咖啡酸對銅綠假單胞菌群體感應(yīng)的抑制及毒力因子降低的研究

于福浩 ， 婁在祥 *， 王洪新 ， 寇興然

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 國家功能食品工程技術(shù)研究中心，江蘇 無錫 214122）

銅綠假單胞菌是臨床上一種常見的條件致病菌，它能引起因生物膜和群體感應(yīng)介導(dǎo)的毒力因子而產(chǎn)生的各種感染，被認(rèn)為是醫(yī)院中的第三大致病菌[1]。銅綠假單胞菌也是食物中的普遍致病菌，經(jīng)常引起食物腐敗和食源性疾病。因為抗生素的過度使用，許多銅綠假單胞菌對抗生素已經(jīng)形成了很高的抗藥性。因此，采用非抗生素、安全的天然化合物取代傳統(tǒng)的藥物，對控制致病菌來說是必要的。

群體感應(yīng)是一種細(xì)胞密度依賴的基因表達(dá)現(xiàn)象。細(xì)菌依賴于擴(kuò)散性的信號分子監(jiān)測周圍同種或異種細(xì)菌的密度，當(dāng)信號分子達(dá)到一定濃度閾值時可調(diào)控特定基因的表達(dá)。革蘭氏陰性菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)中主要有合成酶蛋白和受體蛋白參與，合成酶蛋白分泌N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯（AHL）作為自體誘導(dǎo)物，當(dāng)這種自體誘導(dǎo)物密度積累到閾值時就與轉(zhuǎn)錄受體蛋白結(jié)合，啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[2]。作為一個重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控著一系列細(xì)菌的行為，如生物膜形成，毒力因子分泌，免疫逃逸和抗藥性的產(chǎn)生[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌的生物膜形成和毒力因子分泌都是由群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的[6]，因此，以群體感應(yīng)為靶點研發(fā)群體感應(yīng)抑制劑已成為一種新的趨勢[7-8]。這種新型群體感應(yīng)抑制劑不會抑制細(xì)菌的生長，在降低細(xì)菌致病力的同時不使其產(chǎn)生抗藥性，這對細(xì)菌耐藥性的問題具有極重要的意義[9-11]。

絕大多數(shù)傳統(tǒng)的群體感應(yīng)抑制劑（如鹵代呋喃酮等）被發(fā)現(xiàn)有毒害作用[12-13]。相反，從可食植物中篩選安全、無毒的活性成分作為群體感應(yīng)抑制劑來干擾群體感應(yīng)系統(tǒng)已經(jīng)引起了越來越多的關(guān)注。咖啡酸普遍存在于植物中，主要來自檸檬皮、毛莨科植物升麻屬根莖、纈草屬植物根等。因此，本實驗選用廣泛存在于植物中的咖啡酸作為群體感應(yīng)抑制劑，研究其對銅綠假單胞菌群體感應(yīng)的抑制作用及抑制毒力因子分泌和生物膜形成的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

咖啡酸（≥98%），購于西安小草植物科技有限責(zé)任公司;銅綠假單胞菌CMCC（B）10104，購于中國微生物菌種保藏中心 （中國，北京）;菌種Choromobacterium violaceum（CV026）,購于西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 最小抑菌質(zhì)量濃度MIC的測定

采用二倍稀釋法測定咖啡酸對紫色色桿菌和銅綠假單胞菌的MIC。將配置好的LB培養(yǎng)液（牛肉膏 10 g，胰蛋白胨 5 g，氯化鈉 10 g，水 1000 mL，調(diào)整pH為7.2）分裝到各個試管中，每管1 mL。向第1管中加入1 mL藥物原液，混勻后取出1 mL依次加到下一管中，最后一管棄掉1 mL，形成咖啡酸一系列濃度，最后向試管中加入10 μL活化好的菌液。陽性對照不加藥物，陰性對照組不加菌液。37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長情況，以抑制細(xì)菌生長所含的最低藥物質(zhì)量濃度為最小抑菌質(zhì)量濃度MIC。

1.3 咖啡酸對細(xì)菌生長的影響

將紫色色桿菌于LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，將已活化好的菌種分別接種于新鮮的LB培養(yǎng)液中，加入適量的咖啡酸，使咖啡酸的終質(zhì)量濃度分別為0.200、0.100、0.050、0.025 mg/mL， 對照組不添加藥物。實驗組和對照組菌液的起始OD600為0.05，37℃振蕩培養(yǎng)24 h，每隔2 h分別取樣測OD600。

