基于多指標成分定量評價復方魚腥草膠囊

王燕鴿 張志琴 郭富禮

摘要 目的：基于多指標成分定量評價分析復方魚腥草膠囊，為復方魚腥草膠囊的質量控制提供參考。方法：首先制備復方魚腥草膠囊供試品溶液及槲皮苷、表告依春、綠原酸、連翹苷、黃芩苷對照品溶液，色譜條件采用CAPCELL-PAK-MG-C18色譜柱（5 μm，規(guī)格：4.6 mm×250 mm），柱溫以35 ℃為宜，進樣量為10 μL，流速為1.0 mL/min進行高效液相色譜（HPLC）檢測，以流動相A（乙腈）和流動相B（水+0.01%磷酸）為條件進行梯度洗脫，優(yōu)化高效液相（HPLC）的方法學嚴謹性，進行線性回歸、精密度、重復性、穩(wěn)定性、專屬性試驗和加樣回收率試驗，多指標成分定量分析樣品中槲皮苷、表告依春、綠原酸、連翹苷和黃芩苷的含量。結果：1）采用HPLC色譜法對復方魚腥草膠囊中魚腥草、板藍根、金銀花、連翹、黃芩等進行專屬性試驗，結果顯示復方魚腥草膠囊中魚腥草、板藍根、金銀花、連翹、黃芩專屬性良好。2）線性范圍考察結果顯示槲皮苷對照品、連翹苷對照品、綠原酸對照品在4～201 μg/mL范圍內、表告依春對照品、黃芩苷對照品在12～601 μg/mL范圍內的線性關系均良好。3）精密度試驗結果顯示槲皮苷、連翹苷、綠原酸、表告依春對照品、黃芩苷峰面積相對標準偏差（RSD）分別是0.45%、0.52%、0.66%、0.59%、0.31%，結果表明此色譜條件下的HPLC儀器精密度良好。4）穩(wěn)定性試驗結果顯示復方魚腥草膠囊供試品溶液相對峰面積RSD是1.33%，表明24 h內復方魚腥草膠囊供試品溶液基本穩(wěn)定。5）重復性試驗結果顯示復方魚腥草膠囊供試品溶液相對峰面積RSD為0.92%，表明該HPLC方法的重復性良好。6）結果顯示槲皮苷、表告依春、綠原酸、連翹苷和黃芩苷的平均回收率分別為99.10%、99.26%、99.07%、98.05%、98.82%、98.32%，RSD為1.81%、1.49%、0.94%、1.58%、1.01%，表明回收率較好。7）基于多指標成分定量測定結果顯示不同廠家不同批次的復方魚腥草膠囊中有效成分槲皮苷、表告依春、綠原酸、連翹苷和黃芩苷的含量存在較大差異。結論：基于多指標成分定量測定結果顯示不同廠家不同批次的復方魚腥草膠囊中有效成分槲皮苷、表告依春、綠原酸、連翹苷和黃芩苷的含量存在較大差異。

關鍵詞 多指標成分定量;高效液相;復方魚腥草膠囊;槲皮苷;表告依春;綠原酸;連翹苷;黃芩苷

Abstract Objective：Based on the quantitative evaluation and analysis of compound Houttuynia cordata capsule based on multi-index components，it provides a reference for the quality control of compound Houttuynia cordata capsule.Methods：First，the compound Houttuynia capsule sample solution and quercetin were prepared，including Yichun，chlorogenic acid，forsythrin，baicalin reference solution，The chromatographic conditions were determined by high performance liquid chromatography（HPLC） with CAPCELL-PAK-MG-C18 column （5 μm， specification： 4.6 mm × 250 mm），column temperature 35 ℃，injection volume 10 μL，flow rate 1.0 mL/min）. Gradient eluting was carried out under the conditions of mobile phase A （acetonitrile） and mobile phase B （water 0.01% phosphate）.Optimize the methodological rigour of high performance liquid phase （HPLC），carry out linear regression， precision， reproducibility，stability，specificity test and sample recovery test，quantitative analysis of quercetin in samples with multiple index components，Quercetin， chlorogenic acid，The contents of phillyrin and baicalin.Results：1）the specific tests of Houttuynia cordata， Radix Isatidis， Flos Lonicerae， Forsythia suspensa and Scutellaria baicalensis were carried out by HPLC chromatography. the results showed that Houttuynia cordata， Radix Isatidis， Flos Lonicerae and Forsythia suspensa were found in the compound Houttuynia cordata capsule. Scutellaria baicalensis Georgi has a good specificity.2） the linear range of quercetin， phillyrin and chlorogenic acid were within the range of 4≤201 μg/mL， and the linear range of baicalin and baicalin were 12 μg/mL and 601 μg/mL， respectively. the linear range of quercetin， phillyrin and chlorogenic acid was 4≤201 μg/mL.3） the results of precision test showed that the relative standard deviation （RSD） of quercetin， phillyrin， chlorogenic acid and baicalin peak area were 0.45%， 0.52%， 0.66%， 0.59%， 0.31%， 0.51%， 0.52%， 0.56%， 0.59%， 0.31%， 0.52%， 0.62%， 0.59% and 0.31%， respectively. The results show that the precision of HPLC instrument under this chromatographic condition is good.4） The results of stability test showed that the relative peak area RSD of compound Houttuynia capsule solution was 1.33%， which indicated that the solution of compound Houttuynia capsule was basically stable within 24 hours.5） The results of reproducibility test showed that the relative peak area RSD of compound Houttuynia capsule solution was 0.92%， which indicated that the HPLC method had good reproducibility.6） The results showed that the average recovery of quercetin， eichun， chlorogenic acid， phillyrin and baicalin were 99.10%， 99.26%， 99.07%， 98.05%， 98.82%， 98.32%， 1.81% and 1.49%， respectively. 0.94%， 1.58%， 1.01%， indicating that the recovery is good.7）The results of quantitative determination based on multi-index components showed that the contents of quercetin， chlorogenic acid， phillyrin and baicalin in different batches of compound Houttuynia cordata Thunb capsules from different manufacturers were quite different.Conclusion：The results of quantitative determination based on multi-index components showed that the contents of quercetin， chlorogenic acid， phillyrin and baicalin in different batches of compound Houttuynia cordata Thunb capsules from different manufacturers were quite different.

