不同凍存條件對(duì)甘蔗原生質(zhì)體活力和再生能力的影響

李素麗 宋亞妮 李志剛 劉芳君

摘 要：為了獲得活力高和再生能力強(qiáng)的甘蔗原生質(zhì)體，該文對(duì)甘蔗原生質(zhì)體的凍存液濃度、凍存溫度和凍存部位進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：（1）不同的凍存液、不同的凍存溫度和不同的取材部位原生質(zhì)體凍存后復(fù)蘇對(duì)甘蔗原生質(zhì)體的活力影響有顯著差異性，三個(gè)凍存液組合比較，在組合2（70%培養(yǎng)基+20%血清+10%dMSO），凍存30d后復(fù)蘇活力最強(qiáng)，高達(dá)72%;凍存90d內(nèi)復(fù)蘇，-196 ℃液氮和-80 ℃冰箱凍存，甘蔗原生質(zhì)體的活力差異不顯著，活力均在75%以上，但90d凍存后復(fù)蘇，-196 ℃液氮凍存后復(fù)蘇比-80 ℃冰箱凍存凍存后復(fù)蘇原生質(zhì)活力強(qiáng);不同取材部位比較，幼葉凍存30d后復(fù)蘇所得原生質(zhì)體活力較高（達(dá)79.2%），莖尖凍存30d后復(fù)蘇所得原生質(zhì)體活力僅為42.7%。（2）不同的凍存液和不同的凍存溫度，細(xì)胞第一次啟動(dòng)分裂和形成細(xì)胞團(tuán)的時(shí)間差異不顯著，一般培養(yǎng)5～6d，細(xì)胞壁基本形成完整，培養(yǎng)6d后，細(xì)胞啟動(dòng)分裂，培養(yǎng)15d后形成細(xì)胞團(tuán)。不同的材料部位相比較，莖尖酶解所得原生質(zhì)體再生能力最強(qiáng)，較幼葉酶解原生質(zhì)體，形成細(xì)胞壁的時(shí)間早3d，第一次分裂時(shí)間早2d。

關(guān)鍵詞：甘蔗， 原生質(zhì)體，凍存， 活力， 再生

中圖分類號(hào)：Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2019）04-0427-10

Abstract：In order to obtain high vitality and regeneration ability of sugarcane protoplast， this experiment wasdone to study the protoplast of frozen storage liquid combination， frozen storage temperature， frozen storage time and recovery temperature. The results were as follows：（1）different cryopreservations，different cryopreservation temperatures anddifferent protoplast sources ofdifferent materials had significantdifferences on the vitality of the protoplast of sugarcane. Compared with the combination of three frozen liquiddeposits， in Combination 2 （70% medium +20% serum +10%dMSO）， the recovery activity was the strongest after 30d， as high as 72%. Cryopreserved recovery within 90d， liquid nitrogen -80 ℃ and -196 ℃ freezer， sugarcane protoplast energydifference was not significant， and the vigor was above 75%. But after 90d of frozen-storage， the protoplastdynamic at -196 ℃ was stronger than -80 ℃ after recovery. Fordifferent materials， the protoplastdynamic of the young leaves frozen stored for 30d was up to 79.2%， and the protoplastdynamic of stem tip frozen for 30d was only 42.7%. （2） There was no significantdifference in the time between the first initiation ofdivision and the formation of cell mass in the treatments withdifferent cryopreservation liquids anddifferent cryopreservation temperatures. After the protoplasts were cultured for about 5-6d， the cell wall was basically complete， and the cells began todivide after 6d， and the cell masses formed after 15d of culture. Fordifferent materials， the strongest regeneration ability was found in the protoplasts from stem tip by enzymatic hydrolysis， which cell wall formation showed 3d earlier， and 2d earlier in the first celldivision than those from the juvenile leaves.

