HA-His/PEI-His/DNA納米復合載體的制備及基因轉染研究

田慧慧， 吳 婧， 伍亞玲， 徐 政， 陳荊曉， 陳敬華

（江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122）

隨著人類基因組計劃的開展，基因與多種重大疾病之間的關系受到人們的關注。基因療法作為一種將外源性基因導入靶細胞，用于治療因基因缺陷或異常所引起疾病的方法，對治療癌癥、心血管疾病、遺傳病等多種重大疾病具有較高的潛力[1-2]。大量研究表明，載體是影響基因治療效果的關鍵因素之一。利用安全、穩(wěn)定的載體不僅能有效保護目的基因不被體內(nèi)的酶降解[3]，還有助于提高基因的傳遞和轉染效率。

目前，臨床研究中更傾向于使用以聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）為代表的非病毒載體。這主要是因為非病毒載體不僅易制造、易修飾、價格低廉，還能夠避免病毒載體誘發(fā)的生物安全性方面的缺陷[4-5]。病毒載體可能在染色體上隨機插入激活原癌基因，誘導強烈的免疫反應而造成其他病癥[6]。PEI這種陽離子高分子材料，可以有效壓縮DNA并將其傳遞至細胞內(nèi)，進而通過“質子海綿”效應釋放目的基因進入細胞核，實現(xiàn)高效轉染[7]。不過，PEI高正電荷密度的性質也導致其容易破壞細胞膜結構，從而表現(xiàn)出較高的細胞毒性。PEI還易與帶負電荷的血漿蛋白結合，在血液循環(huán)過程中被機體清除[8]。此外，PEI缺乏對腫瘤細胞的識別能力，在治療過程中不具有選擇性。為解決上述問題，研究人員嘗試用可斷裂的化學鍵交聯(lián)低相對分子質量PEI，或對其表面進行修飾，以降低其電荷密度，提高靶向性[9]。另一策略是利用電荷相互作用，將PEI與負電性材料結合，得到納米聚電解質復合物作為載體[10-11]。有報道用帶弱負電的透明質酸 （hyaluronic acid，HA）與PEI制備聚電解質復合物，不僅能夠避免與血漿蛋白吸附，還可以利用HA與腫瘤細胞表面過度表達的CD44受體之間的識別作用，提高對腫瘤細胞的靶向性[12]。除此之外，HA作為一種天然多糖還具有生物相容性好、可生物降解的優(yōu)點[13]。然而，聚電解質復合物依賴于聚陽離子和聚陰離子化合物之間的電荷相互作用[14]，這會造成聚陰離子與DNA之間競爭，導致DNA包裹不夠緊密而泄漏，降低轉染效率。因此，如何提高載體穩(wěn)定性，防止DNA泄漏失活，是這類材料實現(xiàn)高效基因傳遞的關鍵。

組氨酸（Histidine，His）是一種廣泛用于 pH敏感性材料制備的氨基酸。由于His分子結構中含有咪唑基團（pKa～6.0），其在生理pH 7.4條件下表現(xiàn)為疏水性，在pH＜6時又吸收質子表現(xiàn)出親水性[15]。利用His的這一特性，本研究中用His分別修飾PEI和 HA，制備 PEI-His（PH）和 HA-His（HH），之后通過正負電荷吸附，兩步包載得到HH/PH/DNA（HPD）復合物。PEI經(jīng)His修飾能降低表面電荷密度，從而降低其細胞毒性；同時保持對DNA的包裹能力。HA經(jīng)His修飾，可減少其與DNA間對電荷的競爭，利用His在生理pH下的疏水性，還能使復合物結構更加緊密。另外，利用HA對腫瘤細胞的識別作用，還可以提高材料傳遞基因時對腫瘤細胞的靶向性。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

HA（Mw：6.2×103），山東福瑞達生物化工有限公司產(chǎn)品；透明質酸酶 （HAase）、脫氧核糖核酸酶I（DNase I），上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品；L-組氨酸（L-His）、1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）、枝化 PEI（Mw：25 kDa）、噻唑藍（MTT）、胰酶、上海阿拉丁試劑有限公司產(chǎn)品；RPMI 1640細胞培養(yǎng)基、DMEM 細胞培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS），美國Gibco Invitrogen公司產(chǎn)品；pEGFP-N1 pDNA，美國Promega公司產(chǎn)品。

