隔藥餅灸對慢性支氣管炎模型大鼠肺組織內(nèi)p-p38MAPK、ICAM-1的影響

魏星　譚靜　言芳　孫?！O璐　羅明　陽仁達

摘要?目的：觀察隔藥餅灸對慢性支氣管炎大鼠p-p38MAPK、ICAM-1的影響。方法：將48只SD大鼠隨機分成空白組、模型組、隔藥餅灸組、隔紙墊灸組，每組12只。選用改良煙熏法建立大鼠慢性支氣管炎模型，干預后，測定肺泡灌洗液中性粒細胞含量，各組大鼠ICAM-1 mRNA選用RT-PCR術測定、ICAM-1及p-p38MAPK蛋白選用Western blot檢測。結(jié)果：與空白組比較，模型組中性粒細胞、p-p38MAPK、ICAM-1 mRNA及蛋白含量增高顯著（P<0.01）。與模型組比較，隔藥餅灸組中性粒細胞數(shù)目減少（P<0.05），p-p38MAPK、ICAM-1 mRNA及蛋白含量顯著降低（P<0.01）。與隔紙墊灸組比較，隔藥餅灸組中性粒細胞、p-p38MAPK蛋白、ICAM-1 mRNA及蛋白降低更明顯（P<0.05）。結(jié)論：隔藥餅灸可通過減少p-p38MAPK蛋白含量、降低ICAM-1 mRNA及其蛋白水平，抑制中性粒細胞的釋放，以改善炎性反應環(huán)境治療慢性支氣管炎。

關鍵詞?隔藥餅灸;慢性支氣管炎;中性粒細胞;ICAM-1;p-p38MAPK;大鼠;模型

Effects of Cake-separated Moxibustion on p-p38MAPK and ICAM-1 in Rats′ Lung Tissue with Chronic Bronchitis

Wei Xing，Tan Jing，Yan Fang，Sun Xi，Sun Lu，Luo Ming，Yang Renda

（Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China）

Abstract?Objective：To observe the effects of cake-separated moxibustion on intercellular adhesion molecule-1（ICAM-1）and p-p38MAPK in rats with chronic bronchitis. Methods：A total of 48 Sprague-Dawley（SD）rats were randomly separated into the blank group，model group，cake-separated moxibustion group and paper pad-separated moxibustion team（12 in each group）. In addition to the blank group，other 3 groups used modified fumigation to establish the chronic bronchitis models of rats. After intervention，the content of neutrophils in Bronchoalveolar Lavage Fluid（BALF）was measured. ICAM-1 mRNA was detected by RT-PCR，while protein contents of ICAM-1 and p-p38MAPK were detected by Western blot. Results：Compared with the blank group，the contents of neutrophils，p-p38MAPK and ICAM-1 mRNA were obviously increased in the model group（P<0.01）. Compared with the model group，the number of neutrophils was decreased（P<0.05）and the contents of p-p38MAPK，ICAM-1 mRNA were significantly decreased（P<0.01）. Compared with the paper pad-separated moxibustion group，the contents of neutrophils，p-p38MAPK，ICAM-1 mRNA and protein were significantly decreased in the cake-separated moxibustion group（P<0.05）. Conclusion：Cake-separated moxibustion can inhibit the release of neutrophils and significantly reduce the inflammatory reaction，by reducing the contents of p-p38MAPK，ICAM-1 mRNA and protein，so as to treat chronic bronchitis.

Key Words?Cake-separated moxibustion; Chronic bronchitis; Neutrophil; ICAM-1; p-p38MAPK; Rat; Model

