睡蓮花多糖的超聲波提取工藝及其抗氧化活性研究

莫曉寧　李艾　余啟明　張金華　黃澤強(qiáng)　潘海燕　蔡錦源

[摘要]本研究旨在優(yōu)選睡蓮花多糖（NCP）的超聲波提取工藝，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行研究。以多糖得率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選NCP的超聲波提取工藝，對(duì)所制備的NCP進(jìn)行分級(jí)醇沉，測(cè)定NCP對(duì)超氧陰離子（O2）、羥基自由基（OH）和1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）的清除率，以評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性，并與熱水浸提法和超聲波常溫提取法進(jìn)行對(duì)比分析。研究結(jié)果表明，NCP的最佳提取工藝條件為料液比1：25（g/mL）、超聲波功率200W、提取溫度609C、提取時(shí)間30min，該工藝條件下，NCP得率為（2.08士0.04）%。NCP具有一定的抗氧化活性，以最優(yōu)工藝組合所制備的NCP抗氧化效果最佳，當(dāng)多糖濃度為1.0mg/mL時(shí)，NCP對(duì)DPPH、O2和OH清除率可達(dá)50.25%、56.17%和65.48%。分級(jí)醇沉及抗氧化活性對(duì)比分析結(jié)果表明，NCP主要成分為大分子多糖，且NCP的抗氧化活性主要由大分子多糖決定，最優(yōu)提取工藝條件下所制備的NCP的體外抗氧化活性優(yōu)于其他提取組合。超聲波提取法具有快速高效的特點(diǎn)，適用于NCP的提取分離，可獲得更好的提取效果和產(chǎn)品品質(zhì)。

[關(guān)鍵詞]睡蓮花;多糖;超聲波提取;抗氧化活性;分級(jí)醇沉

中圖分類號(hào)：TQ281

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20190421

睡蓮又稱“水百合”，全國(guó)各地均有分布，是學(xué)校、公園等場(chǎng)所的觀賞性植物。睡蓮花含有多酚、黃酮、多糖和氨基酸等化學(xué)成分，其單體成分主要有煙花苷、沒食子酸和紫云英苷11-41。已有研究表明，睡蓮花具有良好的抗氧化、降血糖、抑制酪氨酸酶和抗肝損傷等生物活性，在功能性食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景，但是尚未見睡蓮花多糖（NCP）的提取工藝及生物活性的研究報(bào)道（5-1]。本研究旨在以多糖得率和多糖純度的總評(píng)歸一值為指標(biāo)，優(yōu)選NCP的超聲波提取工藝，對(duì)所制備的多糖進(jìn)行分級(jí)醇沉，并采用超氧陰離子（02）、羥基自由基（OH）和1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）的清除率評(píng)價(jià)NCP的體外抗氧化活性，為NCP的綜合開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

睡蓮花（產(chǎn)地云南）：柳州聯(lián)華超市;無(wú)水葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇、石油醚、DPPH、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、過氧化氫、硫酸亞鐵和水楊酸等：分析純。

KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司;UV-2000紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司;TDL-80-2B低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠;CP225D型（1/10000）電子天平：德國(guó)Sartorius公司;CF-500K萬(wàn)能粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1提取工藝

NCP提取工藝：睡蓮花→恒溫烘干（609C）→粉碎過篩（60目）→石油醚回流脫脂→恒溫烘干（609C）→稱量（5g）→按比例加入超純水開展超聲波提取→抽濾→旋蒸濃縮→干燥至恒重（60°C）→睡蓮花粗多糖。

1.2.2睡蓮花多糖得率和純度計(jì)算

采用苯酚一硫酸法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得回歸方程為A=58.5455x+0.0356，R2=0.9996，即總糖濃度在0.0025～0.0175mg/mL時(shí)，線性關(guān)系良好[12-13].按方法“1.2.1”制備的睡蓮花粗多糖，稱重記錄粗多糖重量，記為m，再用蒸餾水復(fù)溶并定容，采用苯酚硫酸法測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算總糖濃度，多糖得率按式（1）計(jì)算，多糖純度按式（2）計(jì)算：

式中：x為多糖濃度，μg/mL;y為多糖得率，%;

W為投料質(zhì)量，g;m為粗多糖重量，g;Y為多糖純度，%;f為稀釋倍數(shù)。

1.2.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交表L，（34）對(duì)料液比、超聲波功率、提取溫度和提取時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素與水平見表1。