1.2 儀器

FreeZone 2.5 L型冷凍干燥機，美國Labconco公司產(chǎn)品；Avance III型核磁共振波譜儀（400 MHz），德國Bruker公司產(chǎn)品；JEM-2100型透射電子顯微鏡，日本JEOL公司產(chǎn)品；Zetasizer Nano ZS型激光粒度儀，英國Malvern公司產(chǎn)品；Multiskan GO型酶標儀，美國Thermo公司產(chǎn)品；DMIL/LED型熒光顯微鏡，德國Leica公司產(chǎn)品；FACSCalibur型流式細胞儀，美國BD公司產(chǎn)品。

1.3 細胞株

小鼠黑色素瘤細胞（B16）和非洲綠猴腎成纖維細胞（COS7），購自中國科學院上海生命科學研究院細胞保藏中心。

1.4PH和HH的制備

將200 mg和400 mg的His分別溶解于50 mL去離子水中，加入0.93 g EDC·HCl和0.70 g NHS，調(diào)節(jié)溶液pH至4～5，于室溫攪拌1 h，之后分別加入8 mL的PEI溶液（25 mg/mL），調(diào)節(jié)pH至 7.4，繼續(xù)反應24 h，反應結束后將溶液裝入透析袋，對去離子水透析除去未反應的His及雜質，凍干得PH1和PH2，用1H NMR驗證其結構。

將100 mg的HA溶于50 mL去離子水中，加入 72.8 mg EDC·HCl和 43.7 mg NHS，反應 1 h 后，向溶液中加入78.5 mg His。室溫攪拌24 h后，將溶液裝入透析袋，對去離子水透析除去未反應的His及雜質，凍干得HH，用1H NMR驗證其結構。

1.5 PD和HPD復合物的制備

將 1 mL pDNA 溶液（100 μg/mL）加入到 1 mL不同質量濃度的 PH1 和 PH2 溶液（20、50、100、200、500 μg/mL）中，渦旋振蕩，室溫靜置 30 min，得到具有不同 PH/DNA 質量比（分別為 1∶5，1∶2，1∶1，2∶1，5∶1）的復合物，分別標記為 PD1 和 PD2。

將 1 mL pDNA 溶液（100 μg/mL）滴加到 1 mL PH1 溶液（200 μg/mL）中，渦旋振蕩，室溫靜置 30 min，之后將所得PD復合物溶液滴加到不同質量濃度的 2 mL HH 溶液（150、200、250、300、350 μg/mL）中，渦旋振蕩，室溫靜置30 min，得到具有不同HH/PH1/DNA 質量比（分別為 3∶2∶1，4∶2∶1，5∶2∶1，6∶2∶1，7∶2∶1）的 HPD 復合物。

1.6 PD和HPD的表征

取18 μL上述制備的PD和HPD復合物，加入2 μL Loading Buffer（10×），通過瓊脂糖凝膠電泳檢測復合物對DNA的包載能力，用凝膠成像系統(tǒng)記錄實驗結果；取1 mL上述制備的PD和HPD復合物用粒徑儀測定復合物的平均粒徑及ζ-電位，通過TEM觀測HPD復合物的微觀形貌。

1.7 復合物酶穩(wěn)定性實驗

參照1.5中方法制備HPD復合物，取15 μL溶液，在不同樣品中分別加入 1 μL HAase（3 U/μL）和1 μL DNase I（10 U/μL），另取 3 μL 裸 pDNA 溶液直接加入 1 μL DNase I（10 U/μL），樣品于 37 ℃孵育30 min，再于65℃加熱20 min終止反應，所有樣品用超純水補齊體積至 18 μL，加 2 μL Loading Buffer（10×），之后進行瓊脂糖電泳實驗，用凝膠成像系統(tǒng)記錄實驗結果。

1.8 細胞毒性實驗

材料的細胞毒性用B16和COS7細胞進行測試。將細胞分別以8000個/孔的密度接種于96孔板，B16細胞用含體積分數(shù)為10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，COS7細胞用含體積分數(shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。之后小心移去培養(yǎng)基，加入 100 μL 含不同質 量濃度 （1、10、20、50、100、200、300、500 μg/mL）PEI、PH 和 HH 的培養(yǎng)基溶液，其中PEI溶液質量濃度與PH1、PH2溶液中對應的PEI質量濃度一致，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL MTT溶液，37℃下繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后吸除MTT，每孔再加入 100 μL DMSO混合均勻，用酶標儀測定其在570 nm下的光密度值（OD570），計算細胞存活率，如下式（1）。

