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    隔藥餅灸對慢性支氣管炎模型大鼠肺組織內(nèi)p-p38MAPK、ICAM-1的影響

    2019-09-10 07:22:44魏星譚靜言芳孫希孫璐羅明陽仁達
    世界中醫(yī)藥 2019年3期
    關鍵詞:餅灸性反應中性

    魏星 譚靜 言芳 孫?!O璐 羅明 陽仁達

    摘要?目的:觀察隔藥餅灸對慢性支氣管炎大鼠p-p38MAPK、ICAM-1的影響。方法:將48只SD大鼠隨機分成空白組、模型組、隔藥餅灸組、隔紙墊灸組,每組12只。選用改良煙熏法建立大鼠慢性支氣管炎模型,干預后,測定肺泡灌洗液中性粒細胞含量,各組大鼠ICAM-1 mRNA選用RT-PCR術測定、ICAM-1及p-p38MAPK蛋白選用Western blot檢測。結(jié)果:與空白組比較,模型組中性粒細胞、p-p38MAPK、ICAM-1 mRNA及蛋白含量增高顯著(P<0.01)。與模型組比較,隔藥餅灸組中性粒細胞數(shù)目減少(P<0.05),p-p38MAPK、ICAM-1 mRNA及蛋白含量顯著降低(P<0.01)。與隔紙墊灸組比較,隔藥餅灸組中性粒細胞、p-p38MAPK蛋白、ICAM-1 mRNA及蛋白降低更明顯(P<0.05)。結(jié)論:隔藥餅灸可通過減少p-p38MAPK蛋白含量、降低ICAM-1 mRNA及其蛋白水平,抑制中性粒細胞的釋放,以改善炎性反應環(huán)境治療慢性支氣管炎。

    關鍵詞?隔藥餅灸;慢性支氣管炎;中性粒細胞;ICAM-1;p-p38MAPK;大鼠;模型

    Effects of Cake-separated Moxibustion on p-p38MAPK and ICAM-1 in Rats′ Lung Tissue with Chronic Bronchitis

    Wei Xing,Tan Jing,Yan Fang,Sun Xi,Sun Lu,Luo Ming,Yang Renda

    (Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,China)

    Abstract?Objective:To observe the effects of cake-separated moxibustion on intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)and p-p38MAPK in rats with chronic bronchitis. Methods:A total of 48 Sprague-Dawley(SD)rats were randomly separated into the blank group,model group,cake-separated moxibustion group and paper pad-separated moxibustion team(12 in each group). In addition to the blank group,other 3 groups used modified fumigation to establish the chronic bronchitis models of rats. After intervention,the content of neutrophils in Bronchoalveolar Lavage Fluid(BALF)was measured. ICAM-1 mRNA was detected by RT-PCR,while protein contents of ICAM-1 and p-p38MAPK were detected by Western blot. Results:Compared with the blank group,the contents of neutrophils,p-p38MAPK and ICAM-1 mRNA were obviously increased in the model group(P<0.01). Compared with the model group,the number of neutrophils was decreased(P<0.05)and the contents of p-p38MAPK,ICAM-1 mRNA were significantly decreased(P<0.01). Compared with the paper pad-separated moxibustion group,the contents of neutrophils,p-p38MAPK,ICAM-1 mRNA and protein were significantly decreased in the cake-separated moxibustion group(P<0.05). Conclusion:Cake-separated moxibustion can inhibit the release of neutrophils and significantly reduce the inflammatory reaction,by reducing the contents of p-p38MAPK,ICAM-1 mRNA and protein,so as to treat chronic bronchitis.

    Key Words?Cake-separated moxibustion; Chronic bronchitis; Neutrophil; ICAM-1; p-p38MAPK; Rat; Model