Key Words Quantitative analysis of multiple index components;High performance liquid phase; Compound Houttuynia capsule;Quercetin;Biguoyichun;Chlorogenic acid;Forsythrin;Baicalin

中圖分類號：R284.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.05.013

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（型號：SHIMADZU LC-20AD，廠家：日本島津有限公司）;二極管陣列（DAD）檢測器（型號：Prominence SPD-M20A，廠家：日本島津有限公司）;超聲波清洗儀（型號：DS1027HT/HTD，廠家：天津市富城達科技有限公司）。

1.2 試劑 色譜HPLC乙腈和色譜HPLC甲醇購于德國MERCK公司，色譜HPLC冰醋酸、色譜HPLC磷酸和色譜HPLC無水乙醇均購于天津百倫斯生物有限公司;中國食品藥品檢定研究院提供的槲皮苷對照品（批號：111538-201405）、表告依春對照品（批號：1072-93-113531）、黃芩苷對照品（批號：0715-9909）、連翹苷對照品（批號：110821-201514）、綠原酸對照品（批號：110753-201314）。

1.3 分析樣品 隨機選取10個不同廠家生產不同批次的復方魚腥草膠囊。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 采用CAPCELL-PAK-MG-C18色譜柱（5 μm，規(guī)格：4.6 mm×250 mm），柱溫以35 ℃為宜，進樣量為10 μL，流速為1.0 mL/min進行高效液相色譜（HPLC）檢測，以流動相A（乙腈）和流動相B（水+0.01%磷酸）為條件進行梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1。

2.2 對照品溶液的制備 首先將槲皮苷對照品、表告依春對照品、黃芩苷對照品、連翹苷對照品、綠原酸對照品均分別放置于60 ℃真空干燥至恒重，然后分別精密稱取10.00 mg，其中，表告依春對照品置于100 mL量瓶中以甲醇定容，槲皮苷對照品和綠原酸對照品置于50 mL量瓶中以甲醇定容，連翹苷對照品置于25 mL量瓶中加入50%甲醇定容，黃芩苷對照品置于25 mL量瓶中加入無水乙醇適量，均超聲溶解，即制備得對照品溶液。精密量取所制備2 mL槲皮苷對照品溶液和綠原酸對照品溶液、3 mL連翹苷對照品溶液、10 mL黃芩苷對照品溶液、25 mL表白依春對照品溶液于50 mL量瓶中，甲醇定容，超聲混合均勻，即得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取出復方魚腥草膠囊的內容物，并精密稱取3.0 g于20 mL的錐形瓶中，加入適量甲醇定容后以軟木塞塞緊瓶口，搖晃促進內容物充分溶解均勻后記錄重量，超聲處理（功率500 W）30 min后，并記錄溶液冷卻后重量，計算兩次重量差，以甲醇補齊致兩次重量相等，采用0.45 μm微孔濾膜過濾混合液制成供試品溶液。

2.4 專屬性試驗 取同一供試品溶液根據2.3制備的供試品溶液，采用HPLC色譜法對復方魚腥草膠囊中魚腥草、板藍根、金銀花、連翹、黃芩等進行專屬性試驗，結果顯示復方魚腥草膠囊中魚腥草、板藍根、金銀花、連翹、黃芩專屬性良好。（由于圖譜較多，此處僅以黃芩作為代表，詳細見圖1）。

