乳腺癌T7噬菌體展示cDNA文庫的構(gòu)建

張 濤，施寶民，王 洪，陳鵲汀，季 堃，余松林.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院普外科，上海 00065；.河北大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科，保定 03000

乳腺癌T7噬菌體展示cDNA文庫的構(gòu)建

張 濤1，施寶民1，王 洪2，陳鵲汀2，季 堃1，余松林1
1.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院普外科，上海 200065；
2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科，保定 031000

目的 構(gòu)建乳腺癌組織T7噬菌體展示cDNA文庫，為下一步篩選差異蛋白打下基礎(chǔ)。方法 利用乳腺癌新鮮標(biāo)本，提取總RNA，分離mRNA并進(jìn)行純化，然后合成cDNA，連接體外包裝獲得T7噬菌體展示cDNA文庫。結(jié)果 總RNA經(jīng)檢測，A 260／A 280＝1.87，純化的mRNA產(chǎn)量為4.0μg，A 260/A 280=1.91，合成的cDNA大小在200～6000bp之間，原始文庫的容量為2×107pfu，文庫重組率為90％，插入片段長度在300～2000bp之間。結(jié)論 噬菌體展示技術(shù)是進(jìn)行蛋白質(zhì)功能研究的高效方法，構(gòu)建高質(zhì)量的乳腺癌噬菌體展示cDNA文庫，可用于腫瘤標(biāo)志物的篩選、腫瘤疫苗的研制、多肽藥物的開發(fā)、靶向治療的研究等眾多領(lǐng)域。

乳腺癌；噬菌體展示；cDNA文庫

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療是提高療效的關(guān)鍵，在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的早期階段，血液中的一些蛋白質(zhì)即有微量變化，這些蛋白質(zhì)為實現(xiàn)早期診斷和監(jiān)測復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供了線索。噬菌體展示技術(shù)是研究蛋白質(zhì)間相互作用的一種有效手段，利用該技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)這些微量蛋白并進(jìn)一步研究其功能[1]。因此，構(gòu)建噬菌體展示cDNA文庫是所有研究工作的基石，本研究即首先構(gòu)建了乳腺癌組織T7噬菌體展示cDNA文庫，為下一步篩選差異蛋白打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

5例乳腺癌組織取自經(jīng)病理證實的乳腺癌患者，5例癌組織剪碎后混合，最后取10 g混合組織備用。

·論 著·

TRIzol試劑，RNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Invitrogen公司，Oligotex mRNA kit購自Giagen公司，T7 Select 10-3 Orient Express Random Primer cDNA cloning System試劑購自Novagen公司，PCR引物由上海博亞公司合成，Taq RNA聚合酶購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和mRNA分離

將液氮凍存的新鮮乳腺癌組織稱重后加液氮快速研磨成粉末狀，按1m l/50mg組織加入TRIzol混勻，4℃12000 g離心10m in，取上清，室溫孵育5分鐘后，按0.2m l/m l TRIzol加入氯仿，劇烈振蕩至完全乳化，4℃12000 g離心15m in，將上層水相轉(zhuǎn)移到一個新管中，加入等體積異丙醇，4℃12000 g離心10m in，棄上清，加入1m l 75％乙醇混勻，4℃12000 g離心10 m in，棄上清，沉淀于空氣中干燥后，溶于DEPC處理的水中，用紫外分光光度法測定總RNA濃度及純度，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量。

1.2.2 mRNA的分離純化

按照試劑盒操作說明，用OligotexmRNA kit進(jìn)行mRNA的分離純化，用紫外分光光度法測定mRNA濃度及純度，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA質(zhì)量。

1.2.3 cDNA的合成

以4μg mRNA為模板，應(yīng)用隨機引物，在MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成第1鏈cDNA，而后在Rnaseh，DNA聚合酶I和DNA連接酶作用下合成第2鏈cDNA，由此得到dscDNA，然后在T4 DNA聚合酶作用下末端補平，與EcoR I和Hind IV接頭連接，經(jīng)EcoR I和Hind III酶切后得到末端為黏性的cDNA分子，通過Orient Express Random Primer cDNA cloing System提供的size fractionation試劑盒去處多余的接頭及長度在300bp以下的小片段cDNA，1％TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA質(zhì)量。