1.2.4睡蓮花多糖制備工藝條件對(duì)比

在優(yōu)選的最優(yōu)工藝條件下，開展熱水浴提取法（組合1）、超聲波常溫提取法（組合2）和超聲波熱水浴提取法（組合3）3種睡蓮花粗多糖的制備，并比較睡蓮花多糖得率和體外抗氧化活性。

1.2.5多糖分級(jí)醇沉

取粗多糖提取物復(fù)溶于一定量的蒸餾水中，加4倍體積無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉，離心分離后，所得醇沉產(chǎn)品采用蒸餾水復(fù)溶。采用蔡錦源等[131的方法對(duì)睡蓮花多糖進(jìn)行分級(jí)，以醇沉液中無(wú)水乙醇的體積分?jǐn)?shù)命名，所制備的多糖分別為L(zhǎng)en-40、Len-60和Len-80。

1.2.6體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

采用鄰苯三酚法、Fenton法和DPPH自由基法分別測(cè)定方法“1.2.1”制備的睡蓮花粗多糖和“1.2.5”制備的睡蓮花分級(jí)多糖，得出對(duì)02、0H和DPPH的清除率，考察NCP的體外抗氧化活性。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel、SPSS和Origin7.5等軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理。

2結(jié)果與分析

2.1正交試驗(yàn)結(jié)果

按表1進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4。據(jù)表3可知，以多糖得率為指標(biāo)，影響NCP超聲波提取工藝的順序大小為提取時(shí)間（D）>料液比（A）>提取溫度（C）>超聲波功率（B），最優(yōu)工藝組合為A，B3CD2，即料液比1：25（g/mL）、超聲波功率200W、提取溫度60°C、提取時(shí)間30min。據(jù)表4可知，提取時(shí)間對(duì)多糖得率有顯著影響（P<0.05），而液料比、超聲波功率和提取溫度對(duì)多糖得率影響不顯著（P>0.05）。按最優(yōu)工藝進(jìn)行3次提取，NCP得率為（2.08+0.04）%，均高于正交表的其他組合，表明實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)穩(wěn)定可行。

2.2NCP的提取方法比較

在最優(yōu)工藝的基礎(chǔ)上按表2開展實(shí)驗(yàn)，NCP的提取方法對(duì)比分析結(jié)果見表5。據(jù)表5可知，3種方法制備的NCP粗多糖，純度差異不大;在液料比、提取溫度和提取時(shí)間相同的條件下，組合3的NCP得率比組合1提高了35.06%，即應(yīng)用超聲波可使NCP快速溶出，從而提高NCP得率;在液料比、超聲波功率和提取時(shí)間相同的條件下，組合3.的NCP得率也較組合2提高了18.18%，即提高提取溫度，也同樣有利于提高NCP溶出，從而提高NCP得率。綜合分析表明，與其他兩種提取方法比較，超聲波熱水浴提取法對(duì)NCP的提取具有明顯優(yōu)勢(shì)。

2.3NCP的抗氧化活性

按方法“1.2.6"測(cè)定3個(gè)組合相同多糖質(zhì)量濃度（1.0mg/mL）對(duì)DPPH、02～和OH的清除作用，結(jié)果見圖1。據(jù)圖1可知，不同組合提取的NCP對(duì)DPPH、02和OH均有一定清除作用，清除效果大小依次為組合3>組合2>組合1，表明組合3的NCP抗氧化活性較佳，對(duì)DPPH、02～和OH清除最高可達(dá)50.25%、56.17%和65.48%，即提取組合以組合3更優(yōu)。導(dǎo)致該結(jié)果的原因可能是不同工藝組合所制備的多糖存在成分差異。

2.4NCP的分級(jí)醇沉

按方法“1.2.5”對(duì)表5的3種提取方法所制備的睡蓮花粗多糖進(jìn)行分級(jí)醇沉，結(jié)果見表6。據(jù)表6可知，3種組合所制備的NCP成分存在差異，分級(jí)后各多糖成分含量順序均為L(zhǎng)en-40>Len-60>Len-80，表明NCP以大分子多糖為主要成分。對(duì)比組合1和組合2以及組合2和組合3可知，提高提取溫度和超聲波功率，可明顯提高Len-40含量，即有利于大分子多糖化合物溶出。

2.5不同分級(jí)睡蓮花多糖的抗氧化活性比較

按方法“1.2.6”測(cè)定組合3相同質(zhì)量濃度（1.0mg/mL）Len-40、Len-60和Len-80對(duì)DPPH、02～和OH清除作用，結(jié)果見圖2。據(jù)圖2可知，各分級(jí)多糖對(duì)DPPH、02～和OH清除能力大小排序均為L(zhǎng)en-40>Len-60>Len-80，與蔡錦源等[13-14]的研究一致，即大分子多糖抗氧化活性較小分子多糖強(qiáng)。結(jié)合表6分析，NCP的抗氧化活性由大分子多糖決定，同時(shí)也印證了圖1中組合3所制備的NCP對(duì)DPPH、02～和OH清除能力優(yōu)于組合2和組合1。