    中圖分類號:R245.8文獻標識碼:Adoi:10.3969/j.issn.1673-7202.2019.03.009

    慢性支氣管炎(Chronic Bronchitis,CB)是以反復發(fā)作的咳嗽、咯痰、常伴喘息為主要特點的非特異性炎性病癥。近年來,隨著環(huán)境的變化和不良的生活習慣,CB的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)持續(xù)走高,且易進展成肺氣腫、肺心病等疾病,對患者生存生活造成威脅[1-2]。盡管CB的病因復雜,但其病理改變十分明確,即以氣道的炎性反應為典型,病變部位常聚集有大量中性粒細胞。這些細胞通過作用于支氣管內(nèi)皮細胞,促進其釋放ICAM-1、蛋白酶等物質(zhì),這個過程主要受p38MAPK通路調(diào)節(jié),激活后能釋放系列炎性因子,大量炎性反應因子又能反作用進一步激活上述通路,導致炎性反應瀑布反應[3]。我們前期研究表明:隔藥餅灸能顯著改善CB大鼠的一般癥狀,促進血清免疫球蛋白IgA及IgG的表達,糾正T淋巴亞群紊亂,減少腫瘤壞死因子-α等釋放,起到治療慢性支氣管的作用[4-5]。然而,隔藥餅灸是否對CB大鼠氣道內(nèi)中心粒細胞有影響?上述影響與p-p38MAPK通路有關?為此進行了以下探究?,F(xiàn)報道如下。

    1?材料與方法

    1.1?材料

    1.1.1?動物?48只健康的SD大鼠,雌雄各半,由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供(動物合格證編號:SCXK(湘)2017-0003),飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心,溫度20 ℃~25 ℃,濕度50%~70%。

    1.1.2?藥物?所用藥餅配方為玉屏風散,按2∶4∶4∶1∶1比例稱量防風、炒白術、黃芪、薄荷、冰片(中藥購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院),后兩者作為透皮促透劑使用。將中藥材混合物磨成細粉,經(jīng)200目篩后裝瓶。實驗前,將瓶內(nèi)粉末用姜汁調(diào)成糊狀,制成厚度3 mm,直徑1 cm的圓餅。艾炷選用“神灸300灸”(東方1型),產(chǎn)于蘇州東方艾絨廠。

    1.1.3?試劑及儀器

    瑞氏染液購于南京建成科技有限公司;兔ICAM-1抗體、p-p38MAPK抗體均購于北京博奧森生物技術有限公司;JY3002型電子天平購自上海精密科學儀器有限公司;切片機購于820HistostAt Reichert公司;攝影生物顯微鏡購于MOTIC;DG-Ⅲ雙穩(wěn)數(shù)顯電泳儀購于北京鼎國生物技術發(fā)展中心。

    1.2?方法

    1.2.1?分組與模型制備

    將48只大鼠隨機分成空白組、模型組、隔藥餅灸組、隔紙墊灸組,每組12只。選取改良煙熏法建立大鼠CB模型[6]。造模時,空白組安置于無煙環(huán)境,其他3組置于1 m×1 m×1 m玻璃房內(nèi),點燃煙葉、鋸末、刨花各50 g,每次煙熏30 min,2次/d,連續(xù)1個月。

    模型成功評判標準:鼻黏膜色澤紫紅,分泌物較多,出現(xiàn)咳嗽、喘息,食欲降低,運動遲緩;病理切片顯示支氣管管腔分泌物較多,炎性細胞散布,黏膜上皮壞死脫落,杯狀細胞增生,氣管壁平滑肌增生。

    1.2.2?干預方法

    隔藥餅灸組:Ⅰ組選取肺俞、腎俞;Ⅱ組選取關元、足三里。穴位定位參考《實驗針灸學》中圖譜[7]。造模結(jié)束后,先定位穴位,用剪刀將穴位及其周圍直徑2 cm的鼠毛剪去,細小的絨毛則采用100 g/L硫化鈉對其脫除。將藥餅用膠布固定于穴位上,將撕去紙墊的艾炷置于藥餅上,點燃艾炷,待其燃盡更換,每穴施灸3壯,約20 min,1次/d,Ⅰ組、Ⅱ組穴位隔日輪流艾灸,持續(xù)2周。

