艾灸對(duì)快速老化小鼠海馬區(qū)突觸可塑性相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

林瑤 左瀅竹 哈略

摘要 目的：探究艾灸對(duì)快速老化小鼠（SAMP8）海馬區(qū)突觸可塑性相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法：將12只6個(gè)月齡雄性SAMP8小鼠隨機(jī)分為模型組和艾灸組。另以6只同月齡雄性正常老化小鼠（SAMR1）作為空白組?？瞻捉M、模型組小鼠每天常規(guī)抓取并用固定器固定，不予其他處理;艾灸組小鼠釆用相同抓取并固定后，用艾條灸其關(guān)元穴。各組小鼠干預(yù)時(shí)間為20 min/d，6 d/周，共干預(yù)6周。6周后取材，用Western-blot法檢測(cè)各組小鼠海馬突觸素（SYN）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、酪氨酸激酶受體B（Trk B）及磷酸化Trk B（p-Trk B）的表達(dá)。結(jié)果：與空白組比較，模型組小鼠海馬內(nèi)SYN、BDNF、p-Trk B表達(dá)顯著下降（P<0.05）。與模型組比較，艾灸組小鼠海馬內(nèi)SYN、BDNF、p-Trk B表達(dá)顯著上升（P<0.05）。3組小鼠海馬Trk B表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：艾灸干預(yù)能夠通過影響SAMP8小鼠海馬區(qū)突觸可塑性相關(guān)蛋白的表達(dá)起到抗衰老的作用，且該作用可能經(jīng)由BDNF/Trk B通路實(shí)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞 阿爾茨海默病;艾灸;BDNF/Trk B通路;快速老化小鼠;腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子;突觸;突觸可塑性;突觸素

Abstract Objective：To explore the effects of moxibustion on the expression of synaptic plasticity-related proteins in hippocampus of senescence accelerated mouse prone 8 （SAMP8）.Methods：A total of 12 6-month-old male SAMP8 mice were randomly divided into a model group and a moxibustion group.In addition，6 male SAMR1 mice of the same age were used as a blank group.The blank and the model group were routinely grasped daily and fixed with a fixator，and no other treatment was performed; the mice in the moxibustion group were treated the same grasping and fixation，and Guanyuan （CV4） was given moxibustion.The intervention time of each group was 20 min/day，6 d/week，and a total of 6 weeks of intervention.After 6 weeks，the expression of synaptophysin （SYN），brain-derived neurotrophic factor （BDNF），tyrosine kinase receptor B （Trk B） and phosphorylated Trk B （p-Trk B） in hippocampus of the each group of mice were detected by Western blot.Results：Compared with the blank group，the expression of SYN，BDNF and p-Trk B in the hippocampus of the model group were significantly decreased （P<0.05）.Compared with the model group，the expression of SYN，BDNF and p-Trk B in the hippocampus of the moxibustion group were significantly increased （P<0.05）.There was no significant difference in the expression of Trk B in hippocampus between the 3 groups （P>0.05）.Conclusion：Moxibustion intervention can play an anti-aging role by affecting the expression of synaptic plasticity-related proteins in the hippocampus of SAMP8 mice，and this effect may be achieved through BDNF/Trk B pathway.

Key Words Alzheimer′s disease; Moxibustion; BDNF/Trk B pathway; Senescence accelerated mouse prone 8; Brain-derived neurotrophic factor; Synapse; Synaptic plasticity; Synaptophysin

中圖分類號(hào)：R245.81文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.018

阿爾茨海默病（Alzheimer′s Disease，AD）是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床以進(jìn)行性的記憶缺失、認(rèn)知損害和人格改變?yōu)樘卣鳌D的發(fā)病機(jī)制并未完全明確，目前的假說有β淀粉樣蛋白學(xué)說、膽堿能學(xué)說、能量代謝學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、膽固醇致病學(xué)說、鋁中毒學(xué)說、Tau蛋白學(xué)說等等，這些學(xué)說都部分解釋了AD的病理過程。

也有研究表明[1-2]，AD的發(fā)病與突觸可塑性的改變有密切關(guān)系，突觸丟失與突觸功能的障礙甚至在AD早期就已經(jīng)出現(xiàn)并與認(rèn)知下降有關(guān)。突觸可塑性是突觸在一定條件下，突觸傳遞效能和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的能力，因此可分為突觸功能的可塑性和突觸結(jié)構(gòu)的可塑性。海馬區(qū)的突觸可塑性受到突觸素（SYN）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）等突觸可塑性相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)。

