金縷半楓荷多酚提取及其抗氧化抗菌活性研究

廖娜 韋柳斌 金旺 韋啓球 陳潔 伍善廣

摘 要：為進(jìn)一步開發(fā)和利用金縷半楓荷，該研究以超聲時間、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲溫度為考察因素，用金縷半楓荷總多酚提取率作為評價指標(biāo)，采用單因素和正交試驗優(yōu)化提取工藝確定最佳工藝，并以最佳工藝制備金縷半楓荷多酚;進(jìn)一步采用DPPH·和羥自由基清除法評價金縷半楓荷多酚的抗氧化能力，以抑菌圈和最小抑菌濃度（MIC）為指標(biāo)，采用牛津杯和肉湯稀釋法考察其抗菌活性。結(jié)果表明：最佳提取工藝為乙醇濃度70%，料液比為1∶16，提取時間為60 min，提取溫度為60 ℃。金縷半楓荷多酚清除DPPH·自由基的IC50為 5.22 μg·mL-1，與陽性對照維生素C的IC50值4.31 μg·mL-1無顯著差異，羥自由基清除率IC50為105 μg·mL-1，顯著低于維生素C的IC50值（180 μg·mL-1）。對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有抑制作用，抑菌圈直徑分別為（13.7 ± 1.2） mm和（10.0 ± 1.3） mm，MIC分別為0.393和0.785 mg·mL-1。這表明金縷半楓荷多酚具有抗菌和顯著抗氧化能力，為開發(fā)利用金縷半楓荷資源提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：金縷半楓荷， 多酚，? 抗氧化能力， 抗菌活性，dPPH·， 羥自由基

中圖分類號：Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2019）04-0523-08

Abstract：In order todevelop and utilize Semiliquidambar cathayensis， orthogonaldesign was used to explore the effects of ethanol content， liquid to solid ratio， extraction time and temperature. Moreover， thedPPH· and hydroxyl radical scavenging activities of the polyphenols were also investigated. The inhibition zone and minimal inhibitory concentration （MIC） were used todetect the antibacterial activities， anddetermined by Oxford Cup method and brothdilution method. The results were as follows：the best extraction condition was ethanol content of 70%， the solid to liquid ratio of 1∶16， the extraction time of 60 min， and the extraction temperature of 60 ℃. In addition， there was no significantdifference of the IC50 value ofdPPH· free radical scavenging between 5.22 μg·mL-1 polyphenols? and 4.31 μg·mL-1 ascorbic acid. And the IC50 value 105 μg·mL-1of hydroxyl free radical scavenging of the polyphenols was significantly lower than that of ascorbic acid 180 μg·mL-1. The results also showed that the polyphenols had antibacterial activity against Staphyloccocus aureus and Escherichia coli with the antibacterial circle were （13.7 ± 1.2） mm and （10.0 ± 1.3） mm， respectively. And the MIC were 0.393 and 0.785 mg·mL-1， respectively. This research provides the theoretical information for furtherdevelopment and utilization of Semiliquidambar cathayensis resources.

Key words：Semiliquidambar cathayensis， polyphenols， antioxidant capacity， antibacterial activities，dPPH·， hydroxyl radical

金縷半楓荷（Semiliquidambar cathayensis），又名半楓荷，為金縷梅科半楓荷屬植物，分布于江西、貴州、廣東、海南及廣西等地（黃東挺等，2012）。該藥材被《全國中草藥匯編》和《中國民族藥志要》收載，其根、莖、葉均可入藥，性味甘、淡、溫，具祛風(fēng)除濕、活血消腫之功。在廣西民間用于抗風(fēng)濕、治療腰肌勞損、跌打痕積等（楊麗等，2016）。近年來，由于金縷半楓荷獨特的臨床功效，引起部分學(xué)者的關(guān)注，并取得良好的研究成果。楊武亮等（1999）發(fā)現(xiàn)，金縷半楓荷根的醇提物具有鎮(zhèn)痛、抗炎作用。周光雄等（2002）從金縷半楓荷根的乙酸乙酯萃取部位分離鑒定了9個化合物。隨后，有文獻(xiàn)報道了從金縷半楓荷根的石油醚部位和乙酸乙酯部位的化學(xué)成分（盧海嘯等，2015）。最近，韋春玲等（2017）的研究發(fā)現(xiàn)，以反式-白藜蘆醇葡萄糖苷作為標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC法測定總多酚的含量，采用不同溶劑的超聲、回流多種提取法，優(yōu)選半楓荷多酚提取工藝，總多酚的提取率最高為2.67%。