Key words：sugarcane， protoplast， frozen storage， vatality， regeneration

植物體細(xì)胞融合育種，是根據(jù)細(xì)胞的全能性和細(xì)胞膜的流動(dòng)性原理，用酶解法去除細(xì)胞壁，先將植物不同種、屬，甚至科間的原生質(zhì)體通過人工方法誘導(dǎo)融合，然后進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其再生雜合體植株的技術(shù)。其打破了有性雜交不親和性的界限，廣泛地組合各種基因型，從而形成有性雜交方法所無法獲得的新型雜合體植株，而且細(xì)胞融合技術(shù)避免了分離、提純、剪切、拼接等基因操作，轉(zhuǎn)移的基因基本不存在基因安全性問題，因?yàn)楸晦D(zhuǎn)移的基因本身存在于甘蔗中，在技術(shù)和儀器設(shè)備上的要求不像基因工程那樣復(fù)雜，投資少，有利于廣泛開展研究和推廣（李志勇，2003），加之體細(xì)胞雜交來自雙親的遺傳物質(zhì)并非簡(jiǎn)單的堆積，而是發(fā)生了復(fù)雜的遺傳重組，這正是改良作物所期望的。植物體細(xì)胞融合育種是改造細(xì)胞遺傳物質(zhì)的有力手段，有著重大的實(shí)踐意義。

原生質(zhì)體是體細(xì)胞融合的必需材料，同時(shí)還可以用于突變體篩選和遺傳轉(zhuǎn)化等研究，是科學(xué)研究的理想材料。由于植物材料的獲得受季節(jié)和植物生長(zhǎng)發(fā)育階段的影響，導(dǎo)致原生質(zhì)體融合育種等實(shí)驗(yàn)也會(huì)受到以上因素的限制，實(shí)驗(yàn)不能隨時(shí)隨地進(jìn)行。當(dāng)前國(guó)內(nèi)對(duì)原生質(zhì)體的獲得，大多數(shù)是及時(shí)采樣并且及時(shí)酶解。這樣做的缺點(diǎn)是：酶解耗時(shí)長(zhǎng);未用完的原生質(zhì)體只能培養(yǎng)或者丟棄，效率低;材料的季節(jié)性導(dǎo)致有些季節(jié)實(shí)驗(yàn)因沒有材料而擱置（莊春慧，2015）。原生質(zhì)體凍存技術(shù)可以很好地解決這些問題。超低溫條件能夠較好保存種質(zhì)資源。隨著原生質(zhì)體再生植株種類的不斷增多，玉米、水稻、小麥等禾谷類的主要農(nóng)作物的原生質(zhì)體也成為種質(zhì)保存的重要材料（Takeuchi et al.， 1982）。凍存過程對(duì)原生質(zhì)體的主要傷害是冰晶刺破的傷害，二甲基亞砜（DMSO）是一種高效的滲透性保護(hù)劑，可迅速滲透細(xì)胞，降低細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞液冰點(diǎn)是低溫保護(hù)劑，它易于透入細(xì)胞內(nèi)部，使之不至于在細(xì)胞凍融時(shí)因強(qiáng)烈脫水而損傷（黃玲，2011）。目前，許多實(shí)驗(yàn)室廣泛采用dMSO作凍存保護(hù)劑，除了價(jià)格低廉、保護(hù)效果良好外，DMSO 另一特點(diǎn)是很容易洗脫干凈（呂維敏等，2014）。但不同濃度DMSO會(huì)觸發(fā)凍存細(xì)胞復(fù)蘇后大量細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞有一定的毒害作用（李中文等，2016）。如何優(yōu)化植物原生質(zhì)體凍存條件，降低凍存試劑的毒性作用，改善凍存效果，最大程度保留原生質(zhì)體的生物學(xué)特性是體細(xì)胞融合育種順利進(jìn)行的重要環(huán)節(jié)之一。