1.4 對群體感應(yīng)活性的影響

1.4.1 指示菌平板法定性檢測咖啡酸的群體感應(yīng)活性 咖啡酸對群體感應(yīng)的抑制效果用群體感應(yīng)指示菌C.violaceum測定，并做適當(dāng)?shù)男薷腫8]。將群體感應(yīng)指示菌C.violaceum活化后按2%的接種量（體積分?jǐn)?shù)）接種到新鮮LB培養(yǎng)液中，恒溫振蕩培養(yǎng)至OD600為1.0。LB瓊脂固體培養(yǎng)基融化后待冷卻至50℃，將對數(shù)期的菌液緩緩加入，輕輕混勻后倒平板。凝固后將20 μL濃度為40 μmol/L的信號分子C6-HSL涂布于平板表面，用濾紙片法檢測，每個濾紙片（直徑6 mm）上分別滴加10 μL不同質(zhì)量濃度的咖啡酸，37℃培養(yǎng)24 h，觀察紙片周圍無色圈的直徑。

1.4.2 定量檢測咖啡酸的群體感應(yīng)活性 咖啡酸對紫色桿菌素產(chǎn)量的影響根據(jù)已報道的方法測定，并做適當(dāng)?shù)男薷腫14-15]。將100 μL處于生長對數(shù)期的C.violaceum接種到4 mL含有信號分子C6-HSL的新鮮LB培養(yǎng)液中，同時添加不同質(zhì)量濃度的咖啡酸，對照組不添加咖啡酸。37℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后，取1 mL于離心管中，13000 r/min離心10 min，棄掉上清液，沉淀加入500 μL DMSO使紫色桿菌素溶解出來，再在13000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，上清液中則含有紫色桿菌素，取上清液測其OD585。

1.5 對群體感應(yīng)調(diào)控的生物膜的影響

1.5.1 結(jié)晶紫染色法測定咖啡酸對生物膜抑制作用的影響 將銅綠假單胞菌于LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)。取50 μL菌液接于含1 mL LB培養(yǎng)液的24孔板中，同時加入不同濃度的咖啡酸，使其終質(zhì)量濃度為 0.4，0.2，0.1，0.05 mg/mL， 對照組不添加藥物，37℃恒溫靜置培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)完吸出孔中液體，每孔加入1 mL的無菌PBS緩沖液清洗板孔3次，待干燥后每孔加1 mL 1 g/dL的結(jié)晶紫染色5 min，吸出結(jié)晶紫染液，用流水洗掉多余染料，靜置干燥完全，之后每孔加1 mL 95%的乙醇，37℃烘箱中作用30 min以溶解結(jié)晶紫，570 nm 處測其吸光值[5，16]。

1.5.2 激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜 將銅綠假單胞菌于LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)。按取500 μL菌液接入10 mL新鮮LB培養(yǎng)液中，加入不同質(zhì)量濃度的咖啡酸，使其終質(zhì)量濃度為0.40、0.20、0.10、0.05 mg/mL，同時將滅過菌的蓋玻片作為粘附載體放入培養(yǎng)皿中，對照組不添加藥物，37℃恒溫靜置培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)結(jié)束后將蓋玻片從培養(yǎng)皿中取出，用去離子水輕輕洗滌，除去表面的游離細(xì)菌，將蓋玻片放入已配好的染色劑（SYTO9和PI）中避光染色30 min，后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察生物膜的形成情況[17]。

1.6 對群體感應(yīng)調(diào)控的毒力因子產(chǎn)量的影響

將銅綠假單胞菌于LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)。將活化好的菌種接于新鮮LB培養(yǎng)液中，同時加入不同質(zhì)量濃度的咖啡酸，使其終質(zhì)量濃度為0.40、0.20、0.10、0.05 mg/mL，對照組不添加藥物（只含培養(yǎng)基和菌液），37℃振蕩培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后的菌液經(jīng)不同處理測其對綠膿菌素和鼠李糖產(chǎn)量的影響。

1.6.1 對綠膿菌素產(chǎn)量的影響 培養(yǎng)后的菌液經(jīng)離心，取5 mL上清液于15 mL離心管中，加入3 mL氯仿充分振蕩以使兩者充分混勻，靜置后將氯仿層轉(zhuǎn)入干凈的EP管中，加入1 mL 0.2 mol/L的鹽酸充分振搖，靜置分層后取上層含有綠膿菌素的粉紅色有機(jī)相測其OD520[18]。