    空白組、模型組固定捆綁20 min;隔藥餅灸組按上述施灸操作進行,施灸20 min;隔紙墊灸組去除紙墊下的膠帶,貼附于穴位上,余操作同隔藥餅灸組。

    1.2.3?檢測指標與方法

    實驗期間觀察記錄大鼠體質(zhì)量、精神情況、毛色光澤、口鼻腔分泌物、運動幅度、進食量等。支氣管病理切片:取右肺中葉組織放于4%多聚甲醛固定1 d,經(jīng)脫水、包埋、切片、HE染色后光鏡下觀察。中性粒細胞數(shù)量測定:將肺泡灌洗液4 ℃、4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心4 min,棄上清液,20%碘伏溶液染色后,光鏡下細胞計數(shù)。將剩余的灌洗液再次離心4 min,4 000 r/min,取下部沉渣涂片,風干后,用無水乙醇將其固定5~10 min,瑞氏染色后,光鏡觀察,劃取3個視野,對中性粒細胞和細胞總數(shù)進行計數(shù),算出中性粒細胞占細胞總數(shù)的平均百分數(shù)(%),再根據(jù)已算得的細胞總數(shù),計算出中性粒細胞數(shù)量。ICAM-1 mRNA及其蛋白的測定:取右肺上葉臨近中心氣道的肺組織置于1 mL EP管內(nèi),在-80 ℃條件下保存,采用RT-PCR法檢測ICAM-1 mRNA,Western blot測定ICAM-1蛋白。p-p38MAPK蛋白測定:取右肺下葉臨近中心氣道的肺組織置于1 mL EP管內(nèi),在-80 ℃條件下保存,Western blot來測定p-p38MAPK蛋白。

    1.3?統(tǒng)計學方法

    采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料以(±s)表示,采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2?結(jié)果

    2.1?一般情況觀察

    空白組大鼠一般情況良好,未見咳嗽、喘息等癥狀、皮毛光亮、動作靈活、飲食正常;模型組則在造模1周后,出現(xiàn)咳嗽、喘息,隨著時間推移,咳嗽喘息程度加重,口鼻腔黏膜呈紫紅色,分泌物較多,同時精神不振、皮毛萎黃無光、動作緩慢;隔藥餅組大鼠經(jīng)施灸治療后,喘息、咳嗽等癥狀明顯減輕,口鼻腔黏膜由紫紅逐漸變淡恢復至淡紅,口鼻腔分泌物減少,毛發(fā)較有光澤,活動增多,動作迅速;隔紙墊灸組大鼠經(jīng)干預后狀態(tài)亦趨好轉(zhuǎn)。

    2.2?病理形態(tài)學觀察

    空白組無明顯病理學變化。見圖1、2。模型組纖毛脫落,杯狀細胞增生,肺泡壁變薄,氣管黏膜下層存在大量炎性細胞。見圖3、4。隔藥餅灸組氣管、肺泡未見明顯異常,與模型組比較,纖毛脫落、管腔分泌物、炎性細胞浸潤情況明顯減輕,纖毛分布較正常,杯狀細胞稍有增生,提示經(jīng)隔藥餅灸治療后,支氣管炎性反應環(huán)境得到明顯控制。見圖5、6。隔紙墊灸組纖毛較稀疏,分布稍顯紊亂,黏膜結(jié)構(gòu)稍模糊,氣管黏膜下層存在少量炎性反應細胞,與模型組比較,隔紙墊灸組支氣管炎性反應在逐漸減輕。見圖7、8。

    2.3?隔藥餅灸對大鼠肺泡灌洗液中性粒細胞的影響

    治療前,與空白組比較,模型組肺泡灌洗液中性粒細胞含量增加顯著(P<0.01);治療后,與模型組比較,隔藥餅灸組中性粒細胞含量升高明顯(P<0.05);與紙墊灸組比較,隔藥餅灸組肺泡灌洗液中性粒細胞明顯降低(P<0.05)。見表1。

    2.4?隔藥餅灸對大鼠肺組織ICAM-1 mRNA及其蛋白的影響

    治療前,與空白組比較,模型組大鼠ICAM-1 mRNA及其蛋白水平升高顯著(P<0.01);治療后,與模型組比較,隔藥餅灸組大鼠ICAM-1 mRNA及其蛋白含量降低明顯(P<0.01);與隔紙墊灸組比較,隔藥餅灸組降低更明顯(P<0.05)。見表2。

    2.5?隔藥餅灸對大鼠肺組織p-p38MAPK蛋白含量的影響

    治療前,與空白組比較,模型組p-p38MAPK蛋白含量升高明顯(P<0.05);治療后,與模型組比較,隔藥餅灸組大鼠p-p38MAPK蛋白含量均顯著減少(P<0.01);與隔紙墊灸組比較,隔藥餅灸組p-p38MAPK蛋白含量明顯降低(P<0.05)。見表3。