多酚是植物體內(nèi)的多元酚類次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物的根、皮、莖、花、葉、果實中。多酚具有抗氧化、抗菌、抗病毒等生物活性（Gonzalez et al.， 2017）。當(dāng)前，食品藥品安全問題已經(jīng)成為國內(nèi)外廣泛關(guān)注的焦點。市場上使用的化學(xué)合成抗氧化劑具有引起肝臟損傷，甚至誘發(fā)癌癥等副作用（Kupfer et al.， 2002;張聲源等，2017）。天然抗氧化劑由于其安全性，倍受人們的青睞。因此，尋找天然抗氧化劑已成為國內(nèi)外的研究熱點（馮學(xué)珍等，2017;Todaro et al.， 2017）。

金縷半楓荷在廣西民間用于抗風(fēng)濕抗炎等作用。風(fēng)濕炎癥與機體的自由基過量緊密相關(guān)（Floyd et al.， 2011）。金縷半楓荷用于治療跌打損傷。治療跌打損傷藥物具有控制傷口感染的功效。因此，推測金縷半楓荷中含有抗氧化抗菌成分。到目前為止，還未見到關(guān)于金縷半楓荷多酚抗菌抗氧化的系統(tǒng)研究。本研究以沒食子酸為評價指標(biāo)，正交試驗優(yōu)選金縷半楓荷多酚超聲提取工藝，通過1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）和羥自由基清除法來評價其抗氧化能力，并通過抑菌圈和最小抑菌濃度（MIC）考察其抗菌活性，為金縷半楓荷藥用提供了數(shù)據(jù)信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 所用研究材料于2016 年采自廣西武宣縣，經(jīng)湖北第二師范學(xué)院戴月副教授鑒定為金縷半楓荷。

1.1.2 儀器與試劑 儀器：T6新世紀(jì)UV-可見分光光度計; RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;牛津杯 （8 mm × 6 mm × 10 mm;SW-CJ-2F超凈工作臺; VGT-1990QTD超聲波清洗器;SPX-60BSH-II生化培養(yǎng)箱等。試劑：沒食子酸對照品購于百靈威科技有限公司;DPPH·購于Sigma-Aldrich化學(xué)試劑公司;大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 6538購于廣東省微生物分析檢測中心;MH肉湯（028040）、MH瓊脂培養(yǎng)基（028050）購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，采用稍加改良的Folin-Ciocalteus 比色法（魏歡等，2017）測定金縷半楓荷中總多酚的含量。

1.2.2 供試樣品溶液配制 新鮮金縷半楓荷枝干，風(fēng)干，粉碎，備用。準(zhǔn)確稱取 1.0 g 樣品于50 mL圓底燒瓶中，加入一定比例乙醇溶液，超聲提取，在4 000 × g 轉(zhuǎn)速下離心5 min，上清液，移至100 mL容量瓶中，用乙醇定容。取0.50 mL按上述1.2.1方法從“分別移取0.50 mL”開始操作。以空白對照為參比液，于750 nm 處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸線性方程計算多酚的含量。

提取率=c×D×Vm×100%（1）

1.2.3 單因素試驗對總多酚提取率的影響 超聲時間、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲溫度4個因素進(jìn)行單因素試驗，考察這4個因素對提取率及總多酚含量的影響。

1.2.4 正交試驗 以總多酚含量為指標(biāo)，超聲時間、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲溫度為因素進(jìn)行正交試驗，正交試驗設(shè)計如表1所示。

1.2.5dPPH·自由基清除性能測定 經(jīng)過改良的方法（張聲源等，2017），在不同濃度金縷半楓荷總多酚樣液中加入無水乙醇配制的1.0×10-4 mol·L-1dPPH·溶液，室溫靜置20 min，維生素C作為陽性對照，于517 nm處測定吸光度。每個樣品做3個平行試驗，取平均值。根據(jù)公式（2）計算出樣品和維生素C溶液對DPPH·自由基的清除率。

清除率=1-（Ai-Aj）A0×100%（2）

式中，A0為1.0 mL 1.0×10-4 mol·L-1dPPH·無水乙醇溶液與1.0 mL 無水乙醇混合后在波長517 nm 處的吸光度;Ai為1.0 mL 不同質(zhì)量濃度的樣品和維生素C溶液，分別加入1.0 mL 1.0×10-4 mol·L-1dPPH·無水乙醇溶液，室溫避光反應(yīng)20 min，以無水乙醇溶劑做空白對照，測定其在波長517 nm處的吸光度;Aj為定1.0 mL無水乙醇溶液與1.0 mL樣品溶液在波長517 nm處的吸光度。

