北烏頭組培快繁技術體系初步研究

宋子龍 王峰潔 宋彩民

摘要：? 本文對北烏頭組培快繁技術體系進行了初步研究，同時比較了不同外源激素組合對北烏頭外植體誘導的影響，其結(jié)果表明：北烏頭愈傷組織誘導最佳外植體為葉片，叢生芽誘導最佳外植體為帶芽莖段及莖尖，愈傷組織誘導最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D，叢生芽誘導最適合培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA，繼代培養(yǎng)以WPM+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA效果最為顯著，增殖率在4倍以上;北烏頭生根最佳培養(yǎng)基為1/2MS+0.1 mg/L NAA，生根率可到90%。

關鍵詞：? 北烏頭;? 組織培養(yǎng);? 快速繁殖

北烏頭（Aconitum kusnezoffii）為毛茛科多年生草本植物，多分布在我國東北及華北地區(qū)。北烏頭花大色美，具有較好的觀賞價值;塊根富含各種烏頭堿，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)痙、祛風濕和解熱等作用;從烏頭堿中提取出來的雙脂型生物堿毒性大，可作為新型的植物性殺蟲劑，開發(fā)前景廣闊[ 1 - 4 ]。目前，北烏頭人工栽培少，加上野生資源有限，且產(chǎn)量和質(zhì)量都較低，因此本文對其進行組織培養(yǎng)技術研究，以期為建立北烏頭組織培養(yǎng)技術體系，提供大量的人工苗，為開發(fā)新型的植物性殺蟲劑和增加觀賞花卉種類奠定基礎。

1 材料及方法

1. 1 試驗材料

秋季采集北烏頭塊根栽植于花盆中，放在試驗室培養(yǎng)，待植株長到20 cm左右時進行試驗。

1. 2 試驗方法

分別采用不同消毒時間、不同外植體和不同培養(yǎng)基對北烏頭組織培養(yǎng)技術體系進行初步研究。

1. 2. 1 最適消毒時間的選擇

將莖尖用清水沖洗干凈后，置于無菌超凈工作臺上，然后放置在0.1% HgCl2中進行滅菌，浸泡時間分別為2、4、6、8、10 min，然后用無菌水沖洗4～5次，并反復搖動以徹底洗掉HgCl2，防止對外植體的毒害作用。將消毒過的外植體接種到啟動培養(yǎng)基上，每個處理10瓶，2次重復，統(tǒng)計污染率、死亡率及存活率。

1. 2. 2 最佳外植體的選擇

選取帶芽點塊根、嫩芽、莖尖、莖段、葉片和葉柄6種外植體。將帶芽點塊根清洗干凈，去掉外表皮，切成1 cm×1 cm的小塊;嫩芽剝掉外皮，清洗干凈待用;莖尖、莖段及葉柄剪成1.5～2 cm待用;葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的方塊待用;所有外植體滅菌后均接種到MS培養(yǎng)基上，定期觀察外植體生長分化情況。

1. 2. 3 啟動培養(yǎng)基的篩選

以MS為基本培養(yǎng)基，將滅菌過的外植體接種到MS培養(yǎng)基上，附加不同濃度激素（6-1.0 mg/LBA+? ?1.0 mg/L2.4-D、2.0 mg/L6-BA+1.0 mg/L2.4-D、1.0 mg/L? 6-BA+0.2 mg/LNAA、2.0 mg/L6-BA+0.2 mg/LNAA、 1.0 mg/LTDZ+1.0 mg/L2.4-D、2.0 mg/LTDZ+1.0 mg/L 2.4-D、1.0 mg/LTDZ+0.2 mg/LNAA、0.2 mg/LTDZ+? 0.2 mg/LNAA），蔗糖為20 g/L，pH為5.8。每瓶接種一個外植體，每個處理25瓶，注意觀察記錄生長分化情況，從而探索北烏頭啟動培養(yǎng)基的最佳外源激素組合。

1. 2. 4 繼代培養(yǎng)基的篩選

分別以MS、WPM為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的外源激素（表1），蔗糖為20 g/L，瓊脂為7 g/L，pH為5.8，探索北烏頭繼代培養(yǎng)的最佳外源激素組合。