艾灸作為我國(guó)傳統(tǒng)療法之一，具有補(bǔ)益元?dú)?，延緩衰老的功效，《扁鵲心書》也曾記載道：“保命之法，灼艾第一……人于無病時(shí)常灸關(guān)元、氣海、命門、中脘……雖未得長(zhǎng)生，亦可保百余年壽矣”?，F(xiàn)代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也肯定了艾灸對(duì)于阿爾茨海默癥的療效。因此，本實(shí)驗(yàn)從突觸可塑性角度出發(fā)，通過觀察艾灸關(guān)元穴對(duì)快速老化小鼠海馬區(qū)突觸可塑性相關(guān)蛋白的影響探究艾灸對(duì)AD的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)選用6個(gè)月齡雄性快速老化小鼠（Senescence-accelerated Mouse Prone/8，SAMP8）12只及正常老化小鼠（Senescence-accelerated Mouse/Resistance1，SAMR1）6只，體質(zhì)量（30±3）g，由中科澤晟科技有限公司提供（許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0011）。所有小鼠均可自由進(jìn)食飲水;飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22±2）℃，濕度為50%～60%左右。釆用人工控制室內(nèi)照明，保持12 h光照（8：00-20：00）和黑暗（20：00-次日8：00）交替循環(huán)。

1.1.2 藥物 特制細(xì)艾條（河南南陽(yáng)漢醫(yī)艾絨有限公司，規(guī)格：φ0.5 cm×20 cm）。

1.1.3 試劑與儀器 兔抗鼠BDNF抗體（美國(guó)abcam公司，貨號(hào)：ab205067）、兔抗鼠p-Trk 抗體（美國(guó)abcam公司，貨號(hào)：ab109684）、兔抗鼠Trk B抗體（美國(guó)abcam公司，貨號(hào)：ab18987）、兔抗鼠SYN抗體（美國(guó)abcam公司，貨號(hào)：ab32127）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國(guó)PIERCE公司，貨號(hào)：ECL-0012）、PVDF轉(zhuǎn)印膜（美國(guó)PALL公司，貨號(hào)：XLL092-2）、小鼠固定器（上海華巖儀器設(shè)備有限公司，規(guī)格：150 mm×65 mm×50 mm）、水平脫色搖床（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，型號(hào)TDK-2）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)TGL-16M）、電泳儀（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，型號(hào)DG-300C）等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 按照隨機(jī)數(shù)字表法將12只SAMP8隨機(jī)分為模型組和艾灸組，每組6只。6只SAMR1作為空白組。

1.2.2 干預(yù)方法 模型組和空白組：抓取并將小鼠放入固定器中，不做其他干預(yù)，20 min/d，6 d/周;艾灸組：抓取小鼠放入固定器中，使其腹部對(duì)準(zhǔn)固定器底部的開口，開口下方放置點(diǎn)燃的艾條，對(duì)準(zhǔn)小鼠關(guān)元穴。艾灸時(shí)及時(shí)調(diào)整艾條與小鼠的距離，使艾灸的溫度基本保持恒定。艾灸干預(yù)20 min/d，6 d/周。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 干預(yù)6周后，用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉小鼠，斷頭取腦，在冰臺(tái)上剝離左側(cè)海馬組織，放入凍存管中，后轉(zhuǎn)移-70 ℃冰箱保存。用Western blot檢測(cè)小鼠海馬SYN、BDNF、Trk B、p-Trk B的表達(dá)：取出樣品，將組織樣品中加入預(yù)冷的裂解液，充分研磨后13 000 r/min，4 ℃離心10 min。取上清液，用BCA法測(cè)樣品蛋白濃度。上樣至SDS-PAGE凝膠，150 V電壓電泳。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放入封閉液（TBST/5%脫脂奶粉）中，室溫封閉0.5 h。加入一抗（用封閉液稀釋），室溫孵育1 h或4 ℃雜交過夜。用1×TBST漂洗3次，時(shí)間依次為15 min，5 min，5 min。加入適當(dāng)比例稀釋的二抗，室溫孵育1 h。用1×TBST漂洗3次，時(shí)間依次為15 min，5 min，5 min。將ECL的A液和B液等體積混合，均勻地滴在PVDF膜上，室溫孵育1 min后放入暗盒中顯影。使用Quantity one軟件對(duì)其進(jìn)行光密度分析，以對(duì)照孔的數(shù)值/tubulin的比值做為1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。首先依次對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，若兩者都符合，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組組間差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間多重比較用LSD方法;否則采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney U）。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