1.2.4 cDNA與T7 Select 10-3載體的連接與體外包裝

按插入片段：載體摩爾比2∶1，將0.02 pmol得到的cDNA與0.01 pmol T7 Select10-3載體在16℃連接反應(yīng)產(chǎn)物，在25μl T7噬菌體包裝物中加入5μl上述連接反應(yīng)產(chǎn)物，22℃2h，得到具有感染性的T7噬菌體顆粒。

1.2.5 噬菌體文庫的擴增

將全部包裝產(chǎn)物與BLT 5430菌液混合，按5× 104個噬菌體斑/板，鋪150mm LB平板，37℃倒置培養(yǎng)3～4h，平板上噬菌體斑長到1～2mm時，每塊板加10m l噬菌體提取緩沖液覆蓋平板，4℃存貯過夜，次日收集噬菌體提取緩沖液，加0.5m l氯仿，3000 g離心5m in，收集上清，取10μl上清進(jìn)行梯度稀釋，鋪板，測定擴增后噬菌體展示文庫的滴度，在擴增產(chǎn)物中加入1/10體積80％的滅菌甘油，分裝后－70℃保存。

1.2.6 原始及擴增文庫質(zhì)量檢測

原始文庫噬菌體按104，105，106，擴增文庫按108，109，1010稀釋后鋪板測定文庫容量，從鋪板所得的噬菌體班中隨機挑選分離良好的單個噬菌體斑，用滅菌拾頭沾取少量噬菌體加入100μl10mmol/EDTA中，混勻，65℃，14000 r/m in離心10m in去除不溶物，取1.5μl上清加入50μl PCR體系中（加5μl 10× PCR反應(yīng)緩沖液，3μl 25mmol/LMgCl2，0.2mmol/L dNTP，0.1mmol/L正向及反向引物），80℃熱啟動2m in，然后加入2 u Taq DNA聚合酶，PCR循環(huán)參數(shù)：94℃50 s，50℃1m in，72℃1m in，35個循環(huán)后72℃延伸6m in，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測插入片段大小，并計算文庫重組率。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的提取

從乳腺癌組織中提取的RNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測，A260／A280＝1.87，表明提取的總RNA純度較高。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示28S和18SRNA條帶均清晰，說明提取的總RNA未發(fā)生明顯降解，完整性好。

2.2 mRNA的分離純化

純化的mRNA產(chǎn)量為4.0μg，A 260/A280=1.91，表明分離純化的mRNA純度高，可以用于cDNA的合成。

2.3 cDNA的合成

將4μgmRNA用于合成雙鏈cDNA，瓊脂糖凝膠電泳可見合成的cDNA大小在200～6000bp之間，平均長度1～2 kb，說明cDNA質(zhì)量完全符合文庫構(gòu)建的要求。

2.4 T7噬菌體展示文庫的質(zhì)量鑒定

通過連接體外包裝后獲得T7噬菌體展示cDNA文庫，經(jīng)稀釋后鋪平板測定，原始文庫的容量為2×107pfu，對隨機挑取的噬菌斑進(jìn)行PCR鑒定，文庫重組率為90％，插入片段長度在300～2000bp之間，我們已構(gòu)建了較好質(zhì)量的噬菌體展示文庫。

