氨氮對異育銀鯽‘中科3號’幼魚急性毒性及肝臟抗氧化酶系統(tǒng)的影響

薛凌展　吳素瓊　張坤　樊海平　陳斌　田田　林旋

摘要：旨在研究氨氮對異育銀鯽‘中科3號’的毒理作用，為生產提供可參考的理論依據(jù)。采用水生生物毒性方法，在室內靜水條件下，開展氨氮對異育銀鯽‘中科3號’幼魚的急性毒性試驗，并檢測各組幼魚肝臟組織中過氧化氫酶（CAT）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）和丙二醛（MDA）的變化情況。結果顯示：異育銀鯽‘中科3號’幼魚經氨氮脅迫后，其24、48、96h的總氨氮半致死濃度分別為276.51mg/L、190.62mg/L和148.62mg/L，非離子氨半致死濃度分別為2.52mg/L、1.74mg/L、和1.36mg/L;總氨氮安全濃度為14.87mg/L，非離子氨安全濃度為0.14mg/L。在氨氮脅迫下肝臟組織中MDA含量上升，比對照組提高了26.20%、18.68%和17.08%;而CAT和T-SOD活性則均顯現(xiàn)先激活后抑制的趨勢，高濃度、長時間氨氮脅迫對幼魚肝臟抗氧化酶活性影響較大，導致機體抗氧化能力的減弱。研究結果表明，異育銀鯽‘中科3號’對氨氮的耐受性高于青魚、草魚、鰱魚和鯉魚等其他常見大宗魚類，但是氨氮急性脅迫破壞了幼魚肝臟抗氧化系統(tǒng)，長期處于氨氮脅迫下將不利于幼魚健康生長。

關鍵詞：異育銀鯽魚‘中科3號’;氨氮;急性毒性;肝臟;抗氧化酶

中圖分類號：S917.4 ???文獻標志碼：A ???論文編號：cjasl8070019

Ammonia Nitrogen： Effects on Acute Toxicity and Antioxidant Enzymes System in

Liver of Juvenile of Allogynogenetic gibel carp ‘CAS Ⅲ’

Xue Lingzhan1， Wu Suqiong2， Zhang Kun3， Fan Haiping1， Chen Bin1， Tian Tian1， Lin Xuan2

（1Freshwater Fisheries Research Institute of Fujian Province， Fuzhou 350002， Fujian， China; 2College of Animal Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， Fujian， China; 3Fujian Tianma Science and Technology Group Co.， Ltd， Fuzhou 350308， Fujian， China）

Abstract： The study aims at the toxicological effect of ammonia nitrogen on Allogeneic crucian carp ‘CAS Ⅲ’. The aquatic organism toxicity method was used under hydrostatic condition indoor. The acute toxicity test of ammonia nitrogen on juvenile of Allogynogenetic gibel carp ‘CAS Ⅲ’ was conducted， and the changes of?catalase （CAT）， total superoxide dismutase （T-SOD） and malondialdehyde （MDA） in liver tissues were tested. The results showed that after ammonia nitrogen stress， the median lethal concentration （LC50） of total ammonia?nitrogen was 276.51mg/L at 24h， 190.62mg/L at 48h and 148.62mg/L at 96h， and the LC50 of un-ionized ammonia was 2.52mg/L at 24h， 1.74 mg/L at 48 h， and 1.36 mg/L at 96 h. The safe concentration of total ammonia nitrogen and un-ionized ammonia was 14.87 mg/L and 0.14 mg/L， respectively， for juvenile. Under ammonia nitrogen stress， the content of MDA in the liver increased by 26.20%， 18.68% and 17.08% compare?with the control （P<0.05）， but CAT and T- SOD appeared to be activated at first and then inhibited， and antioxidase was induced more significantly at relatively higher concentration of ammonia nitrogen and long time?exposure， and it weakened the antioxidant capacity of the body. The results reveal that ammonia tolerance of Allogynogenetic gibel carp?‘CAS Ⅲ’ is higher than that of Mylopharyngodon piceus， Ctenopharyngodon idellus，?Hypophthalmichthys molitrix （Valenciennes， 1844）， Cyprinus carpio Linnaeus， and other conventional?freshwater fish. However， acute ammonia nitrogen stress damaged the liver antioxidant system and it is harmful?to the health and growth of juvenile fish.