1.6.2 對鼠李糖脂產(chǎn)量的影響 首先制作出鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品的梯度質(zhì)量濃度溶液：0、50、100、200、300、400、500 μg/mL。 取 1 mL 鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品加入到已配好的0.19 g/dL的苔黑酚—濃硫酸溶液中，定容至10 mL。80℃下水浴半小時后取出置室溫保持15 min，測其在421 nm處的OD值，并制作鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，1 mg鼠李糖相當(dāng)于2.5 mg鼠李糖脂。

培養(yǎng)后的菌液經(jīng)6000 r/min離心10 min，除去菌體，過濾后取上清液用濃鹽酸調(diào)至pH為2，取1 mL加入3倍體積的乙酸乙酯萃取2次，將乙酸乙酯層混勻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，最后加入1 mL的去離子水溶解。取1 mL按上述步驟測其在421 nm處的吸光值[19-21]。

1.6.3 對游動能力的影響 游動能力的測定采用的是雙層平板法[22-23]。在平板底層倒入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂的LB瓊脂培養(yǎng)基，上層倒入含咖啡酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%瓊脂的軟瓊脂培養(yǎng)基，咖啡酸的終質(zhì)量濃度為 0.40、0.20、0.10、0.05 mg/mL，對照組不添加藥物。在平板的中央接種2 μL的已活化好的菌液，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察致病菌形成的浮游圈大小。

1.7 對信號分子的抑制作用

將銅綠假單胞菌于LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)。將活化好的菌液加到6 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，同時加入不同質(zhì)量濃度的咖啡酸，使其終質(zhì)量濃度為0.40、0.20、0.10、0.05 mg/mL，對照組不添加藥物（只含培養(yǎng)基和菌液），37℃振蕩培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后將培養(yǎng)液6000 r/min離心10 min，取上清液用等量含0.02 mol/L冰乙酸的乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相。將上述得到的乙酸乙酯提取液在旋蒸儀內(nèi)旋轉(zhuǎn)蒸干，后用體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇水溶液將其溶解，經(jīng)0.22 μm膜過濾，采用超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜定性定量分析群體感應(yīng)信號分子[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 最小抑菌濃度的測定結(jié)果

通過試管中細(xì)菌的生長情況判斷藥物對細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC）。觀察陽性對照組明顯渾濁，陰性對照組澄清，所以，未見試管渾濁的最低藥物質(zhì)量濃度即為最小抑菌質(zhì)量濃度。如表1所示，咖啡酸對紫色色桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL，對銅綠假單胞菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL。

表1 咖啡酸對細(xì)菌的MICTable 1 MIC of caffeic acid on bacteria

2.2 咖啡酸對細(xì)菌生長的影響

為了研究咖啡酸對群體感應(yīng)的抑制作用及對其調(diào)控的毒力因子的產(chǎn)生量的影響，實驗應(yīng)在亞抑菌質(zhì)量濃度下進(jìn)行?？Х人釋ψ仙珬U菌的MIC為0.4 mg/mL，因此實驗采用最小抑菌質(zhì)量濃度以下的4個質(zhì)量濃度梯度，驗證在此質(zhì)量濃度下對紫色色桿菌的生長是否會產(chǎn)生影響，實驗結(jié)果如圖1。從圖中結(jié)果可以看出，在亞抑菌質(zhì)量濃度下，咖啡酸對紫色色桿菌的生長幾乎無明顯影響。因此，接下來的實驗可在亞抑菌質(zhì)量濃度下進(jìn)行。

2.3 咖啡酸的群體感應(yīng)活性結(jié)果

群體感應(yīng)的定性實驗中，濾紙片周圍無色圈的大小代表了咖啡酸抑制群體感應(yīng)能力的強(qiáng)弱。從圖2可以看出，含咖啡酸的濾紙片周圍的紫色素的產(chǎn)量明顯低于不加藥物的濾紙片，且不影響細(xì)菌的生長。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時，咖啡酸濾紙片周圍無色圈的大小達(dá)到了1.32 cm，表明咖啡酸有抑制紫色色桿菌群體感應(yīng)的能力。