3 討論

人類基因組計劃完成后就進(jìn)入了功能基因組時代，研究基因編碼的各種蛋白質(zhì)功能。噬菌體展示技術(shù)是近年來建立和發(fā)展起來的利用噬菌體表達(dá)外源基因的一項新技術(shù)[2]，實現(xiàn)了基因型和表型的結(jié)合。該技術(shù)將編碼蛋白質(zhì)的cDNA序列克隆入噬菌體的基因序列上，這樣cDNA編碼的蛋白或多肽就與噬菌體外殼蛋白融合表達(dá)，從而構(gòu)建出蛋白質(zhì)的表面展示文庫，應(yīng)用T7噬菌體展示系統(tǒng)所構(gòu)建的cDNA文庫與其他傳統(tǒng)的cDNA文庫相比，有以下3個特點：1）文庫容量更為豐富，T7是裂解性噬菌體，其展示的蛋白無需分泌，這就使得更多的序列可能被展示[3]。2）文庫范圍更廣，可以通過受體與配體結(jié)合的方式，從文庫中篩選到與任何靶標(biāo)相結(jié)合的分子[4]，而且篩選出的噬菌體還可以在大腸埃希菌中進(jìn)行再擴增，從而可以進(jìn)行連續(xù)多輪的篩選，得到高親和力的噬菌體，進(jìn)而獲得其編碼cDNA[5]。3）操作簡便，效率高，噬菌體展示的表達(dá)產(chǎn)物與其編碼基因在同一噬菌體顆粒上建立起一一對應(yīng)的關(guān)系，使人們可以容易地對其進(jìn)行一系列的生化和遺傳操作[6-7]。因次噬菌體展示技術(shù)為蛋白質(zhì)研究提供了良好的技術(shù)平臺。本研究中我們構(gòu)建了高質(zhì)量的乳腺癌噬菌體展示cDNA文庫，為下一步篩選腫瘤標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)。

為了構(gòu)建高質(zhì)量的噬菌體展示cDNA文庫，首先要保障RNA的質(zhì)量，在操作過程中防止RNA降解，經(jīng)分離純化后，最終要獲得純度較高的mRNA，經(jīng)紫外分光光度法測定，其A 260/A280在1.8～2.0才符合進(jìn)一步建庫的要求。

構(gòu)建cDNA文庫時，可以用2種方法來合成單鏈cDNA，一種是用Oligo（dT）引導(dǎo)cDNA合成，另一種是用隨機引物引導(dǎo)cDNA合成，由于Oligo（dT）只能從模板mRNA的3’末端起始引發(fā)cDNA的合成，而現(xiàn)有的反轉(zhuǎn)錄酶在cDNA反轉(zhuǎn)錄合成中的行進(jìn)能力有限（平均1 kb以下），這使得Oligo（dT）引物反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA通常都缺少模板mRNA 5’端的重要信息，而隨機引物引導(dǎo)cDNA合成時，在一條模板mRNA上同時雜交多個引物序列，從而在多個位點上同時引發(fā)cDNA反轉(zhuǎn)錄合成，可以在同一模板上合成多條相互重疊的cDNA片段，克服了Oligo（dT）引導(dǎo)合成法的缺點，更有效地反映表達(dá)mRNA全長序列信息[8，9]，因此，本研究采用隨機引物策略合成cDNA，更有可能獲得含有完整開放閱讀框的cDNA片段，該法可以合成出大小長度不等的cDNA片段，它們分別代表了mRNA各部分區(qū)域序列，反映出mRNA所攜帶的信息。另外，據(jù)SCOP數(shù)據(jù)庫推算，如果文庫中cDNA插入片段達(dá)到300bp以上，就可以代表蛋白質(zhì)的各個功能域[10]。本研究所建文庫的cDNA插入片段長度在300～2000bp，表明文庫中重組cDNA片段能代表蛋白質(zhì)的各功能域的序列信息。當(dāng)文庫建成后，為了保證后續(xù)研究的有效性，首先要對文庫質(zhì)量進(jìn)行評估，從理論上講，當(dāng)一個cDNA文庫具有106以上的庫容量時，就能以99％的概率保證文庫中包含有細(xì)胞表達(dá)出的任何一種mRNA序列信息[11]。本研究所構(gòu)建的文庫中包含2×107克隆子，具有較高的庫容量，完全可以滿足進(jìn)一步研究的需要。

[1] Paschke M.Phage display systems and their applications[J].Appl M icrobiol Biotechnol，2006，70（1）：2-11.