1.2.6 羥自由基清除能力測定 參照Zhu et al.（2017）的方法，依次向試管中加入1.0 mL 0.75 mmol·L-1的鄰二氮菲溶液，加入2.0 mL PBS和1 mL蒸餾水，混勻，接著加入1.0 mL 0.75 mmol·L-1硫酸亞鐵溶液和1.0 mL 0.01%過氧化氫，37 ℃保溫60 min，于510 nm處測得吸光度為Ap;用1.0 mL蒸餾水代替1.0 mL過氧化氫，測得吸光度為 AB，1.0 mL不同濃度金縷半楓荷多酚樣品溶液代替蒸餾水，測得吸光度As。根據(jù)公式（3）計算半楓荷多酚樣品對羥自由基的清除率。

清除率=As-ApAB-Ap×100%（3）

1.2.7 抑菌圈測定 參照Zhang et al.（2017）的方法，具體操作如下：將已滅菌的MH培養(yǎng)基在無菌條件下倒入滅菌培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基冷凝后，均勻涂布0.1 mL菌懸液。每個培養(yǎng)皿放置6 個牛津杯，每個牛津杯中加入100 μL樣品。設(shè)定金縷半楓荷多酚組，0.1 mg·mL-1鏈霉素陽性對照組，DMSO溶液陰性對照組。于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈。每組試驗重復(fù)3 次。

1.2.8 MIC的測定 采用肉湯稀釋法（繆文玲等，2017），將金縷半楓荷多酚溶液和液體培養(yǎng)基于試管中配成質(zhì)量濃度分別為25.0、12.5、6.25、3.13、1.57、0.785、0.393、0.197和0 mg·mL-1，每支試管中加入100 μL菌懸液，所有試管于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，當(dāng)陽性對照和陰性對照管均符合規(guī)定時，以肉眼觀察，無渾濁者對應(yīng)的最低藥物濃度，即為受試菌的MIC。每組試驗重復(fù)3 次。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 所得數(shù)據(jù)采用Excel 2010與SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用紫外分光光度計測定系列濃度沒食子酸的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），方程為y=0.1141x-0.0013，R2=0.999 8。結(jié)果表明，在0～5.05 μg·mL-1 范圍內(nèi)沒食子酸濃度與吸光度之間有較好的線性關(guān)系。

2.2 乙醇提取分?jǐn)?shù)對總多酚提取率的影響

從圖2可以看出，隨著提取溶劑乙醇含量的增加，金縷半楓荷總多酚的提取率出現(xiàn)先上升后下降。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時總多酚提取率達(dá)到峰值，在乙醇體積分?jǐn)?shù)高于80%，總多酚提取率急劇下降。金縷半楓荷多酚類物質(zhì)具有的酚羥基而具有一定的極性。根據(jù)相似相溶原理，推測當(dāng)60%乙醇的極性與金縷半楓荷多酚極性相似時，溶解度最大。因此，提取率最高。

2.3 液料比對總多酚提取率的影響

保持提取物質(zhì)量不變，逐步增加提取液體積，金縷半楓荷中總多酚的得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，液料比1∶14開始，提取率增長緩慢，1∶20后，總多酚得率下降（圖3）。

2.4 超聲提取時間對總多酚提取率的影響

隨著提取時間的增長，金縷半楓荷中總多酚的提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，超聲時間為50 min時總多酚提取率達(dá)到最高，而后總多酚提取率下降（圖4）。剛開始多酚比較易溶于提取液，先溶出，隨超聲時間延長，溶液中其他物質(zhì)的提取率也隨著增加，使得溶液飽和，限制多酚的溶出。同時，超聲過程中，可能也會破壞多酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取率下降。

2.5 提取溫度對總多酚提取率的影響

在提取溫度30～55 ℃范圍內(nèi)，隨提取溫度升高多酚提取率上升（圖5），說明升高溫度對多酚化合物的溶出是有利的。超過55 ℃后，多酚得率顯著下降，這可能在較高溫度下，多酚氧化變質(zhì)導(dǎo)致多酚得率降低。