Keywords： Juvenile of Allogynogenetic gibel carp ‘CAS Ⅲ’; Ammonia Nitrogen; Acute Toxicity; Liver; Antioxidase

0 ?引言

中國的鯽魚分為普通鯽魚（Carassius auratus）和黒鯽（Carassius carassius）兩個種以及銀鯽（Carassius?gibelio）一個亞種[1-2]，屬雜食性底層魚類，全國各地水域常年均可養(yǎng)殖，2016年全國產量達到300萬t[3]，是中國養(yǎng)殖的重要淡水魚之一。20世紀80年代中國發(fā)現(xiàn)銀鯽異精雌核發(fā)育生殖方式，用興國紅鯉作為異源精子刺激銀鯽卵子雌核發(fā)育產生全雌性后代，誕生了第一代異育銀鯽，其突出的生長性能使得該品種被廣泛養(yǎng)殖。進入90年代，科研人員采用血清蛋白的電泳表型在方正銀鯽群體中區(qū)分出4個不同雌核發(fā)育克隆系，經多年生長對比養(yǎng)殖試驗發(fā)現(xiàn)克隆系間存在明顯的生長差異，進而選育出高體型異育銀鯽，即為第二代異育銀鯽，進一步奠定了鯽魚品種中的主導地位，養(yǎng)殖效益突出，市場接受度較高。進入21世紀，新的核質雜交克隆技術被用于異育銀鯽育種，科研人員利用A系銀鯽的精子在D系銀鯽的卵質中雄核發(fā)育產生全新的異育銀鯽品種[4-5]，定名為異育銀鯽‘中科3號’（Allogynogenetic gibel carp ‘CAS Ⅲ’），并于2008年獲得全國水產原種和良種審定委員會頒發(fā)的水產新品種證書（品種登記號：GS01-002-2007）[6]。該品種是由中國科，學院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室桂建芳院士團隊精心選育的異育銀鯽新品種，也是國家大宗淡水魚產業(yè)技術體系近年重點推廣的品種之一。該品種具有生長速度快、出肉率高、不易脫鱗、遺傳性狀穩(wěn)定、肝臟碘泡蟲發(fā)病率低和養(yǎng)殖經濟效益高等特點深受漁民的喜愛。2011年福建省淡水水產研究所將異育銀鯽‘中科3號’引入福建省進行養(yǎng)殖示范，經過6年的養(yǎng)殖推廣，因其生長速度、抗病力及體型等生物性狀優(yōu)勢明顯，與同類品種相比養(yǎng)殖效益有了明顯的提高，獲得養(yǎng)殖戶的一致認可，在福建地區(qū)的養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴大。

養(yǎng)殖水體中氮化合物分為有機氮和無機氮兩類，其中有機氮主要由氨基酸、蛋白質、核酸和腐殖酸等有機物中的氮組成，而無機氮主要包括銨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮等。氨氮作為水體中無機氮的主要存在形式也是水產養(yǎng)殖過程中重點控制的水質指標，在水體中主要以非離子氨和離子氨的形式存在。《2014年中國環(huán)境狀況公報》顯示，中國廢水中氨氮排放量達到238.5t，被列為廢水中的第二大污染物[7]，對人和水生動物健康帶來威脅[8]。隨著集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，養(yǎng)殖密度逐漸提高、投餌量增加、殘餌和排泄物大量積累，養(yǎng)殖水體中產生大量氨氮，進而影響魚類生長和攝食。國外關于氨氮對水生動物的生理生化研究的報道較多，如IP[9]研究了氨氮對甲魚（Pelodiscus sinensis）的急性毒性及解毒機理，Wicks等[10]研究了喂食和禁食條件下氨氮對鮭魚（Oncorhynchus mykiss）的毒性特點，REDDY等[11]研究了南非鮑魚（Haliotismidae）對氨氮的耐受性，Wee等[12]解剖分析了在氨氮半致死濃度暴露下，鲇魚（Clarias gariepinus）腦中氨氮和谷氨酸鹽的含量變化情況等。氨氮對魚類毒理研究在國內的報道也不少，例如氨氮誘發(fā)魚類鰓、肝、腎等組織結構變化的研究[13-14]，氨氮影響機體免疫系統(tǒng)[15-16]和血液生化指標等研究[17-18]。SOD和CAT是機體內重要的抗氧化酶，機體受逆境脅迫時，SOD將自由基轉化為HO2O2，然后再由CAT將H2O2分解成氧和水，從而使機體免于遭受H2O2的毒害[19-20]。SOD和CAT兩種酶形成一個抗氧化鏈條保護機體，二者普遍存在于各個組織中，其中肝臟細胞中含量最高。通過檢測魚類肝臟中的T-SOD和CAT活性，可作為魚類氨氮急性毒性效應的評價指標。MDA是機體生物膜遭受自由基攻擊后，其膜脂過氧化反應的重要產物之一[20]。通過檢測MDA含量的變化情況，可以間接反應機體生物膜系統(tǒng)受損程度以及生物體的抗逆性。