甘蔗是我國(guó)食糖工業(yè)的重要支柱，也是能源、纖維、糖基化工和飼料的原料，作為再生能源作物，甘蔗有很大的潛力。然而蔗糖生產(chǎn)中存在著糖料蔗品種單一，選育的新品種不能滿足甘蔗生產(chǎn)需求等問題，嚴(yán)重影響了蔗糖業(yè)健康穩(wěn)定發(fā)展和競(jìng)爭(zhēng)能力的進(jìn)一步提高。因此，增強(qiáng)甘蔗育種的創(chuàng)新力度，提供更多優(yōu)良的甘蔗品種已成為糖業(yè)發(fā)展，乃至經(jīng)濟(jì)發(fā)展急需解決的問題。由于甘蔗的生長(zhǎng)受季節(jié)和地域性的限制，如果缺乏合適的甘蔗原生質(zhì)體凍存方法，會(huì)導(dǎo)致甘蔗原生質(zhì)體融合育種研究不在甘蔗生長(zhǎng)季節(jié)和亞熱帶地區(qū)時(shí)，找不到研究材料，而在生長(zhǎng)季節(jié)時(shí)大量的實(shí)驗(yàn)材料因無法得到及時(shí)利用和長(zhǎng)期保存而被浪費(fèi)，極大地限制了甘蔗體融合育種研究順利進(jìn)行。本研究針對(duì)以上問題，研究了不同的凍存液、不同的凍存溫度和不同的取材部位甘蔗原生質(zhì)體凍存后復(fù)蘇對(duì)活力和再生能力的影響，為后期甘蔗原生質(zhì)體的融合育種以及以甘蔗原生質(zhì)體為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化等研究提供儲(chǔ)備材料。旨在為甘蔗原生質(zhì)體的超低溫保存提供科學(xué)依據(jù)，為體細(xì)胞融合育種、遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)基因提供材料和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

采取黃玲（2011）所用幼葉分離原生質(zhì)體的方法獲得新臺(tái)糖22號(hào)甘蔗原生質(zhì)體。甘蔗材料來自廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院甘蔗實(shí)驗(yàn)基地。所用酶液組合為2%纖維素酶+0.5%果膠酶+0.1%離析酶+0.3%半纖維素酶。所用洗液為CPW（含9%甘露醇）。酶液和洗液的pH均為5.8。

1.2 方法

1.2.1 不同甘蔗材料部位及其酶解方法 選取甘蔗ROC22號(hào)伸長(zhǎng)初期的莖尖和幼葉作為研究材料。

1.2.1.1 甘蔗幼葉的酶解方法 參考黃玲（2011）所用幼葉分離原生質(zhì)體的方法，稍有改動(dòng)。以健壯甘蔗尾鞘作為幼葉酶解材料，先剝?nèi)ネ饷?～3層葉鞘，然后用75%酒精滅菌30 s，無菌水清洗3次后，再切除外層和兩端葉鞘，漏出淡黃色心葉，并留下生長(zhǎng)點(diǎn)以上1～5 cm嫩葉，切成厚度為1 mm左右的薄片，收集幼葉0.5 g，加入5 mL CPW（含13%甘露醇）溶液，使材料質(zhì)壁分離0.5～1 h后，除去CPW（含13%甘露醇）溶液，加入5 mL組合酶液常溫酶解4 h，然后分別過100目、200目細(xì)胞篩，收集原生質(zhì)體懸浮液，梯度離心純化原生質(zhì)體，所得原生質(zhì)體為幼葉原生質(zhì)體。

1.2.1.2 甘蔗莖尖的酶解方法 參考洪翠（2000）所用甘蔗莖尖分離原生質(zhì)體的方法，稍有改動(dòng)。取伸長(zhǎng)初期的甘蔗莖尖，剝?nèi)ビ兹~，然后用75%酒精滅菌30 s，無菌水清洗3次后，再切除外層和兩端葉鞘，將包裹生長(zhǎng)錐的幾片大的幼葉剝?nèi)?，僅保留生長(zhǎng)錐附近的第3天至第6片幼葉或葉原基。將甘蔗莖尖修成1 cm×1 cm×2 cm的組織塊，其中包括幼葉原基、生長(zhǎng)錐、伸長(zhǎng)區(qū)的初生增粗分生組織和部分成熟區(qū)，將莖尖切成1 mm左右的薄片，加入5 mL CPW（含13%甘露醇）溶液，使材料質(zhì)壁分離0.5～1 h后，除去CPW（含13%甘露醇）溶液，加入5 mL組合酶液常溫酶解4 h，分別過100目、200目細(xì)胞篩，收集原生質(zhì)體懸浮液，梯度離心純化原生質(zhì)體，所得原生質(zhì)體為莖尖原生質(zhì)體。

