒的重要組成成分，是形成果酒不同風(fēng)味的重要物質(zhì)和果酒感官評價的重要指標(biāo)[20-21]。藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的變化如表2所示。由表2可知，澄清穩(wěn)定處理前后揮發(fā)性香氣物質(zhì)的數(shù)量有較大變化，處理前共檢測出38種物質(zhì)，其中醇類5種、酯類11種、酸類4種、帖類10種、烴類8種；第一次硅藻土過濾后檢測出33種物質(zhì)，其中醇類5種、酯類9種、酸類4種、帖類9種、烴類6種；冷凍處理后檢測出31種物質(zhì)，其中醇類5種、酯類8種、酸類3種、帖類10種、烴類5種；第二次硅藻土過濾后檢測出26種物質(zhì)，其中醇類3種、酯類6種、酸類3種、帖類8種、烴類6種；處理后檢測出25種物質(zhì)，其中醇類3種、酯類6種、酸類3種、帖類7種、烴類5種。此結(jié)果說明澄清穩(wěn)定處理對藍(lán)莓酒香氣物質(zhì)有較大影響，大大減少了其數(shù)量。同時也表明了我們要進(jìn)一步優(yōu)化澄清穩(wěn)定處理工藝、減少處理步驟，降低其對揮發(fā)性香氣物質(zhì)的影響、提高藍(lán)莓酒的整體品質(zhì)。

表2 澄清穩(wěn)定處理前后揮發(fā)性香氣物質(zhì)的變化Table 2 Changes of volatile aroma components before and after clarification and stabilization process

2.4 多酚質(zhì)量濃度的變化

藍(lán)莓及其制品因富含多酚物質(zhì)而成為保健品市場的新寵，多酚是藍(lán)莓中重要的抗氧化物質(zhì)，藍(lán)莓多酚主要包括原花青素、花色苷、黃酮和單寧等，其中花色苷是最重要也是含量最高的多酚物質(zhì)[22-23]。本試驗主要對藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理中總酚和總花色苷質(zhì)量濃度的變化進(jìn)行了測定，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在澄清穩(wěn)定處理中總酚和總花色苷質(zhì)量濃度逐漸降低，且兩者具有相同的變化趨勢。澄清穩(wěn)定處理后總酚質(zhì)量濃度下降了約30%，總花色苷質(zhì)量濃度下降了約24%。下膠和冷凍處理對總酚和總花色苷質(zhì)量濃度的影響較大，而自然澄清、硅藻土過濾和微濾對兩者質(zhì)量濃度的影響較小。這可能是因為下膠和冷凍處理促進(jìn)了酒中游離花色苷和其他不穩(wěn)定多酚物質(zhì)的絮凝沉淀[24]，從而造成總酚和總花色苷質(zhì)量濃度大幅下降。澄清穩(wěn)定處理除去的主要是游離態(tài)花色苷和其他不穩(wěn)定雜質(zhì)，因為它們是造成果酒渾濁沉淀的主要因素。這說明過度的追求果酒的澄清度，勢必會造成其營養(yǎng)成分的損失。

圖2 澄清穩(wěn)定處理中多酚質(zhì)量濃度的變化Fig.2 Changes of polyphenols quantity during clarification and stabilization process

2.5 抗氧化活性的變化

藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理中抗氧化性的變化如圖3所示，其中DPPH自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率的變化如圖3（a）所示，還原力和總抗氧化性的變化如圖 3（b）所示。 由圖 3（a）可知，DPPH 自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率在澄清穩(wěn)定處理中均逐漸降低，澄清穩(wěn)定處理后DPPH自由基清除率下降了約32%，超氧陰離子自由基清除率下降了約24%。下膠和冷凍處理對2個清除率的影響較大，而自然澄清、硅藻土過濾和微濾對其影響較小。2個清除率的變化趨勢與總酚和總花色苷質(zhì)量濃度的變化趨勢一致，這可能是由總酚和總花色苷質(zhì)量濃度的降低引起的。由圖3（b）可知，還原力和總抗氧化性在澄清穩(wěn)定處理中也逐漸降低，澄清穩(wěn)定處理后兩者分別下降了約14%和25%。其中硅藻土過濾、下膠處理和冷凍處理對還原力和總抗氧化性的變化影響較大。澄清穩(wěn)定處理中還原力和總抗氧化性降低，可能是由于總酚質(zhì)量濃度和游離態(tài)二氧化硫質(zhì)量濃度降低引起的。此結(jié)果說明澄清穩(wěn)定處理降低了藍(lán)莓酒的抗氧化活性，進(jìn)一步說明了對酒體的任何處理都是以犧牲酒的內(nèi)在品質(zhì)為代價的。

圖3 澄清穩(wěn)定處理中抗氧化活性的變化Fig.3 Changes of antioxidant activity during during clarification and stabilization process

3 結(jié) 語

本文作者通過對藍(lán)莓酒澄清穩(wěn)定處理過程中理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)、揮發(fā)性香氣物質(zhì)、多酚質(zhì)量濃度和抗氧化性的測定，研究了其在澄清穩(wěn)定處理中組分和抗氧化性的變化。結(jié)果表明：在澄清穩(wěn)定處理中，總糖質(zhì)量濃度沒有變化；pH值和總酸質(zhì)量濃度有一定的變化，但變化較?。痪凭仍谔幚磉^程中逐漸降低，但沒有顯著差異；總二氧化硫和游離態(tài)二氧化硫質(zhì)量濃度顯著降低，硅藻土過濾和下膠處理對其影響較大；干浸出物質(zhì)量濃度顯著降低，自然澄清、硅藻土過濾和下膠處理對其影響較大。澄清穩(wěn)定處理后揮發(fā)性香氣物質(zhì)的數(shù)量大大減少，由處理前的38種減少為25種。澄清穩(wěn)定處理中總酚和總花色苷質(zhì)量濃度顯著降低，下膠和冷凍處理步驟對兩者質(zhì)量濃度影響較大。DPPH自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、還原力和總抗氧化性均有顯著降低。此結(jié)果說明澄清穩(wěn)定處理降低了藍(lán)莓酒的營養(yǎng)成分和功能活性，我們應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化并盡量減少對其處理步驟，保證其內(nèi)在品質(zhì)。