中圖分類號：R245.8文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.03.009

慢性支氣管炎（Chronic Bronchitis，CB）是以反復發(fā)作的咳嗽、咯痰、常伴喘息為主要特點的非特異性炎性病癥。近年來，隨著環(huán)境的變化和不良的生活習慣，CB的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)持續(xù)走高，且易進展成肺氣腫、肺心病等疾病，對患者生存生活造成威脅[1-2]。盡管CB的病因復雜，但其病理改變十分明確，即以氣道的炎性反應為典型，病變部位常聚集有大量中性粒細胞。這些細胞通過作用于支氣管內(nèi)皮細胞，促進其釋放ICAM-1、蛋白酶等物質(zhì)，這個過程主要受p38MAPK通路調(diào)節(jié)，激活后能釋放系列炎性因子，大量炎性反應因子又能反作用進一步激活上述通路，導致炎性反應瀑布反應[3]。我們前期研究表明：隔藥餅灸能顯著改善CB大鼠的一般癥狀，促進血清免疫球蛋白IgA及IgG的表達，糾正T淋巴亞群紊亂，減少腫瘤壞死因子-α等釋放，起到治療慢性支氣管的作用[4-5]。然而，隔藥餅灸是否對CB大鼠氣道內(nèi)中心粒細胞有影響？上述影響與p-p38MAPK通路有關？為此進行了以下探究?，F(xiàn)報道如下。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?48只健康的SD大鼠，雌雄各半，由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供（動物合格證編號：SCXK（湘）2017-0003），飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心，溫度20 ℃～25 ℃，濕度50%～70%。

1.1.2?藥物?所用藥餅配方為玉屏風散，按2∶4∶4∶1∶1比例稱量防風、炒白術、黃芪、薄荷、冰片（中藥購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院），后兩者作為透皮促透劑使用。將中藥材混合物磨成細粉，經(jīng)200目篩后裝瓶。實驗前，將瓶內(nèi)粉末用姜汁調(diào)成糊狀，制成厚度3 mm，直徑1 cm的圓餅。艾炷選用“神灸300灸”（東方1型），產(chǎn)于蘇州東方艾絨廠。

1.1.3?試劑及儀器

瑞氏染液購于南京建成科技有限公司;兔ICAM-1抗體、p-p38MAPK抗體均購于北京博奧森生物技術有限公司;JY3002型電子天平購自上海精密科學儀器有限公司;切片機購于820HistostAt Reichert公司;攝影生物顯微鏡購于MOTIC;DG-Ⅲ雙穩(wěn)數(shù)顯電泳儀購于北京鼎國生物技術發(fā)展中心。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備

將48只大鼠隨機分成空白組、模型組、隔藥餅灸組、隔紙墊灸組，每組12只。選取改良煙熏法建立大鼠CB模型[6]。造模時，空白組安置于無煙環(huán)境，其他3組置于1 m×1 m×1 m玻璃房內(nèi)，點燃煙葉、鋸末、刨花各50 g，每次煙熏30 min，2次/d，連續(xù)1個月。

模型成功評判標準：鼻黏膜色澤紫紅，分泌物較多，出現(xiàn)咳嗽、喘息，食欲降低，運動遲緩;病理切片顯示支氣管管腔分泌物較多，炎性細胞散布，黏膜上皮壞死脫落，杯狀細胞增生，氣管壁平滑肌增生。

1.2.2?干預方法

隔藥餅灸組：Ⅰ組選取肺俞、腎俞;Ⅱ組選取關元、足三里。穴位定位參考《實驗針灸學》中圖譜[7]。造模結(jié)束后，先定位穴位，用剪刀將穴位及其周圍直徑2 cm的鼠毛剪去，細小的絨毛則采用100 g/L硫化鈉對其脫除。將藥餅用膠布固定于穴位上，將撕去紙墊的艾炷置于藥餅上，點燃艾炷，待其燃盡更換，每穴施灸3壯，約20 min，1次/d，Ⅰ組、Ⅱ組穴位隔日輪流艾灸，持續(xù)2周。