1.2.2 不同凍存液組合設(shè)計(jì)和凍存方法 用KM8P培養(yǎng)基、BSA（小牛血清蛋白）以及不同濃度的DMSO（二甲基亞砜）組合成不同的凍存液，所做設(shè)計(jì)為組合1（75%培養(yǎng)基+20%BSA+5%DMSO）、組合2（70%培養(yǎng)基+20%BSA+10%DMSO）、組合3（65%培養(yǎng)基+20%BSA+15%DMSO）。

將酶解的原生質(zhì)體用細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)密度至每mL為1×106個(gè)，設(shè)3個(gè)處理溫度（4 ℃，-80 ℃，-196 ℃），每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。每只凍存管內(nèi)放細(xì)胞懸液200 μL，分別凍存7、30、60、90d后復(fù)蘇，觀察原生質(zhì)體的活力和培養(yǎng)觀察再生能力。

采用緩慢凍存的方法，將裝有細(xì)胞懸液的凍存管首先放入4 ℃，約40 min;之后置于-20 ℃， 30～60 min;再置于-80 ℃放置過夜;最后置于液氮罐 -196 ℃中長(zhǎng)期保存。

1.2.3 甘蔗原生質(zhì)體的復(fù)蘇方法 采用快速化凍的方法，從液氮罐或-80 ℃冰箱中取出凍存管快速放入37 ℃的恒溫水浴鍋中不斷搖晃，使其快速解凍，然后離心棄掉凍存液，CPW（含9%甘露醇）清洗三遍，加KM8P培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.4 甘蔗原生質(zhì)體的活力測(cè)定 參考李玉珠（2012）的方法制備4%臺(tái)盼藍(lán)母液：稱取4 g臺(tái)盼藍(lán)，加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100 mL，用濾紙過濾，4 ℃保存。使用時(shí)，用PBS稀釋至0.4%（Widholm， 1972）。測(cè)定時(shí)，被染藍(lán)色即為死細(xì)胞。

原生質(zhì)體活力=（有活力的原生質(zhì)體/數(shù)原生質(zhì)體總數(shù)）×100%。

1.2.5 甘蔗原生質(zhì)體細(xì)胞壁的觀察 參考柳琳等（2014）的方法，將熒光增白劑VBL溶于用無離子水配制的pH5.8的9%CPW中，使成0.1%濃度，待完全溶解后，于85×g離心10 min，去沉淀雜質(zhì)，用上清液（黃祥輝和顏季瓊，1980）。

向原生質(zhì)體懸浮液中加入等體積的 VBL染色液，溫下靜置染色5 min，9% CPW溶液清洗3～4次，浮于9% CPW溶液中。吸取適量染色后的懸浮液滴于載玻片上，于波長(zhǎng)345 nm、倍數(shù)100倍的熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞壁的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)原生質(zhì)體活力的影響

2.1.1 不同的凍存液組合對(duì)甘蔗原生體活力的影響 從表1和圖版I可以看出，在用緩慢凍存的方式凍存不同時(shí)間段后，在三種凍存液組合中凍存的甘蔗原生質(zhì)體和凍存前比活力都會(huì)有所降低，降低幅度總體表現(xiàn)為組合1 （75%培養(yǎng)基+20%小牛血清蛋白+5%dMSO）>組合3（65%培養(yǎng)基+20%小牛血清蛋白+15%dMSO）>組合2 （70%培養(yǎng)基+20%小牛血清蛋白+10%dMSO），不同組合之間原生質(zhì)體活力差異顯著。最佳的凍存液為組合2（70%培養(yǎng)基+20%小牛血清蛋白+10%dMSO），凍存后7d復(fù)蘇，組合2原生質(zhì)體活力比組合1高27.69%，比組合3高18.43%;凍存后30d復(fù)蘇，組合2原生質(zhì)體活力比組合1高27.13%，比組合3高16.17%;凍存后90d復(fù)蘇，組合2原生質(zhì)體活力比組合1高28.45%，比組合3高18.36%。