圖1 紫色色桿菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of C.violaceum

圖2 咖啡酸對紫色色桿菌群體感應(yīng)的定性實驗Fig.2 Qualitative QS inhibition assay of caffeic acid

由于紫色色桿菌其紫色素的產(chǎn)生是其群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的，因此檢測紫色桿菌素的產(chǎn)量可以確定藥物對細(xì)菌群體感應(yīng)的作用。群體感應(yīng)的定量實驗結(jié)果如圖3，表明咖啡酸明顯的抑制了紫色桿菌其紫色桿菌素的產(chǎn)量，抑制能力呈質(zhì)量濃度依賴性。隨著質(zhì)量濃度的增大，咖啡酸對紫色桿菌素的抑制率從17.9%增加到61.1%，在質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時，抑制率最大為61.1%。

圖3 定量檢測咖啡酸對紫色色桿菌群體感應(yīng)的抑制作用Fig.3 Inhibition effectofcaffeic acid on violaceinproduction in C.violaceum by quantitative assay

2.4 咖啡酸對生物膜的抑制作用結(jié)果

細(xì)菌生物膜對其產(chǎn)生抗藥性具有重要作用。經(jīng)培養(yǎng)后，24孔板內(nèi)壁上形成了一圈薄膜，用結(jié)晶紫染色后可通過吸光值的大小反映生物膜的形成量。如圖4所示，在亞抑菌質(zhì)量濃度下，隨著咖啡酸質(zhì)量濃度的增加，生物膜的形成量顯著減少。且在質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL即1/2 MIC時，對生物膜的抑制率達(dá)到最大，為65.3%。說明咖啡酸能不同程度的抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成。

圖4 咖啡酸對銅綠假單胞菌生物膜的影響Fig.4 Effect of caffeic acid on biofilm in P.aeruginosa

用激光共聚焦觀察銅綠假單胞菌生物膜的形成情況。對比不同質(zhì)量濃度的咖啡酸對生物膜形成的影響，結(jié)果如圖5所示。加入咖啡酸后銅綠假單胞菌形成生物膜的能力顯著降低，且隨著咖啡酸質(zhì)量濃度的增加，抑制效果明顯增強(qiáng)。在不添加藥物的對照組中，銅綠假單胞菌形成的生物膜很致密，顏色很亮，在添加質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL咖啡酸的實驗組中，菌體密度變得較疏松，亮度也減弱，在添加質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL咖啡酸的實驗組中，效果更明顯。

銅綠假單胞菌的生物膜無處不在，它是細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的最重要的原因，生物膜是高度結(jié)構(gòu)化的片狀復(fù)合物，絕大多數(shù)細(xì)菌在適宜的條件下都能形成生物膜。生物膜的形成顯著增加了膜內(nèi)細(xì)菌對抗生素的耐藥性，這對人體健康造成了嚴(yán)重的傷害。Sandasi等[25]報道出藥草、香料和重要藥用植物中提取物能減少初始細(xì)胞粘附。Zeng等[26]研究表明黃芩素，另一個天然黃酮醇，是一種能對銅綠假單胞菌生物膜產(chǎn)生劑量依賴性抑制作用的群體感應(yīng)抑制劑。本實驗也得出咖啡酸能不同程度的抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，對抑制細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生提供了一定的理論依據(jù)。

圖5 激光共聚焦觀察咖啡酸對銅綠假單胞菌生物膜的抑制作用Fig.5 Confocal Laser Scanning Microscopy （CLSM）analysis：the inhibition of caffeic acid on biofilm formation of P.aeruginosa

2.5 咖啡酸對毒力因子的抑制作用結(jié)果

2.5.1 對綠膿菌素的抑制結(jié)果 綠膿菌素是銅綠假單胞菌的重要毒力因子之一，反映菌株的毒力大小，它涉及到正常鐵離子的轉(zhuǎn)運及多種細(xì)胞的功能，過量的綠膿菌素會導(dǎo)致細(xì)胞死亡?？Х人釋︺~綠假單胞菌的綠膿菌素產(chǎn)量的抑制結(jié)果如圖6所示。在亞抑菌質(zhì)量濃度下，隨著咖啡酸質(zhì)量濃度的增加，綠膿菌素的產(chǎn)量明顯減少?？Х人嵩谫|(zhì)量濃度為0.05 mg/mL即1/16 MIC時，對綠膿菌素的抑制率達(dá)到了14.7%；在質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL即1/2 MIC時，對綠膿菌素的抑制率高達(dá)66.4%，而對銅綠假單胞菌的生長無影響。說明咖啡酸抑制了群體感應(yīng)調(diào)控的綠膿菌素的產(chǎn)生。