艾灸對(duì)各組小鼠海馬組織SYN、BDNF、Trk B、p-Trk B蛋白表達(dá)的影響。見圖1。

2.1 各組小鼠海馬組織SYN的含量比較 各組小鼠海馬組織SYN的含量由高到低依次為空白組、艾灸組、模型組。與空白比較，模型組小鼠SYN的含量顯著下降（P=0.000），艾灸組SYN的含量有降低趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.235），且艾灸組SYN的含量較模型組顯著上升（P=0.001）。提示艾灸可以升高SAMP8小鼠海馬組織SYN的含量。見表1。

2.2 各組小鼠海馬組織BDNF的含量比較 各組小鼠海馬組織BDNF的含量由高到低依次為空白組、艾灸組、模型組。與空白組比較，模型組小鼠BDNF的含量顯著下降（P=0.000），艾灸組海馬中BDNF的含量下降且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009）。與模型組比較，艾灸組BDNF的含量較顯著上升（P=0.000）。提示艾灸可以升高SAMP8小鼠海馬組織BDNF的含量。見表1。

2.3 各組小鼠海馬組織Trk B的含量比較 各組小鼠海馬組織Trk B的含量由高到低依次為空白組、艾灸組、模型組。與空白組比較，模型組和艾灸組小鼠Trk B的含量有下降趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。艾灸組與模型組比較，Trk B含量有升高趨勢(shì)但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.4 各組小鼠海馬組織p-Trk B的含量比較 各組小鼠海馬組織p-Trk B的含量由高到低依次為空白組、艾灸組、模型組。與空白組比較，模型組小鼠p-Trk B的含量顯著下降（P=0.004），艾灸組p-Trk B的含量有降低趨勢(shì)，但不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.275）。艾灸組與模型組比較，p-Trk B含量升高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.035）。提示艾灸能夠升高SAMP8小鼠海馬組織p-Trk B的含量。見表1。