空白組、模型組固定捆綁20 min;隔藥餅灸組按上述施灸操作進行，施灸20 min;隔紙墊灸組去除紙墊下的膠帶，貼附于穴位上，余操作同隔藥餅灸組。

1.2.3?檢測指標與方法

實驗期間觀察記錄大鼠體質(zhì)量、精神情況、毛色光澤、口鼻腔分泌物、運動幅度、進食量等。支氣管病理切片：取右肺中葉組織放于4%多聚甲醛固定1 d，經(jīng)脫水、包埋、切片、HE染色后光鏡下觀察。中性粒細胞數(shù)量測定：將肺泡灌洗液4 ℃、4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心4 min，棄上清液，20%碘伏溶液染色后，光鏡下細胞計數(shù)。將剩余的灌洗液再次離心4 min，4 000 r/min，取下部沉渣涂片，風干后，用無水乙醇將其固定5～10 min，瑞氏染色后，光鏡觀察，劃取3個視野，對中性粒細胞和細胞總數(shù)進行計數(shù)，算出中性粒細胞占細胞總數(shù)的平均百分數(shù)（%），再根據(jù)已算得的細胞總數(shù)，計算出中性粒細胞數(shù)量。ICAM-1 mRNA及其蛋白的測定：取右肺上葉臨近中心氣道的肺組織置于1 mL EP管內(nèi)，在-80 ℃條件下保存，采用RT-PCR法檢測ICAM-1 mRNA，Western blot測定ICAM-1蛋白。p-p38MAPK蛋白測定：取右肺下葉臨近中心氣道的肺組織置于1 mL EP管內(nèi)，在-80 ℃條件下保存，Western blot來測定p-p38MAPK蛋白。

1.3?統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2?結(jié)果

2.1?一般情況觀察

空白組大鼠一般情況良好，未見咳嗽、喘息等癥狀、皮毛光亮、動作靈活、飲食正常;模型組則在造模1周后，出現(xiàn)咳嗽、喘息，隨著時間推移，咳嗽喘息程度加重，口鼻腔黏膜呈紫紅色，分泌物較多，同時精神不振、皮毛萎黃無光、動作緩慢;隔藥餅組大鼠經(jīng)施灸治療后，喘息、咳嗽等癥狀明顯減輕，口鼻腔黏膜由紫紅逐漸變淡恢復至淡紅，口鼻腔分泌物減少，毛發(fā)較有光澤，活動增多，動作迅速;隔紙墊灸組大鼠經(jīng)干預后狀態(tài)亦趨好轉(zhuǎn)。

2.2?病理形態(tài)學觀察

空白組無明顯病理學變化。見圖1、2。模型組纖毛脫落，杯狀細胞增生，肺泡壁變薄，氣管黏膜下層存在大量炎性細胞。見圖3、4。隔藥餅灸組氣管、肺泡未見明顯異常，與模型組比較，纖毛脫落、管腔分泌物、炎性細胞浸潤情況明顯減輕，纖毛分布較正常，杯狀細胞稍有增生，提示經(jīng)隔藥餅灸治療后，支氣管炎性反應環(huán)境得到明顯控制。見圖5、6。隔紙墊灸組纖毛較稀疏，分布稍顯紊亂，黏膜結(jié)構(gòu)稍模糊，氣管黏膜下層存在少量炎性反應細胞，與模型組比較，隔紙墊灸組支氣管炎性反應在逐漸減輕。見圖7、8。

2.3?隔藥餅灸對大鼠肺泡灌洗液中性粒細胞的影響

治療前，與空白組比較，模型組肺泡灌洗液中性粒細胞含量增加顯著（P<0.01）;治療后，與模型組比較，隔藥餅灸組中性粒細胞含量升高明顯（P<0.05）;與紙墊灸組比較，隔藥餅灸組肺泡灌洗液中性粒細胞明顯降低（P<0.05）。見表1。

2.4?隔藥餅灸對大鼠肺組織ICAM-1 mRNA及其蛋白的影響

治療前，與空白組比較，模型組大鼠ICAM-1 mRNA及其蛋白水平升高顯著（P<0.01）;治療后，與模型組比較，隔藥餅灸組大鼠ICAM-1 mRNA及其蛋白含量降低明顯（P<0.01）;與隔紙墊灸組比較，隔藥餅灸組降低更明顯（P<0.05）。見表2。

2.5?隔藥餅灸對大鼠肺組織p-p38MAPK蛋白含量的影響

治療前，與空白組比較，模型組p-p38MAPK蛋白含量升高明顯（P<0.05）;治療后，與模型組比較，隔藥餅灸組大鼠p-p38MAPK蛋白含量均顯著減少（P<0.01）;與隔紙墊灸組比較，隔藥餅灸組p-p38MAPK蛋白含量明顯降低（P<0.05）。見表3。