2.1.2 不同的取材部位對(duì)甘蔗原生質(zhì)體活力的影響 由表2和圖版Ⅱ可知，在對(duì)幼葉和莖尖酶解后，分別凍存7、15、30d后復(fù)蘇，幼葉的活力均顯著高于莖尖，分別比莖尖高35.91%、37.56%和36.5%。凍存7d后復(fù)蘇，幼葉和莖尖活力降低10%左右，差異顯著。分別凍存7、15、30d后復(fù)蘇，幼葉和莖尖活力降低差異不顯著。

2.1.3 不同的凍存溫度對(duì)甘蔗原生質(zhì)體活力的影響 由圖1可知，凍存7d后復(fù)蘇，不同凍存溫度（4、-80、-196 ℃）之間，原生質(zhì)體活力差異不顯著;凍存30d和60d后復(fù)蘇，-80 ℃和-196 ℃中復(fù)蘇的原生質(zhì)體活力差異不顯著，但顯著高于4 ℃處理，分別高40%和60%，達(dá)到顯著性差異;凍存90d后復(fù)蘇， -196 ℃原生質(zhì)體活力最高， 4 ℃處理最低，-196 ℃中復(fù)蘇的原生質(zhì)體活力較-80 ℃處理高22.81%，較4 ℃處理高71.37%，差異顯著。處理時(shí)間對(duì)在液氮-196 ℃中凍存的原生質(zhì)體活力影響不顯著。

2.2 不同處理對(duì)甘蔗原生質(zhì)體細(xì)胞壁再生的影響

2.2.1 不同凍存液組合對(duì)甘蔗原生體細(xì)胞壁形成的影響 細(xì)胞壁的形成是一個(gè)逐漸形成的過程，整個(gè)再生過程中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度由弱變強(qiáng)。凍存30d后復(fù)蘇培養(yǎng)，不同凍存液組合對(duì)細(xì)胞壁形成的影響差異不顯著，原生質(zhì)體培養(yǎng)1d于熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞周圍均無藍(lán)色熒光，說明培養(yǎng)1d沒有形成細(xì)胞壁（圖版Ⅲ：A）;培養(yǎng)2～3d之后，在熒光顯微鏡下可看到由于VBL和細(xì)胞壁的纖維素結(jié)合而在細(xì)胞周圍開始發(fā)出淡藍(lán)色的熒光 （圖版Ⅲ：B）; 培養(yǎng)5～6d， 在熒光顯微鏡下觀察到整個(gè)細(xì)胞邊緣藍(lán)色熒光均勻、強(qiáng)烈且明顯（圖版Ⅲ：C），表明細(xì)胞壁在逐漸形成，5d左右基本形成完整。

2.2.2 不同取材部位對(duì)甘蔗細(xì)胞壁再生的影響 凍存30d后復(fù)蘇培養(yǎng)，在第3天至第4天的時(shí)候，莖尖細(xì)胞壁形成完整，而幼葉在第5天至第6天的時(shí)候才觀察到細(xì)胞壁形成，莖尖細(xì)胞壁早形成幼葉。但是形成細(xì)胞壁的過程并無差異（圖版IV）。