2.6 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取影響金縷半楓荷總多酚提取因素中有意義的水平做正交試驗，并對結(jié)果進(jìn)行極差分析，確定最佳提取工藝條件。采用L9（34）正交因子水平表（表1），設(shè)計L9（34）正交試驗，結(jié)果如表2所示。

由表2極差R的結(jié)果可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間、提取溫度等4個因素對金縷半楓荷總多酚提取含量的影響的顯著性為提取溫度>提取時間>料液比>乙醇濃度。金縷半楓荷總多酚超聲提取的最優(yōu)水平搭配為A3B1C3D3，即乙醇濃度為70%，料液比1∶16，提取時間為60 min，提取溫度60 ℃為最佳提取工藝。

2.7 金縷半楓荷多酚對DPPH·自由基的清除作用

如圖6和表3所示，金縷半楓荷多酚和陽性對照維生素C在質(zhì)量濃度0.002～8 μg·mL-1范圍內(nèi)均呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，對DPPH·自由基具有很強的清除能力。

2.8 金縷半楓荷多酚對羥自由基的清除作用

金縷半楓荷多酚清除Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基。如圖7所示，隨著金縷半楓荷多酚濃度的增加，羥自由基抑制率不斷增加。金縷半楓荷多酚濃度在60～160 μg·mL-1范圍內(nèi)，對羥自由基抑制率由7.9%上升至90%，羥自由基清除率IC50

為105 μg·mL-1，顯著低于維生素C的IC50為180 μg·mL-1。這表明金縷半楓荷多酚具有超強的清除自由基能力。

2.9 金縷半楓荷多酚抗菌活性

采用牛津杯法對金縷半楓荷多酚進(jìn)行了抑菌試驗， 效果如表4所示。金縷半楓荷多酚對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用。其中，對金黃色葡萄球菌多酚抑菌圈直徑為（13.7 ± 1.2）mm略高于大腸桿菌的（10.0 ± 1.3）mm。

3 討論與結(jié)論

金縷半楓荷是一種用于治療風(fēng)濕痹痛的瑤藥，是瑤族人民瑤浴的主要藥材。其含有多酚類物質(zhì)，可能是其藥用活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。目前，多酚的含量測定的方法有，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用酒石酸鐵紫外分光光度法（謝倩等，2014）;以反式-白藜蘆醇葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC法（韋春玲等，2017）及HPLC法（夏雅俊等，2014）。其中，HPLC法由于具有分離效率高、選擇性好、檢測靈敏度高及操作自動化等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于一種或幾種多酚成分分析。該法不常用于總多酚含量測定。酒石酸鐵紫外分光光度法由于該法受pH影響較大，穩(wěn)定性不高。福林-酚法測定總多酚的原理為利用多酚類物質(zhì)在堿性條件下的還原性，可將磷鎢鉬酸還原成藍(lán)色，顏色深淺與多酚含量成正相關(guān)，可以用分光光度計進(jìn)行測定。福林-酚法，由于其靈敏度高、儀器設(shè)備簡單、操作簡便、快速準(zhǔn)確高、重現(xiàn)性好，廣泛應(yīng)用于植物多酚的含量測定。本研究以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，福林-酚法測定金縷半楓荷總多酚，采用單因素和正交試驗優(yōu)化超聲提取工藝，總多酚提取率為5.11%，大大高于文獻(xiàn)值2.67%（韋春玲等，2017）。該檢測方法具有良好的穩(wěn)定性和可靠性，提取工藝穩(wěn)定。

本研究采用體外產(chǎn)生活性自由基系統(tǒng)，對金縷半楓荷多酚的抗氧化能力進(jìn)行研究表明，金縷半楓荷多酚清除DPPH·自由基的IC50與維生素C相當(dāng)，清除羥自由基的IC50比維生素C的還低，說明其抗氧化效果顯著。體外抑菌試驗結(jié)果表明，金縷半楓荷多酚對革蘭氏陽性菌中的金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌中的大腸桿菌都有較強的抑制作用。天然瑤藥金縷半楓荷多酚具有較強的抗氧化活性，對常見的菌種具有明顯的抑菌效果，具有較廣的抗菌譜，提示了金縷半楓荷具有良好的藥用價值和開發(fā)前景。本研究對金縷半楓荷多酚的超聲提取工藝優(yōu)化及其抗氧化，抗菌活性進(jìn)行了初步研究，為開發(fā)天然瑤藥金縷半楓荷資源提供了重要依據(jù)。

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