目前針對異育銀鯽‘中科3號’的研究主要集中在胚胎發(fā)育[21]、苗種繁育[22]、養(yǎng)殖模式[23]和病害防治[24]等領域，而水質指標氨氮對異育銀鯽‘中科3號’的毒理研究尚未見報道。由于異育銀鯽‘中科3號’在集約化養(yǎng)殖過程中有機氮不斷積累，在微生物分解下非離子氨濃度逐漸升高，常常造成魚體急性或亞急性中毒現(xiàn)象，嚴重制約著該品種單位面積產量和肉質品質的提升，影響產業(yè)的健康發(fā)展。本研究以異育銀鯽‘中科3號’幼魚為研究對象，開展氨氮對其急性毒性試驗，旨在綜合分析氨氮對該品種的毒理作用，為深入研究異育銀鯽‘中科3號’氨氮中毒問題奠定基礎，并為苗種生產提供理論參考依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 試驗用魚

異育銀鯽‘中科3號’幼魚由福建省順昌縣兆興魚種養(yǎng)殖有限公司提供，當年的夏花苗，規(guī)格均勻，體質健壯，體表完好，鏡檢無寄生蟲等疾病，平均體重為（0.69±0.18）g，平均全長為（3.76±0.29）cm。試驗前，將魚苗于試驗容器中暫養(yǎng)2周，每天投喂人工配合飼料2次，連續(xù)充氣，早晚換水1次，換水量為50%，停止喂食24h后用于實驗。

1.2 試驗試劑

所用NH4Cl為分析純，現(xiàn)配成母液后按比例稀釋。過氧化氫酶（CAT）測試盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒、蛋白定量測試盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 試驗方法

1.3.1 急性毒性試驗 依照水生生物毒性方法[25]，試驗容器為8L圓形塑料容器，各試驗組隨機放入7尾魚苗。預試驗得到24h的100%死亡濃度（LC100，24h）和96h的0%死亡濃度（LC0.96h）后確定試驗濃度，按等對數(shù)間距設立濃度組，每個濃度組設3個平行組，不添加NH4Cl為空白對照。試驗分組及濃度設置詳見表1。試驗期間不投餌、不充氣，每隔24h更換1次試驗溶液。試驗用水為曝氣24h以上的地下水，水溫為（25.5±1）℃，pH7.2±0.1。觀察記錄24、48、96h的死亡數(shù)，并及時撈出死亡的魚苗。

1.3.2 肝臟樣品制備 取得氨氮對異育銀鯽‘中科3號’幼魚的24hLC50、48hLC50和96hLC50后，按24hLC50、48hLC50和96hLC50濃度分A、B、C組（見表2），每個濃度設3個平行組，不添加NH4Cl為空白對照。每組隨機放入15尾魚苗，試驗條件同1.3.1。依次在24、48、96h取活魚的肝臟樣品，用生理鹽水潤洗，濾紙吸干水分后稱量肝組織質量，按重量體積比制成10%的組織勻漿：冰水浴條件下機械勻漿，2500r/min，離心10min，取上清液待用。

1.3.3 酶活性測定 肝臟過氧化氫酶、總超氧化物歧化酶、丙二醛和蛋白含量測定均按試劑盒說明書進行操作。

1.4 數(shù)據(jù)處理

急性試驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行Probit回歸分析[26]，獲得半數(shù)致死劑量（LC50）。

安全劑量（SC）=96hLC50×0.1（1）

式中：96hLC50為96h試驗動物半數(shù)致死劑量。

非離子氨計算采用公式（2）[27]。

[NH3]=[NH4++NH3]/[10（pKa-pH）+1]（2）

pKa-0.09018+2729.92/r（3）

其中，T=273+t，t為試驗水溫;pKa為離解常數(shù)，T為熱力學溫度。

對所有試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（one-wayANOVA），并對分析結果進行多重比較。數(shù)據(jù)分析和圖表制作分別采用Microsoft Excel 2003、SPSS 19.0和Graphpad prism 6.0完成，結果以平均數(shù)±標準差

（mean±SD）表示。

2 ?結果與分析

2.1 中毒癥狀

隨脅迫氨氮濃度提高和時間延長，異育銀鯽‘中科3號’幼魚對氨氮的急性毒性癥狀主要表現(xiàn)為在水面或沿著容器水面急游，對震動等刺激反應劇烈;隨著脅迫時間的延長和體力消耗，游動速度逐漸減慢，對外界刺激反應變遲鈍;隨后喪失游動平衡能力，時而旋轉抽搐，時而側躺桶底和間隙竄游，體色變淺;最后沉底不動，死亡時鰓蓋微張，體色發(fā)白。