以不加樣品作為空白對照，每組3個平行樣。

1.9 細胞轉染實驗

以pEGFP-N1 pDNA為報告基因進行轉染實驗。首先將細胞以2×105個/孔的密度接種到6孔板中，吸出培養(yǎng)基后，加入1 mL含復合物的培養(yǎng)基溶液，其中pDNA的質量為4 μg，于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸出含藥培養(yǎng)基，加入1 mL含體積分數(shù)為10%FBS的新鮮培養(yǎng)基，于37℃的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)20 h，用無菌PBS緩慢沖洗3次，用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。細胞用胰酶消化，用PBS制成細胞懸液，用流式細胞儀對細胞轉染情況進行定量檢測，以空白細胞作為陰性對照，以PEI/DNA（N/P=10）復合物為陽性對照，每組3個平行樣。其中，PD 復合物的質量比分別為 1∶2、1∶1、2∶1，HPD 復合物的質量比為 7∶2∶1。

2 結果與討論

2.1PH以及HH的1H NMR譜圖分析

PH和HH分別用1H NMR表征其化學結構。見圖 1（a），在 2.9~3.20（m，4H，-CH2CH2-）處為 PEI分子中亞甲基的氫，7.25（s，1H，-N=CH-）為 His咪唑環(huán)上的 H-2，8.02（s，1H，-N=CH-）為 His咪唑環(huán)上的H-1，表明His已成功連接到PEI分子。通過峰面積計算His在PH1中取代度為3.2%，在PH2中取代度為 7.3%。 見 1（b），1.98（s，3H，CH3-CO-）處為HA 上 N-乙酰甲基的氫，7.22（s，H，-N=CH-）為 His咪唑環(huán)上的 H-b，8.49（s，1H，-N=CH-）為 His咪唑環(huán)上的H-a，表明His已成功連接至HA分子，通過峰面積比計算得到His在HH上的取代度為6.2%。

圖1 PH1、PH2與HH的化學結構及核磁共振譜圖Fig.1 Chemical structures and1H NMR spectra of PH1，PH2 and HH

2.2 PD的瓊脂糖凝膠電泳

材料對DNA的有效包載是實現(xiàn)轉染的首要條件，因此先通過瓊脂糖凝膠電泳測試2種PH對DNA的包載能力。從圖2中可以看出，當PEI/pDNA的質量比為1∶5時，PEI即可完全包載pDNA，而當PD1的質量比大于 1∶5，PD2的質量比大于 1∶2時，可在孔中觀察到pDNA條帶，說明此時載體可包載pDNA并形成復合物，pDNA不會隨電場在凝膠中移動。與PEI相比，PH包裹DNA的能力有所減弱，這是因為經(jīng)His修飾，PH1和PH2與PEI相比，其表面的正電荷密度有所降低所致，但其對DNA的復合能力得以保持。由于His在PH1上的取代度（3.2%）低于在PH2上的取代度（7.3%），因而PH1攜帶更多的正電荷，其對DNA的包載能力更強。

圖2 PEI/pDNA、PD1與PD2復合物的瓊脂糖凝膠電泳阻滯圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PEI/pDNA，PH1/pDNA and PH2/pDNA complexes

2.3 PD的平均粒徑和電位

PD復合物的平均粒徑和ζ-電位如圖3所示。2種PH都可以有效壓縮pDNA形成納米尺度的復合物。隨著質量比逐漸增加至5∶1，PD1和PD2復合物的平均粒徑分別減小至103 nm和112 nm，而ζ-電位則逐漸增加至53 mV和40 mV。對于2種PD而言，當質量比大于1∶2時，載體表面攜帶正電荷，這表明PH已經(jīng)完全包載pDNA，該結果與瓊脂糖凝膠電泳試驗結果一致。同質量比條件下，由于PH1比PH2的正電荷密度更高，因此PD1的ζ-電位更高，其在溶液中穩(wěn)定性也更好。根據(jù)粒徑和ζ-電位的值，選用質量比為 1∶2、1∶1 和 2∶1 進行 2 種復合物的轉染試驗，以找出其最佳轉染條件。

圖3 PD1、PD2復合物的平均粒徑及ζ-電位Fig.3 Average size and ζ-potential of PD1 and PD2 complexes