1. 2. 5 生根培養(yǎng)基的篩選

將伸長后的芽苗接種到生根培養(yǎng)基上，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，加入不同濃度的（0.1 mg/L、0.3 mg/L）NAA和IBA（0.1 mg/L、0.3 mg/L），比較NAA及IBA對北烏頭生根的影響。

1. 3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度（23±1）℃，光照時間10 h/天，光照強度1 500～2 000 lx。

2 結(jié)果與分析

2. 1 最適消毒時間的選擇

從不同滅菌時間對北烏頭滅菌效果的影響（圖1）可知：滅菌時間的長短對北烏頭外植體有較大的影響。當滅菌時間為2 min時，污染率較高，死亡率和存活率較低;當滅菌時間為10 min時，死亡率較高，污染率和存活率較低;當滅菌時間為6 min時，存活率到達80%;4 min次之，存活率為75%;所以最適消毒時間應選用4～6 min。

2. 2 最佳外植體的選擇

由不同外植體的培養(yǎng)情況（表2）可知：在相同培養(yǎng)條件下，各外植體的污染及分化情況各不相同。莖尖及莖段不易發(fā)生褐變，葉腋處可以直接產(chǎn)生新芽且分化率較高，適合作為外植體;葉片易形成愈傷組織且長勢良好，適合進行下一步培養(yǎng)。

2. 3 啟動培養(yǎng)基選擇

由不同外源激素組合對外植體誘導的影響（表3）可知：從平均誘導率來看，以MS+1.0 mg/L

6-BA+0.2 mg/LNAA最高，達76%，其小苗健壯，葉片濃綠，分化系數(shù)為5，愈傷組織生長良好;其次為MS+1.0 mg/L6-BA+1.0 mg/L2.4-D，平均誘導率為72%，愈傷組織生長情況最好。細胞分裂素6-BA與TDZ比較來看，以6-BA誘導效果較好，且都是以低濃度的效果為佳;生長素2.4-D對愈傷組織的形成起著至關重要的作用，而NAA對于芽的生長效果較好。

2. 4 繼代培養(yǎng)基選擇

將初代培養(yǎng)的芽苗及愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)，綜合基本培養(yǎng)基繼代情況及初代芽苗生長情況，對分裂素6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L）及生長素NAA（0.5、

1.0、2.0 mg/L）、IBA（0.5、1.0、2.0 mg/L）組合進行了再次篩選，其中1.0 mg/L6-BA+0.5 mg/LIBA效果最好;比較了MS與WPM培養(yǎng)基的分化情況（表4）可以看出：愈傷組織及叢生芽分化的情況均以WPM效果較好。因此，北烏頭繼代培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為WPM+1.0 mg/L6-BA+0.5 mg/LIBA，平均增殖率在4倍以上。

2. 5 生根培養(yǎng)

北烏頭生根培養(yǎng)基以0.1 mg/LNAA生根效果最佳，10天左右開始生根，平均生根率達到90%，添加IBA的培養(yǎng)基沒有生根，這與關文靈等的研究略有不同[ 5 ]。

3 結(jié)論與討論

3. 1 北烏頭愈傷組織誘導最佳外植體為葉片，易產(chǎn)生愈傷組織，但褐化現(xiàn)象比較嚴重，這與林靜、何毅對烏頭組培快繁的技術研究結(jié)果一致[ 6 ]。為了降低褐化率，在誘導初期可縮短轉(zhuǎn)瓶時間，加快轉(zhuǎn)接頻率，添加活性炭或抗褐化劑進行抑制[ 7 ]。

3. 2 最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L6-BA+0.2 mg/LNAA，叢生芽誘導以莖段及莖尖較好，在培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L6-BA+1.0 mg/L2.4-D，上長勢最佳。

3. 3 繼代培養(yǎng)以WPM+1.0 mg/L6-BA+0.5 mg/LIBA效果最為顯著，平均增殖率在4倍以上。

3. 4 北烏頭生根最佳培養(yǎng)基為1/2MS+0.1 mg/LNAA，生根率可到90%。

3. 5 北烏頭在培養(yǎng)過程中，褐化現(xiàn)象較為嚴重，尤其初期誘導時期，可縮短轉(zhuǎn)瓶時間以降低褐化率;誘導時期MS培養(yǎng)基效果較好，但是繼代培養(yǎng)效果不如WPM培養(yǎng)基，可能是MS培養(yǎng)基無機鹽濃度較高的緣故。

參考文獻

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