2.2 急性毒性試驗

氨氮對異育銀鯽‘中科3號’幼魚的急性毒性結果見表3和表4。經24h氨氮脅迫后，只有392.5mg/L、351.67mg/L和315.08mg/L的死亡率高于50%，其中392.5mg/L幼魚反應激烈，死亡率達到100%，其余8組的死亡率均低于50%，且162.99mg/L和146.03mg/L均未出現(xiàn)死亡個體，總氨氮24h半數(shù)致死濃度為277.12mg/L，非離子氨24h半致死濃度為2.53mg/L。當脅迫時間達到48h，有7組的死亡率高于50%，其中有392.50mg/L、351.67mg/L、315.08mg/L和282.30mg/L試驗魚全部死亡，其余4組的死亡率仍低于50%，總氨氮48h半數(shù)致死濃度為190.60mg/L，比24h時降低了31.22%，非離子氨48h半致死濃度為1.74mg/L，比24h時降低了31.23%。當脅迫時間達到96h時試驗結束，此時共有9組死亡率高于50%，其中6組死亡率達到100%，146.03mg/L和130.84mg/L的死亡率低于50%。130.84mg/L在試驗過程中均未出現(xiàn)死亡個體，試驗結果與對照組一致，總氨氮96h半數(shù)致死濃度為158.04mg/L，分別比24h和48h時降低了42.97%和17.08%，非離子氨96h半數(shù)致死濃度為1.44mg/L，比24h和48h時降低了43.08%和20.83%。總氨氮安全濃度為15.80mg/L，非離子氨安全濃度為0.14mg/L。

2.3 肝臟抗氧化酶活性

氨氮對異育銀鯽‘中科3號’幼魚急性脅迫對肝臟抗氧化性的影響見圖1、圖2和圖3。經氨氮脅迫后，異育銀鯽‘中科3號’幼魚肝組織中的CAT活性比對照組明顯提高，且隨著脅迫時間的延長，CAT活性呈現(xiàn)出先升后降的趨勢（見圖1）。脅迫24h和48h的CAT活性顯著高于對照組（P<0.05），48h達到最高，顯著高于其他組（P<0.05），比對照組提高了86.12%;脅迫時間延長至96h時CAT活性有所下降，與對照組差異不顯著（P>0.05）。氨氮脅迫導致異育銀鯽‘中科3號’幼魚肝組織T-SOD的變化與CAT相似（見圖2），脅迫氨氮24h，T-SOD活性明顯升高，與對照組相比差異顯著（P<0.05），隨著脅迫時間的延長，T-SOD活性出現(xiàn)緩慢下降，48h的T-SOD活性比24h下降了5.00%，仍顯著高于對照組（P<0.05）;當脅迫時間延長至96h時，T-SOD活性進一步下降，比24h時下降了10.14%，僅略高于對照組，差異不顯著（P>0.05）。氨氮脅迫異育銀鯽‘中科3號’幼魚肝組織MDA含量出現(xiàn)了顯著提高（見圖3），24、48、96h比對照組分別提高了26.20%、18.68%和17.08%，差異顯著（P<0.05）。隨著氨氮脅迫異育銀鯽‘中科3號’幼魚時間的延長，肝臟總MDA含量出現(xiàn)了下降的趨勢，但是差異不顯著（P>0.05）。

3 ?討論

3.1 氨氮對魚類抗氧化功能的影響

肝臟抗氧化酶活性檢測結果顯示，氨氮低濃度短時脅迫，肝臟組織中T-SOD和CAT活性被激活;而氨氮高濃度長時間脅迫試驗中T-SOD和CAT活性受抑制，即異育銀鯽‘中科3號’幼魚肝臟的T-SOD和CAT活性出現(xiàn)先升后降的變化趨勢。該試驗結果與韓春艷[16]、強俊[28]和姜會民[29]等氨氮對奧尼羅非魚、黃河鯉的毒性影響相似。氨氮早期脅迫效應產生大量的自由基，誘導肝臟細胞中的T-SOD和CAT活性增加，出現(xiàn)氧化應激現(xiàn)象，抵御自由基的侵襲;隨著氨氮脅迫時間和濃度的延長和提高，超出了機體的耐受性，抗氧化系統(tǒng)崩潰，氧化應激反應減弱，抗氧化酶活性也相繼降低。不同氨氮濃度和脅迫時間下，異育銀鯽‘中科3號’幼魚肝臟組織中的MDA含量均顯著高于對照組（P<0.05），這是因為異育銀鯽‘中科3號’幼魚在氨氮脅迫下，肝臟細胞生物膜系統(tǒng)發(fā)生一系列氧化應激，脂質過氧化反應形成大量的丙二醛（MDA）在細胞內聚集。MDA可損傷機體細胞，進一步影響抗氧化反應。氨氮脅迫對異育銀鯽‘中科3號’幼魚肝臟的T-SOD和CAT活性及MDA含量影響顯著，反映了氨氮脅迫對幼魚肝臟抗氧化系統(tǒng)損傷嚴重，這是氨氮脅迫對異育銀鯽‘中科3號’幼魚的主要毒理效應。