2.4 PD復合物轉染性能評價

PD復合物介導的轉染效率通過流式細胞儀進行定量檢測，結果如圖4所示?？梢钥闯?，在PD1和PD2的質量比為2∶1時，PH1能夠更為有效地介導pDNA實現(xiàn)轉染，效率明顯高于PH2。由于復合物進入細胞介導DNA轉染依賴于其粒子大小，以及粒子表面正電荷與細胞膜表面負電荷之間的相互作用。PD1較PD2而言，其ζ-電位更高，而其平均粒徑更小，因而更利于其傳遞更多的pDNA進入細胞。當2種PD的質量比為1∶1和1∶2時，轉染效率偏低，這可能是因為其表面電荷密度下降，且復合物粒徑偏高導致其進入細胞的效率降低所致。因而選用PH1/pDNA的質量比為2∶1進行下一步實驗。

圖4 pDNA/PEI、PD1和PD2復合物對B16細胞誘導的基因轉染的流式分析圖Fig.4 Flow cytometric analysis of pDNA/PEI，PH1/pDNA and PH2/pDNA induced gene transfection with B16 cells

2.5HPD的DNA包載能力

從HPD復合物平均粒徑及ζ-電位圖 （圖5）中可以看出，隨著質量比的變化，復合物的粒徑趨于穩(wěn)定。質量比為4∶2∶1時，復合物表面ζ-電位接近于0 mV，復合物之間受到的表面電荷的排斥力減小，產(chǎn)生團聚，導致粒徑增大。當質量比調(diào)節(jié)至5∶2∶1時，復合物的粒徑減小至183 nm，ζ-電位減小至-8 mV。當質量比變?yōu)?7∶2∶1時，HPD 復合物粒徑為109 nm，這一尺寸適合復合物粒子進入細胞，而其ζ-電位逐漸降低達到-15 mV，表明PD1已經(jīng)完全被HH包裹。HPD粒子表面呈負電荷，可以減少與血清蛋白吸附，增加材料在體內(nèi)的循環(huán)時間。后續(xù)選用HPD質量比為7∶2∶1進一步測試。

圖5 HPD復合物的平均粒徑及ζ-電位Fig.5 Average size and ζ-potential of HH/PH1/pDNA complexes

HPD復合物的瓊脂糖凝膠電泳實驗結果如圖6。結果顯示，HPD復合物在每個膠孔中均能觀察到明亮的DNA條帶，與裸DNA相比，復合物沒有產(chǎn)生與其同一位置的條帶，說明DNA并未隨HH/PH/pDNA質量比的變化而從復合物內(nèi)部泄漏。這也說明HH的加入并未影響內(nèi)部PD復合物的穩(wěn)定性。這是因為本研究設計中引入的His分子在pH 7.4環(huán)境下表現(xiàn)出疏水性，這使得HH表現(xiàn)出兩親性，當其包裹于PD表面時，His會因為疏水作用而進一步向內(nèi)壓縮PD，不僅能有效避免因電荷競爭而導致DNA泄漏，還能保持復合物的粒徑大小不受影響。

圖6 HPD復合物的瓊脂糖凝膠電泳阻滯實驗譜圖Fig.6 Agarose gel electrophoresis of HPD complexes

2.6 HPD的形貌和血清穩(wěn)定性

采用透射電鏡觀測HPD復合物的形貌 （圖7（a））。從圖中可以看出，復合物為規(guī)整球形，尺寸均一且分布均勻，其在干態(tài)下的平均粒徑約為60 nm。采用DLS測得復合物在水相中的平均粒徑 （圖7（b））為109 nm。這與HPD表面親水性的HH在水介質中處于水合伸展狀態(tài)有關。通過加入體積分數(shù)為10%FBS驗證HPD在含血清溶液中的穩(wěn)定性，結果如圖7（c）所示，100 nm以下為血清中的固有粒子峰，這說明HPD的粒徑分布并未因加入FBS而發(fā)生變化。這是由于HPD復合物表面帶負電，可拮抗同樣帶有負電的血清。因而HPD復合物具有良好的血清穩(wěn)定性，不會與血清蛋白吸附團聚而被代謝清除。

圖7 HPD復合物的透射電鏡圖，溶液中有或無體積分數(shù)為10%血清時HPD復合物粒徑分布Fig.7 TEM image of HPD complexes；size distribution of HPD complexes with and without 10%serum

2.7 HPD的酶穩(wěn)定性

HPD復合物在不同條件下對pDNA的保護能力通過瓊脂糖凝膠電泳進行測試。如圖8所示，與裸DNA相比，加入DNA酶后，質粒被降解產(chǎn)生多條條帶。HPD復合物經(jīng)DNase I處理后，DNA依然處于膠孔中，且未發(fā)現(xiàn)被降解的DNA條帶，這說明HPD不僅能負載DNA，還可有效保護DNA免于被DNA酶降解。而在與HAase作用后，DNA亦保留于膠孔當中，并未在泳道中出現(xiàn)條帶，這說明即使HPD復合物表面的HA被酶降解，PD復合物仍然可保持穩(wěn)定，并包載DNA。綜上，HPD復合物的多層結構穩(wěn)定，可有效包載并且保護DNA。