圖6 咖啡酸對銅綠假單胞菌綠膿菌素的影響Fig.6 Effect of caffeic acid on pyocyanin in P.aeruginosa

2.5.2 對鼠李糖脂的抑制結(jié)果 鼠李糖脂作為生物表面活性劑，可以增強(qiáng)細(xì)菌間的交流進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)菌的致病力，是銅綠假單胞菌群體感應(yīng)調(diào)控的另一毒力因子。經(jīng)咖啡酸作用的銅綠假單胞菌其鼠李糖脂含量減少。如圖7所示，當(dāng)咖啡酸質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時，鼠李糖脂的抑制率可達(dá)31.8%。表明咖啡酸對鼠李糖脂起到了一定的抑制作用。

圖7 咖啡酸對銅綠假單胞菌鼠李糖脂的影響Fig.7 Effect of caffeic acid on rhamnolipid in P.aeruginosa

2.5.3 對游動能力的抑制結(jié)果 由鞭毛調(diào)節(jié)的細(xì)菌游動能力和生物膜的形成緊緊相關(guān)，生物膜的黏附過程是通過鞭毛運動開始的。由圖8可以看出，未加藥物的對照組，銅綠假單胞菌的游動能力良好，在加入咖啡酸的實驗組中，細(xì)菌不能充分的擴(kuò)散開，圍繞接種位置形成菌圈，且隨著質(zhì)量濃度的增加，對游動能力的抑制作用增強(qiáng)。藥物質(zhì)量濃度均小于MIC，因此咖啡酸對細(xì)菌的生長無抑制，表明咖啡酸對細(xì)菌鞭毛的抑制導(dǎo)致了游動能力的減弱。

2.6 對信號分子的抑制

用HPLC-MS對銅綠假單胞菌的信號分子進(jìn)行分析。在亞抑菌質(zhì)量濃度下，即咖啡酸質(zhì)量濃度低于0.8 mg/mL時，銅綠假單胞菌的生長幾乎不受影響。因此，培養(yǎng)后經(jīng)HPLC-MS檢測發(fā)現(xiàn)，咖啡酸處理過的銅綠假單胞菌其信號分子的量與對照組相比都有不同程度的降低。且隨著咖啡酸質(zhì)量濃度的增加，信號分子的產(chǎn)量也降低。如圖9所示，當(dāng)咖啡酸質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時，對C4-HSL，C6-HSL，C8-HSL和3-oxo-C12-HSL的抑制率分別為59.6%，49.2%，53.9%，52.2%。當(dāng)咖啡酸在質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL時，對C4-HSL的抑制率也達(dá)到了22.7%。C4-HSL信號分子調(diào)控著綠膿菌素和鼠李糖脂這2個毒力因子的產(chǎn)生，由于信號分子降低趨勢同毒力因子的降低趨勢一致，且信號分子是由信號分子合成酶合成，因此可推測藥物通過抑制信號分子合成酶的分泌來抑制細(xì)菌毒力因子的產(chǎn)生，從而降低細(xì)菌毒力[27]。

圖8 咖啡酸對銅綠假單胞菌游動能力的抑制作用Fig.8 Inhibition effect of caffeic acid on swarming motility of P.aeruginosa

圖9 咖啡酸對銅綠假單胞菌信號分子的抑制作用Fig.9 Effect of caffeic acid on AHLs production in P.aeruginosa

3 結(jié) 語

研究了咖啡酸對銅綠假單胞菌群體感應(yīng)及其調(diào)控的毒力因子和生物膜的抑制作用，發(fā)現(xiàn)其能顯著抑制生物膜的形成，對毒力因子包括綠膿菌素、鼠李糖脂、游動能力等有顯著的作用，也明顯地抑制了群體感應(yīng)信號分子的產(chǎn)量，推測其抑制機(jī)制可能是咖啡酸通過抑制信號分子合成酶的活性，進(jìn)而抑制信號分子的合成?？Х人嶂饕獊碓从谥参镏校覍θ后w感應(yīng)具有良好的抑制效果。因此，咖啡酸作為一種安全、無毒害具有抑制群體感應(yīng)潛能的天然化合物，在降低細(xì)菌致病力及細(xì)菌抗藥性方面有很強(qiáng)的應(yīng)用價值。