3結(jié)論

采用多糖得率指標(biāo)、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選NCP的超聲波提取工藝，最佳工藝組合為料液比1：25（g/mL）、超聲波功率200W、提取溫度60C、提取時(shí)間30min，該工藝條件下，睡蓮花多糖得率為（2.08+0.04）%。NCP的抗氧化活性研究表明，NCP具有一定的抗氧化活性，以O(shè)D值優(yōu)選的工藝組合抗氧化效果最佳，當(dāng)多糖濃度為1.0mg/mL時(shí)，NCP對(duì)DPPH、02～和OH清除率為別為50.25%、56.17%和65.48%。分級(jí)醇沉及抗氧化活性的對(duì)比分析結(jié)果表明NCP的主要成分為大分子多糖，且NCP的抗氧化活性主要由大分子多糖決定。3種提取方法制備的NCP，在得率和組成成分上均存在差異，本文優(yōu)選的超聲波提取工藝（組合3）所制備的NCP對(duì)DPPH、O2～和OH清除能力優(yōu)于其他兩種方法。超聲波提取法具有快速高效的特點(diǎn)，適用于NCP的制備，可獲得更好的提取效果和產(chǎn)品品質(zhì)。

參考文獻(xiàn)

[1]買吾拉江·阿不都熱衣木，李晨陽(yáng)，李倩，等。高速逆流色譜分離純化雪白睡蓮花中的酚類成分[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016（21）：107-109.

[2]金曉紅，耿偉，桂紅武.睡蓮花總黃酮超聲提取工藝研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011（11）：1487-1489.

[3]買吾拉江·阿不都熱衣木，李倩，王亮，等.HPLC法測(cè)定睡蓮花中煙花苷和紫云英苷的含量[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2016（20）：20-22.

[4]李潔，張雪佳，李柯翱，等.HPLC測(cè)定維藥睡蓮花中沒食子酸和煙花苷含量[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2014（8）：92-94.

[5]劉瑞凝，王偉，謝偉東，等。雪白睡蓮花中黃酮類成分抗氧化

及擬缺血對(duì)神經(jīng)細(xì)胞作用的研究[J].世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2006（5）：33-36.

[6]景贊，曾維才，黃毅娜，等。藍(lán)睡蓮多酚類物質(zhì)抗氧化與降糖作用的研究[J].食品科技，2010（7）：237-241.

[7]李倩，李晨陽(yáng)，詹羽嬌，等。睡蓮花提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制

作用及其動(dòng)力學(xué)研究[J].日用化學(xué)工業(yè)，2017（4）：219-223.

[8]麥爾旦·吐爾遜麥麥提，劉濤，李晨陽(yáng)，等。睡蓮花isostric-tiniin對(duì)CCI4致小鼠急性肝損傷防護(hù)作用及其體外抗氧化活性研究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2018（3）：321-325.

[9]王雪，楊巧麗，趙軍，等。睡蓮花提取物對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用研究[J].中藥材，2015（1）：139-142.

[10]馬俊飛，張石蕾，呂梅霞，等。睡蓮花煙花苷對(duì)半乳糖胺致

小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[J].癌變·畸變·突變，2017（5）：370-373.

[11]張石蕾，由淑萍，劉濤，等.睡蓮花總黃酮對(duì)四氯化碳致小鼠

急性肝損傷的防治作用[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2016（12）：165-168.

?[12]蔡錦源，熊建文，黃燕芬，等。白及多糖的超聲——微波協(xié)同提取工藝及其抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技，2016（22）：274-278.

[13]蔡錦源，朱熾雄，孫松，等.香菇多糖的微波預(yù)處理——超聲波提取工藝及其抗氧化活性研究[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016（4）：84-90.

[14]黃磊。香菇多糖抗氧化及其抗真菌機(jī)制初步研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（20）：114-116.

[15]朱贊豪，陳哲，何東平，等。超聲波輔助提取油茶籽粕中蛋白的工藝研究[J].糧食科技與經(jīng)濟(jì)，2014（4）：53-56.

[16]蒲靈操，黃群，袁瑤，等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取瓜蔞籽蛋白工藝研究[J].糧食科技與經(jīng)濟(jì)，2013（5）：56-60.