2.2.3 不同凍存溫度對(duì)甘蔗原生體細(xì)胞壁形成的影響 在后期的細(xì)胞壁形成過程中，凍存于4、-80、-196 ℃的原生質(zhì)體形成細(xì)胞壁的時(shí)間上無顯著差異，培養(yǎng)1d沒有形成細(xì)胞壁（圖版Ⅴ：A），培養(yǎng)2～3d之后，在熒光顯微鏡下可看到細(xì)胞周圍開始發(fā)出淡藍(lán)色的熒光（圖版Ⅴ：B），培養(yǎng)5～6d左右可以在熒光顯微鏡下觀察整個(gè)細(xì)胞邊緣藍(lán)色熒光均勻、強(qiáng)烈且明顯（圖版Ⅴ：C）。

2.3 不同處理對(duì)甘蔗原生質(zhì)體細(xì)胞分裂的影響

2.3.1 不同凍存液組合對(duì)甘蔗細(xì)胞分裂的影響 凍存90d后，復(fù)蘇觀察。結(jié)果表明不同的凍存液組合凍存90d后，原生質(zhì)體復(fù)蘇啟動(dòng)分裂的時(shí)間并無差別，培養(yǎng)0d三個(gè)組合的原生質(zhì)體都未觀察到細(xì)胞分裂相，原生質(zhì)體呈圓球形，細(xì)胞膜邊緣清晰（圖版Ⅵ：A）。培養(yǎng)6d后，細(xì)胞分裂相增多，出現(xiàn)較多的第一次細(xì)胞分裂（圖版Ⅵ：B）培養(yǎng)第15天左右，視野中出現(xiàn)少量細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞排列緊密（圖版Ⅵ：C）。

2.3.2不同取材部位對(duì)甘蔗原生體細(xì)胞分裂的影響 由表3和圖版Ⅶ可知，莖尖比幼葉更早啟動(dòng)分裂，且差異顯著。第一次分裂，莖尖比幼葉早2d，第二次分裂，莖尖比幼葉早3d，形成小細(xì)胞團(tuán)所需時(shí)間比幼葉早5d，形成小愈傷所需時(shí)間比幼葉早10d，但分裂過程并無差異。

2.3.3 不同凍存溫度對(duì)甘蔗原生質(zhì)體細(xì)胞分裂的影響 不同凍存溫度對(duì)第一次分裂啟動(dòng)時(shí)間都是7d左右，差異不顯著，培養(yǎng)一周后可觀察到原生質(zhì)體第一次分裂（圖版Ⅷ：A，B，C）。

3 討論

DMSO（二甲基亞砜）是超低溫保存中常用的一種高效的滲透性低溫保護(hù)劑，在常溫下dMSO 對(duì)細(xì)胞有輕度藥害，但隨著溫度的降低， 藥害作用也隨之減?。▍尉S敏等，2014）。

在凍存時(shí)不同植物最適合DMSO濃度的不同，林小園（2014）發(fā)現(xiàn)DMSO濃度為15%時(shí)，小球藻活力最高。薛建平（2004）在地黃試管塊根誘導(dǎo)及莖尖玻瑞化法超低溫保存的研究表明DMSO濃度為5%，復(fù)蘇后活力最高，達(dá)65%。本研究發(fā)現(xiàn)不同的凍存液組合對(duì)甘蔗原生質(zhì)體活力影響差異顯著，最適合甘蔗原生質(zhì)體的凍存液組合是組合2（70%培養(yǎng)基+20% BSA+10%dMSO），在此凍存液中原生質(zhì)體的活力最高。組合2優(yōu)于組合1和組合3，可能原因是5%dMSO濃度過低，起不到充分保護(hù)的作用，造成細(xì)胞細(xì)胞被冰晶刺破，而15%dMSO濃度又過高，可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了毒害作用，造成細(xì)胞的活力下降。程斐（2009）對(duì)二橋槐的凍存液研究結(jié)果為10%dMSO+0.5 mo1·L-1蔗糖+10%（w/v）聚乙二醇，與本研究結(jié)果相近。