3?討論

p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶家族（MAPK）中的重要成員，在細胞生長分化、凋亡、炎性反應、應激等重要生理過程發(fā)揮作用，是調(diào)控炎性反應的關鍵通路之一。該通路被MKK 3，4，6激活后生成p-p38[8]，下游IKB激酶被連鎖激活，NF-KB活化，調(diào)控內(nèi)皮細胞促進黏附分子ICAM-1、VCAM-1相關基因的轉(zhuǎn)錄表達，造成內(nèi)皮細胞損傷[9-10]。在慢支發(fā)展過程中，內(nèi)皮細胞損傷是其中的關鍵環(huán)節(jié)，而細胞粘附因子ICAM-1是介導內(nèi)皮細胞損傷的重要因素[11-12]。ICAM-1可誘導中性粒細胞與氣道上皮細胞的加強黏附，富集中性粒細胞到炎性反應區(qū)，分泌釋放細胞活性物質(zhì)，損傷氣道上皮細胞，造成支氣管肺組織損傷[13-14]。

隔藥餅灸屬于間接灸、隔物灸，是將中藥混合物為主要成分的餅狀物置于穴位上，結(jié)合藥餅上艾炷的溫熱效應，促進中藥有效成分經(jīng)皮吸收進入穴位，充分發(fā)揮溫熱效應、藥物的藥化作用和腧穴的相對特異性，有效結(jié)合灸—藥—穴綜合治療作用，將藥物的作用成分最大程度透皮吸收進入體內(nèi)，達到扶正固本的目的。本研究藥餅配方源自玉屏風散，玉屏風散記載于《丹溪心法》，具有益氣健脾、固表止汗之功。有研究表明[15]，玉屏風散可有效降低咽部ICAM-1的表達，減少中性粒細胞等炎性細胞的浸潤，達到改善炎性反應的目的。實驗研究表明[16]，玉屏風散可顯著抑制血管細胞粘附分子表達，從而達到減輕呼吸道炎性反應的目的。

本研究中選取了肺俞、足三里、腎俞、關元四穴。其中肺俞、腎俞分別為肺臟、腎臟的背俞穴，是所屬臟器的經(jīng)氣聚集地，常用來治療相應臟腑病證。中醫(yī)學認為慢支其病位主要在肺腎，“肺為氣之主，腎為氣之根”，吸入之氣需要肺之肅降，同時需要腎之納氣以維持呼吸深度，肺腎相互配合才能保證呼吸正常進行。關元、足三里是強壯要穴，可補益先天之本和后天之本，進而調(diào)節(jié)免疫，匡正祛邪。研究表明[17-18]，針灸足三里、關元，可降低腦卒中大鼠IL-1β、IL-6等炎性因子，減輕了腦缺血損傷早期炎性反應，并能降低術后感染率。

本研究結(jié)果顯示：治療后，與模型組比較，隔藥餅灸組、隔紙墊灸組中性粒細胞含量均升高明顯（P<0.05）;隔紙墊灸組和隔藥餅灸組大鼠p-p38MAPK蛋白含量均下降顯著（P<0.01）;隔紙墊灸組大鼠ICAM-1 mRNA及其蛋白含量降低明顯（P<0.05），并且隔藥餅灸組降低更顯著。與隔藥餅灸比較，隔紙墊灸組肺泡灌洗液中性粒細胞、p-p38MAPK蛋白含量增高明顯（P<0.05）。

由此可見，隔藥餅灸是通過下調(diào)ICAM-1、p-p38MAPK的表達來抑制中性粒細胞的釋放與聚集，從而改善慢支的炎性反應環(huán)境，達到治療慢支的目的。綜上所述，隔藥餅灸治療慢支的機制可能在于通過抑制p38MAPK通路的過度激活、減少了ICAM-1、p-p38MAPK分泌，抑制了中性粒細胞的釋放，減輕呼吸道炎性反應環(huán)境，切斷了氣道炎性反應鏈，進而達到治療CB的作用，但是具體是受p38MAPK通路哪個環(huán)節(jié)調(diào)控及調(diào)控機制尚未明確，有待進一步探討。

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