    3?討論

    p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶家族(MAPK)中的重要成員,在細胞生長分化、凋亡、炎性反應、應激等重要生理過程發(fā)揮作用,是調(diào)控炎性反應的關鍵通路之一。該通路被MKK 3,4,6激活后生成p-p38[8],下游IKB激酶被連鎖激活,NF-KB活化,調(diào)控內(nèi)皮細胞促進黏附分子ICAM-1、VCAM-1相關基因的轉(zhuǎn)錄表達,造成內(nèi)皮細胞損傷[9-10]。在慢支發(fā)展過程中,內(nèi)皮細胞損傷是其中的關鍵環(huán)節(jié),而細胞粘附因子ICAM-1是介導內(nèi)皮細胞損傷的重要因素[11-12]。ICAM-1可誘導中性粒細胞與氣道上皮細胞的加強黏附,富集中性粒細胞到炎性反應區(qū),分泌釋放細胞活性物質(zhì),損傷氣道上皮細胞,造成支氣管肺組織損傷[13-14]。

    隔藥餅灸屬于間接灸、隔物灸,是將中藥混合物為主要成分的餅狀物置于穴位上,結(jié)合藥餅上艾炷的溫熱效應,促進中藥有效成分經(jīng)皮吸收進入穴位,充分發(fā)揮溫熱效應、藥物的藥化作用和腧穴的相對特異性,有效結(jié)合灸—藥—穴綜合治療作用,將藥物的作用成分最大程度透皮吸收進入體內(nèi),達到扶正固本的目的。本研究藥餅配方源自玉屏風散,玉屏風散記載于《丹溪心法》,具有益氣健脾、固表止汗之功。有研究表明[15],玉屏風散可有效降低咽部ICAM-1的表達,減少中性粒細胞等炎性細胞的浸潤,達到改善炎性反應的目的。實驗研究表明[16],玉屏風散可顯著抑制血管細胞粘附分子表達,從而達到減輕呼吸道炎性反應的目的。

    本研究中選取了肺俞、足三里、腎俞、關元四穴。其中肺俞、腎俞分別為肺臟、腎臟的背俞穴,是所屬臟器的經(jīng)氣聚集地,常用來治療相應臟腑病證。中醫(yī)學認為慢支其病位主要在肺腎,“肺為氣之主,腎為氣之根”,吸入之氣需要肺之肅降,同時需要腎之納氣以維持呼吸深度,肺腎相互配合才能保證呼吸正常進行。關元、足三里是強壯要穴,可補益先天之本和后天之本,進而調(diào)節(jié)免疫,匡正祛邪。研究表明[17-18],針灸足三里、關元,可降低腦卒中大鼠IL-1β、IL-6等炎性因子,減輕了腦缺血損傷早期炎性反應,并能降低術后感染率。

    本研究結(jié)果顯示:治療后,與模型組比較,隔藥餅灸組、隔紙墊灸組中性粒細胞含量均升高明顯(P<0.05);隔紙墊灸組和隔藥餅灸組大鼠p-p38MAPK蛋白含量均下降顯著(P<0.01);隔紙墊灸組大鼠ICAM-1 mRNA及其蛋白含量降低明顯(P<0.05),并且隔藥餅灸組降低更顯著。與隔藥餅灸比較,隔紙墊灸組肺泡灌洗液中性粒細胞、p-p38MAPK蛋白含量增高明顯(P<0.05)。

    由此可見,隔藥餅灸是通過下調(diào)ICAM-1、p-p38MAPK的表達來抑制中性粒細胞的釋放與聚集,從而改善慢支的炎性反應環(huán)境,達到治療慢支的目的。綜上所述,隔藥餅灸治療慢支的機制可能在于通過抑制p38MAPK通路的過度激活、減少了ICAM-1、p-p38MAPK分泌,抑制了中性粒細胞的釋放,減輕呼吸道炎性反應環(huán)境,切斷了氣道炎性反應鏈,進而達到治療CB的作用,但是具體是受p38MAPK通路哪個環(huán)節(jié)調(diào)控及調(diào)控機制尚未明確,有待進一步探討。

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