不同取材部位凍存后復(fù)蘇細(xì)胞活性、細(xì)胞分裂和再生能力也不一樣。近年來植物凍存技術(shù)的研究主要集中在莖尖（李享等，2018）、組織（洪森榮等，2018）等。陳勇（2000）對(duì)鐵皮石斛原生質(zhì)的凍存研究過程中，對(duì)鐵皮石斛的葉、莖、愈傷組織的研究結(jié)果表明，取材以剛展開的幼嫩葉片，愈傷組織較理想。簡(jiǎn)令成等（1987）對(duì)甘蔗的愈傷組織凍存后復(fù)蘇，研究表明愈傷組織恢復(fù)再生能力，長(zhǎng)出新植株。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)幼葉原生質(zhì)體凍存后復(fù)蘇較莖尖原生質(zhì)體凍存后復(fù)蘇獲得更高活力的原生質(zhì)體，但是莖尖酶解所得原生質(zhì)體凍存后復(fù)蘇更早進(jìn)行分裂。植物莖尖細(xì)胞具有持續(xù)、周期性分裂的能力，莖尖原生質(zhì)體凍存后復(fù)蘇更早分裂的原因可能是莖尖細(xì)胞小，細(xì)胞壁薄，細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)濃，具有很強(qiáng)且持續(xù)的分裂能力，導(dǎo)致其更早進(jìn)行分裂。

不同的凍存溫度復(fù)蘇后對(duì)原生質(zhì)體活力有一定的差異性。劉紅泉（2004）在條斑紫菜的轉(zhuǎn)基因研究中發(fā)現(xiàn)，紫菜原生質(zhì)體凍存于-196 ℃液氮中活力最高，可達(dá)66.5%，且能再生成葉狀體。董晉江和夏鎮(zhèn)澳（1996）對(duì)谷子胚性細(xì)胞系的超低溫冰凍保存研究發(fā)現(xiàn)，谷子胚性細(xì)胞凍存在-40 ℃的不如在-196 ℃的，可能的原因是-40 ℃時(shí)細(xì)胞內(nèi)仍然能形成冰晶從而影響細(xì)胞的恢復(fù)生長(zhǎng)率，而在-196 ℃下不能形成冰晶所以影響較小。本研究結(jié)果表明，如果是短時(shí)間（90d內(nèi)）凍存，-80 ℃冰箱和-196 ℃液氮凍存后復(fù)蘇原生質(zhì)體的活力差異不顯著。如果長(zhǎng)期保存， -80 ℃冰箱凍存后復(fù)蘇，原生質(zhì)體活力有下降趨勢(shì)。4 ℃保存30d后原生質(zhì)體活力顯著下降，不能用來長(zhǎng)期存放細(xì)胞，結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)凍存溫度對(duì)細(xì)胞的再生能力無明顯影響，原生質(zhì)體可以在第5天左右形成完整的細(xì)胞壁，第7天左右可進(jìn)行第一次分裂。馬鋒旺和李嘉瑞（1998）對(duì)杏原生質(zhì)體的凍存研究中發(fā)現(xiàn)，凍存于-196 ℃的杏原生質(zhì)體復(fù)蘇后5～6d開始第一次分裂，植板率2.2%，凍存不影響其再生能力，本研究與此研究結(jié)果基本一致。

本研究成功地優(yōu)化了甘蔗原生質(zhì)體的凍存條件，并得出以下結(jié)論：幼葉原生質(zhì)體凍存后復(fù)蘇活力顯著高與莖尖原生質(zhì)體;凍存劑DMSO組合為（70%培養(yǎng)基+20%血清+10%dMSO）保護(hù)原生質(zhì)體凍存90d后復(fù)蘇活力高達(dá)72.3%;凍存幼葉原生質(zhì)體3個(gè)月內(nèi)復(fù)蘇，-80 ℃和液氮-196 ℃凍存效果差異不顯著，超過3個(gè)月后， -196 ℃凍存溫度顯著高于-80 ℃，甘蔗原生質(zhì)體經(jīng)超低溫保存后，其再生能力并無太大變化。以上研究結(jié)果為甘蔗原生質(zhì)體的超低溫保存提供科學(xué)依據(jù)，為體細(xì)胞融合育種、遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)基因研究提供了材料和技術(shù)支撐。

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