3.2 氨氮對魚類的毒性

氨氮對異育銀鯽‘中科3號’幼魚的急性毒性與氨氮濃度和脅迫時間呈線性關系，隨氨氮濃度提升幼魚死亡率急劇上升，死亡時間縮短;同樣，當脅迫時間延長時，氨氮毒性效應加強，致死濃度下降。

氨氮對魚類急性毒性的研究較多，鰱魚[Hypophthalmichthys molitrix （Valenciennes， 1844）][30]、草魚（Ctenopharyngodon idellus）[31]、青魚（Mylopharyngodonpiceus）[32]、和鯉魚（Cyprinus carpio Linnaeus）[33]等大宗淡水魚對氨氮比較敏感，其非離子氨的安全濃度范圍為0.033～0.068mg/L，遠低于異育銀鯽‘中科3號’0.14mg/L，安全濃度僅為異育銀鯽‘中科3號’的23.57%～48.57%，說明異育銀鯽‘中科3號’對氨氮的耐受性較其他大宗淡水魚更高。這可能與異育銀鯽‘中科3號’習慣在水質肥沃、有機質豐富的池塘底層棲息和覓食的生物習性相關，因為水體底層的氨氮及其他有害物質濃度含量比中上層水體相對較高，遺傳進化過程使其對氨氮的耐受力明顯高于中上層魚類。同樣是底層經濟魚類黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）[18]，非離子氨的安全濃度為0.15mg/L，對氨氮的耐受性與異育銀鯽‘中科3號’相近。金魚（Carassius auratus）[34]非離子氨的安全濃度為0.028mg/L，其雖然是鯽魚的變異種，親緣關系與異育銀鯽‘中科3號’最近，但由于人們審美導致其長期處于“逆向選育”，逐漸丟了鯽魚所擁有的一些底層魚類生物特性所致，只適合在水質良好的環(huán)境中生長。此外，異育銀鯽‘中科3號’的非離子氨安全濃度比麥穗魚（Pseudorasbora parva）（0.0346mg/L）[35]、鱖魚（SiniPecra chuatisi）（0.032mg/L）[36]等一些常見的溪河土著魚類高，說明異育銀鯽‘中科3號’相對于大多數(shù)經濟魚類具有更較強的氨氮耐受性。

4 ?結論

養(yǎng)殖生產中，由于養(yǎng)殖密度較高、投餌量較大，導致魚體對環(huán)境因子抗逆水平下降。因此，從養(yǎng)殖安全和養(yǎng)殖效益角度考慮，維持良好的養(yǎng)殖生長環(huán)境，是異育銀鯽‘中科3號’養(yǎng)殖過程中提高養(yǎng)殖效率、降低養(yǎng)殖風險、減少經濟損失的重要技術要素。本文系統(tǒng)研究了氨氮對異育銀鯽‘中科3號’幼魚急性毒性及肝臟抗氧化酶系統(tǒng)的影響，試驗結果顯示，總氨氮的安全濃度為15.80 mg/L，非離子氨的安全濃度為0.14 mg/L。雖然異育銀鯽‘中科3號’相對于大多數(shù)經濟魚類具有更較強的氨氮耐受性，但是從肝臟抗氧化酶活性檢測結果分析，氨氮脅迫對幼魚肝臟的T-SOD和CAT活性及MDA含量均產生了顯著影響，說明氨氮脅迫破壞了幼魚肝臟抗氧化系統(tǒng)，長期處于這種環(huán)境中將不利于幼魚健康生長。因此在異育銀鯽‘中科3號’苗種培育過程中因注意水質控制，可通過使用微生態(tài)制劑，提高溶解氧等手段，降低氨氮濃度，避免出現(xiàn)氨氮中毒現(xiàn)象，有助于提高養(yǎng)殖效益。

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