[2] Shukla GS，Krag DN.Cancer cell-specific internalizing ligands rom phage displayed beta-lactamase-peptide fusion libraries[J].Protein Eng Des Sel，2010，23（6）：431-440.

[3] SantiE，Capone S，Mennuni C，et al.Bacteriophage lambda display of complex cDNA libraries：a new approach to functional genom ics[J].JMol Biol，2000，296（2）：497-508.

[4] Zhang B，Zhang Y，Wang J，et al.Screening and identification of a targeting peptide tohepatocarcinoma from a phage display peptide library[J].MolMed，2007，13（5-6）：246-254.

[5] Dalgleish A.Overcom ing technical challenges in the developmentof cancer vaccines[J].IDrugs，2007，10（7）：463-467.

[6] Enb?ck J，Laakkonen P.Tumour-hom ing peptides：tools for targeting，imaging and destruction[J].Biochem Soc Trans，2007，35（Pt4）：780-783.

[7] Qin X，Wan Y，Li M，et al.Identification of a novel peptide ligand ofhuman vascular endothelia grow th factor receptor 3 for targeted tumour diagnosis and therapy[J].JBiochem，2007，142（1）：79-85.

[8] Dai X，Cai C，Xiao F，et al.Identification of a novel aFGF-binding peptide w ith anti-tumor effect on breast cancer from phagedisplay library[J]. Biochem Biophys Res Commun，2014，445（4）：795-801.

[9] Zuhaida AA，A li AM，Tam ilselvan S，et al.Construction of single-chain variable fragment antibodies against MCF-7breast cancer cells[J].GenetMolRes，2013，12（4）：5547-5559.

[10] Shukla GS，Krag DN，Peletskaya EN，et al. Intravenous infusion of phage-displayed antibody library inhuman cancer patients：enrichment andcancer-specificity of tumor-hom ing phage-antibodies[J].Cancer Immunol Immunother，2013，62 （8）：1397-1410.

[11] Filfil R，Paul-Roc B，Cantin C，et al.Molecular imaging of breast tumors using a near-infrared fluorescently labeled clusterin binding peptide[J].Int JCancer，2012，131（5）：E681-E692.

Constructbreast carcinoma T7 phage disp lay cDNA library

ZHANG Tao1，SHIBaomin1，WANGhong2，CHENQueting2，JIKun1，YU Songlin1
1.DepartmentofSurgery，TongjiHospital，TongjiUniversity SchoolofMedicine，Shanghai 200065，China；
2.DepartmentofOncology Surgery，AffiliatedhospitalofHebeiUniversity，Baoding 031000，China

Ob jective To construct the breast carcinoma T7 phage display cDNA library，so the foundation for the screening of differentially expressed proteinswas laid.M ethods Firstly，fresh specimens of breast carcinomawas used to extract total RNA，separating and purifying ofmRNA.Then synthesis cDNA w as done.A t last，the packaging was connected in vitro and T7 phage display cDNA library was obtained.Resu lts The total RNA was tested，the result is A260/A280＝1.87.The purified mRNA is 4.0μg，A260/A280=1.91.The size of cDNA is 200－6000bp.The primary library capacity is 2×107pfu.Recombination rate of the library is 90％.The length of inserted fragments is 300－2000bp.Conclusions Phage display is an efficientmethod of protein function research.We constructed ahigh quality breast cancer phage display cDNA Library.The library can be used for screening tumormarkers，tumor vaccine，polypeptide drug development，targeted research，and so on.

Breastcancer；Phage display；cDNA library

R737.9

A

2095-378X（2015）01-0009-03

10.3969/j.issn.2095-378X.2015.01.003

張 濤（1972—），男，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，研究乳腺癌的臨床和基礎(chǔ)研究；電子信箱：Doctor.zt@163.com