2.8 細胞毒性

圖8 不同條件下的HPD復合物穩(wěn)定性Fig.8 Agarose gel electrophoresis of HPD complexes treated with various enzymes

通過細胞存活率實驗對材料的細胞相容性進行評價，結果如圖9所示。在圖9（a）中，對于B16細胞，在質量濃度低于20 μg/mL時，PEI與PH1的細胞毒性相差不大，而在質量濃度高于50 μg/mL時，PH1組的細胞存活率則明顯更高，即使質量濃度達到500 μg/mL，PH1組細胞存活率仍可達到46%。而對于COS7細胞，PEI與PH1的細胞毒性在低質量濃度條件下即表現(xiàn)出明顯差異，在200 μg/mL時，PH1組細胞存活率仍可達到40%以上，而這一質量濃度已經(jīng)遠高于轉染實驗時所使用的材料質量濃度。PEI的細胞毒性主要因為高正電荷密度會破壞細胞膜結構，致使細胞破裂而產(chǎn)生。當PEI經(jīng)His修飾后，表面部分正電荷被屏蔽，從而降低了細胞毒性。圖9（b）中可以看出，HH對B16細胞及COS7細胞基本無毒。當HA質量濃度為500 μg/mL時，B16和COS7細胞的存活率依然可達到96%和103%。因此，PH和HH都具有較好的細胞相容性。

圖9 PEI、PH1和HH對B16細胞、COS7細胞的體外細胞毒性Fig.9 In vitro cytotoxicity of PEI and PH1；HH against B16 and COS7 cells

2.9 HPD轉染性能

以pEGFP-N1為報告基因測定HPD復合物的轉染能力，轉染后的熒光圖以及流式細胞分析結果如圖 10 所示。圖 10（a）（I、III）中，PEI在 B16 細胞以及COS7細胞中介導的轉染效率基本相同。從圖10（a）（II、IV）中可以看出，在 B16 腫瘤細胞中出現(xiàn)了明顯的綠色熒光，這說明HPD復合物已經(jīng)成功介導基因轉染，表達出綠色熒光蛋白。與COS7正常細胞相比，B16腫瘤細胞中表達產(chǎn)生的綠色熒光強度明顯更高。此外，B16細胞中HPD介導的細胞轉染與PEI/pDNA介導的細胞轉染相比稍弱，COS7細胞中HPD介導的細胞轉染與PEI介導的細胞轉染則具有明顯差距。該結果與圖10（b）流式細胞儀結果一致，PEI在2種細胞中介導的基因轉染產(chǎn)生的熒光強度基本相當，而HPD介導的在B16細胞中表達的平均熒光強度明顯高于COS7細胞的熒光強度，可達到COS7細胞中熒光強度的2倍。這是由于B16細胞表面過度表達的CD44受體可以與HPD復合物表面的HH特異性識別，能夠增加了腫瘤細胞對HPD復合物的攝取，從而提高轉染效率。因此，HPD復合物對于腫瘤細胞的基因傳遞具有一定的選擇性。

圖10 PEI和HPD復合物對B16細胞、COS7細胞轉染的熒光圖和流式分析圖Fig.10 Fluorescent images and flow cytometric analysis of gene transfection in B16 and COS7 cells

3 結語

通過His修飾獲得了2種具有不同His取代度的PH以及一種HH。其中，His取代度為3.2%的PH1能夠更為有效地包載DNA，形成尺度在103 mm的復合物，并介導高效的基因轉染。之后通過二次復合，得到了HPD復合物，其在水溶液中尺寸均一，平均粒徑為109 nm，ζ-電位為-15 mV，并且能夠有效拮抗血清黏附，在DNase I和HAase存在條件下保持穩(wěn)定，保護所包載的DNA不被酶降解。利用表面的HH與CD44受體的作用，HPD復合物可以對于腫瘤細胞介導高效的基因轉染，對B16腫瘤細胞為COS7正常細胞中轉染效率的2倍，體現(xiàn)出明顯的選擇性，并且材料經(jīng)His修飾后，細胞毒性明顯降低。綜上所述，HPD復合物在基因轉染研究具有較好的應用前景。