2.5 線性關系考察 槲皮苷對照品、連翹苷對照品和綠原酸對照品分別精密稱取10.00 mg置于50 mL量瓶中以甲醇定容，表告依春對照品、黃芩苷對照品30.00 mg置于50 mL量瓶中甲醇定容，均超聲溶解，均勻混合各對照品溶液即制備得混合對照品溶液。精密量1.0、2.0、5.0、10.0、25.0 mL混合對照品溶液分別置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖晃使其混合均勻。精密吸取10 μL，根據2.1色譜條件采用HPLC色譜法，記錄峰面積;以對照品的濃度（μg/mL）為橫坐標（X），所測得的峰面積積分值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，槲皮苷回歸方程y=170 121X+867，r=0.999 9（n=5）;綠原酸回歸方程y=31 109X+353，r=0.999 8（n=5）;表告依春回歸方程y=17 112X+42.41，r=0.999 7（n=5）;連翹苷回歸方程y=33 909X+265，r=0.999 8（n=5）;黃芩苷回歸方程y=95 042X+198，r=0.999 9（n=5），結果表明，槲皮苷對照品、連翹苷對照品、綠原酸對照品在4～201 μg/mL范圍內、表告依春對照品、黃芩苷對照品在12～601 μg/mL范圍內的線性關系均良好。

2.6 精密度試驗 精密吸取10 μL按照2.2配制的混合對照品溶液，根據2.1的色譜條件連續(xù)進樣6次，結果顯示槲皮苷、連翹苷、綠原酸、表告依春對照品、黃芩苷峰面積相對標準偏差（RSD）分別是0.45%、0.52%、0.66%、0.59%、0.31%，結果表明此色譜條件下的HPLC儀器精密度良好。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 在室溫下精密吸取10 μL同一份根據2.3配制的復方魚腥草膠囊供試品溶液，配置后分別放置0、1、4、8、12、24 h后進樣檢測，結果顯示復方魚腥草膠囊供試品溶液相對峰面積RSD是1.33%，表明24 h內復方魚腥草膠囊供試品溶液基本穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗 精密吸取10 μL同一批次根據2.3制備的復方魚腥草膠囊供試品溶液，在相同2.1的色譜條件下，在固定的高效液相分析儀上進樣測定，重復檢測5次，結果顯示復方魚腥草膠囊供試品溶液相對峰面積RSD為0.92%，表明該HPLC方法的重復性良好。

2.9 回收率試驗 采用加樣回收法，精密稱取5份已知含量的同一批號樣品各約0.5 g，分別精密加入20 mL混合對照品甲醇溶液（0.005 36 mg/mL），進行回收率試驗測定，計算結果顯示槲皮苷、表告依春、綠原酸、連翹苷和黃芩苷的平均回收率分別為99.10%、99.26%、99.07%、98.05%、98.82%、98.32%，RSD為1.81%、1.49%、0.94%、1.58%、1.01%，表明回收率較好。見表2～6。

2.10 樣品測定結果 復方魚腥草膠囊基于多指標成分定量結果可見，不同廠家不同批次的復方魚腥草膠囊中有效成分槲皮苷、表告依春、綠原酸、連翹苷和黃芩苷的含量存在較大差異。見表7。

3 討論

復方魚腥草膠囊中所含的藥物均具有清熱解毒的功效，魚腥草、板藍根、連翹、金銀花和黃芩等5味藥物，相輔相成，相互作用，共奏清熱解毒的作用。在中醫(yī)的復方組成中，方中的每一味藥物都是不可或缺，至關重要的，因此在多指標成分的選擇上，本研究選擇測定每一味藥物的有效成分，即魚腥草的槲皮苷、板藍根的表告依春、金銀花的綠原酸、連翹的連翹苷和黃芩的黃芩苷，而測定每一味藥物的有效成分含量，對中藥復方的質量優(yōu)劣判定和質量控制是極其重要的[12]。因此在藥物提取溶劑的選擇上采用甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇作為預實驗摸索條件，提取時間以0.5 h、1.0 h和1.5 h作為摸索條件，提取方式選擇超聲提取和回流提取2種摸索條件[13]，結果顯示在超聲提取下70%甲醇，提取1 h對5種藥物的5種有效成分的提取效率最高。另外本研究中設計HPLC色譜法對復方魚腥草膠囊的專屬性進行鑒別研究以對其5味藥物的組成進行定性的質量評價。由于組方的有效成分較多，若這些成分不具有專屬性，則在其他有效成分存在的情況下，對后續(xù)成分含量的檢測過程中就可能因為成分的相互影響而不可避免的造成結果偏差[14]，故而在綜合樣品回收率、穩(wěn)定性、可重復性、精密度、線性考察的基礎上，對HPLC的最佳色譜條件進行反復的試驗和調整。本研究結果HPLC色譜圖顯示復方魚腥草膠囊中槲皮苷、表告依春、綠原酸、連翹苷和黃芩苷的專屬性良好;且在復方魚腥草膠囊的樣品檢測中結果顯示有效成分槲皮苷、表告依春、綠原酸、連翹苷和黃芩苷的含量存在較大差異。

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（2019-01-23收稿 責任編輯：王明）