3 討論

突觸素（SYN）是一種特異性存在于突觸囊泡膜上的鈣結(jié)合糖蛋白，是突觸前終末的特異性標(biāo)記物，其分布和密度可間接反映突觸分布和密度，體現(xiàn)了突觸可塑性的變化和學(xué)習(xí)記憶能力的改變，是目前研究突觸可塑性最常用的指標(biāo)之一[3-4]。SYN參與了突觸囊泡的運(yùn)輸、分泌和再循環(huán)等活動(dòng)，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，與突觸結(jié)構(gòu)發(fā)育和重塑關(guān)系密切。SYN能夠通過調(diào)節(jié)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）影響突觸功能的可塑性，且該作用可能與SYN磷酸化作用影響內(nèi)源性谷氨酸的釋放有關(guān)[5]，SYN也能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元軸突和樹突的分化和生長(zhǎng)，參與突觸結(jié)構(gòu)的形成和維持，影響突觸結(jié)構(gòu)的可塑性[6-7]。有研究表明，SYN密度在正常人的額葉、枕葉、海馬CA3區(qū)與殼核隨年齡增長(zhǎng)逐漸下降[8];SYN在AD患者新皮質(zhì)的密度與心理測(cè)量指數(shù)結(jié)果具有非常強(qiáng)烈的相關(guān)性，其下降程度可間接反映認(rèn)知功能損傷的程度[9];類似的研究也發(fā)現(xiàn)海馬內(nèi)SYN表達(dá)的減少與AD患者認(rèn)知功能的損傷正相關(guān)[10]。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子大家族的一員，1982由德國(guó)生物學(xué)Brade從豬腦中提取而得。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，BDNF廣泛分布于海馬、皮質(zhì)、下丘腦、杏仁核等部位，是腦內(nèi)含量最為豐富的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。BDNF受體為酪氨酸激酶受體B（Trk B）。成熟型BDNF的功能主要通過作用于酪氨酸激酶受體B（Trk B）實(shí)現(xiàn)。BDNF/Trk B信號(hào)通路是BDNF發(fā)揮生物活性的關(guān)鍵信號(hào)通路。BDNF激活酪氨酸受體激酶B（Trk B）受體，導(dǎo)致Trk B磷酸化，激活3個(gè)主要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：ras絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt和磷酸酶Cγ（PLCγ）途徑，從而參與對(duì)突觸的可塑性的調(diào)節(jié)，影響認(rèn)知功能[11]。現(xiàn)已證實(shí)BDNF能夠影響突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，是調(diào)節(jié)海馬突觸可塑性和記憶儲(chǔ)存的關(guān)鍵分子[12]。BDNF對(duì)突觸結(jié)構(gòu)可塑性的影響主要通過作用于樹突棘實(shí)現(xiàn)。海馬內(nèi)BDNF的上調(diào)能夠增加神經(jīng)元樹突長(zhǎng)度和分支，減少神經(jīng)元的丟失，改善Aβ誘發(fā)的神經(jīng)元損傷。BDNF對(duì)突觸功能可塑性的影響主要表現(xiàn)在誘導(dǎo)和維持長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）。有人認(rèn)為BDNF是海馬LTP的正性調(diào)節(jié)因子，且其作用通過改變與LTP有關(guān)的細(xì)胞骨架而實(shí)現(xiàn)[13];大鼠DG區(qū)的LTP的鞏固持續(xù)數(shù)小時(shí)的BDNF/Trk B信號(hào)。BDNF對(duì)突觸可塑性的調(diào)節(jié)可能是通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放和離子通道、影響相關(guān)蛋白質(zhì)合成等實(shí)現(xiàn)。有學(xué)者研究了在突觸前水平上BDNF對(duì)突觸傳遞的作用，發(fā)現(xiàn)BDNF與Trk 結(jié)合后能夠使海馬神經(jīng)元絲裂原活化蛋白（MAP）依賴性突觸蛋白Ⅰ磷酸化，促進(jìn)谷氨酸的快速釋放[14]。在一項(xiàng)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）對(duì)谷氨酸能突觸可塑性影響的研究中發(fā)現(xiàn)，短期增加BDNF可提高NAc神經(jīng)元表面AMPA受體GluA1和GluA2的水平，長(zhǎng)期則表現(xiàn)為抑制其表達(dá)，體現(xiàn)了BDNF對(duì)AMPA受體的雙向調(diào)節(jié)作用[15];BDNF也能夠增加培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中NR1、NR2A和NR2B NMDA受體亞單位的蛋白和mRNA水平。在蛋白質(zhì)合成方面，BDNF影響神經(jīng)元或樹突內(nèi)PSD-95、Homer2，GluA1，Arc and CamKII等蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯。這些蛋白質(zhì)參與LTP的誘發(fā)和維持、突觸結(jié)構(gòu)的改變和重塑等，都與突觸可塑性有著密切的聯(lián)系。BDNF及其受體Trk B的含量在腦內(nèi)的變化與AD有著密切的關(guān)系。Ferrer等[16]發(fā)現(xiàn)在重癥阿爾茨海默患者的額葉皮層和海馬神經(jīng)元中BDNF和全長(zhǎng)型Trk B表達(dá)水平明顯減少，表明AD患者腦中BDNF/Trk B神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路選擇性下調(diào);另有學(xué)者[17]發(fā)現(xiàn)較高的腦BDNF表達(dá)能夠延緩認(rèn)知功能的下降，并可能減少AD病理對(duì)認(rèn)知功能的有害影響。

本實(shí)驗(yàn)從突觸可塑性的角度闡釋了艾灸治療AD的可能機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于空白組的SAMR1小鼠，SAMP8小鼠海馬組織突觸可塑性相關(guān)蛋白SYN、BDNF、p-Trk B蛋白表達(dá)均顯著下降。而SYN又是BDNF/Trk B通路的下游效應(yīng)分子[18]，說明SAMP8小鼠海馬內(nèi)突觸可塑性受到損傷，且可能與BDNF/Trk B通路的下調(diào)有關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)艾灸及艾煙可能通過抑制MAPK通路，上調(diào)PI3K/AKT通路，抑制AD小鼠腦內(nèi)炎性反應(yīng)和皮質(zhì)Aβ生成起到抗衰老的作用[19]。MAPK和PI3K/AKT均為BDNF/Trk B的下游通路，說明BDNF/Trk B通路可能與艾灸治療AD的機(jī)制有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)的研究也證明了這一點(diǎn)，未來可圍繞該通路繼續(xù)進(jìn)一步的研究。

綜上所述，艾灸可以上調(diào)突觸可塑性相關(guān)蛋白在海馬組織中的表達(dá)起到治療AD的作用，且該作用可能是通過BDNF/Trk B通路實(shí)現(xiàn)。

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