電針對MPTP亞急性帕金森病模型小鼠步態(tài)運動行為的影響

李中正 盛益華 李思迪 譚靜 魏星 陽仁達

〔摘要〕 目的 研究電針治療早期對帕金森?。≒arkinson's disease， PD）小鼠模型步態(tài)運動行為的影響。方法 步態(tài)運動行為訓(xùn)練合格的C57BL/6小鼠40只，隨機分為對照組、模型組、美多芭組和電針組，每組10只。對照組腹腔注射生理鹽水，模型組、美多芭組和電針組腹腔注射MPTP誘導(dǎo)亞急性PD小鼠模型。對照組、模型組不予干預(yù)，美多芭組給予美多芭灌胃，電針組給予電針“合谷”“太沖”干預(yù)，連續(xù)7 d后進行步態(tài)行為學(xué)實驗、爬桿實驗、懸掛實驗、轉(zhuǎn)棒實驗。結(jié)果 模型組與對照組比較，平均體轉(zhuǎn)角、單支撐時相、雙支撐時相、足跡平均強度、對側(cè)協(xié)調(diào)性、速度、平均步行周期、支撐時相、瞬時速度等步態(tài)指標(biāo)均有明顯變化（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，電針組、美多芭組的單支撐時相_左后、單支撐時相_右后、速度、平均步行周期、瞬時速度_左后、瞬時速度_右后、左前推進指數(shù)、右前推進指數(shù)等步態(tài)指標(biāo)有明顯改善（P<0.05，P<0.01）;模型組與對照組比較，下半部時間、總時間等爬桿指標(biāo)均明顯增加（P<0.01）;模型組與對照組比較，掉落潛伏期、在桿足數(shù)得分等懸掛指標(biāo)均有明顯下降（P<0.05，P<0.01）;模型組與對照組比較，轉(zhuǎn)棒指標(biāo)掉落潛伏期明顯下降（P<0.05）;電針組、美多芭組與模型組比較，爬桿、懸掛、轉(zhuǎn)棒指標(biāo)均無明顯變化（P>0.05）。結(jié)論 電針在治療早期即可改善PD小鼠的步態(tài)運動行為，全自動小鼠步態(tài)分析系統(tǒng)能夠在電針治療早期準確敏感反映PD小鼠步態(tài)運動行為的細微改變。

〔關(guān)鍵詞〕 帕金森病;步態(tài);電針;合谷;太沖

〔中圖分類號〕R245;R742.5? ? ? ?〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.07.019

〔Abstract〕 Objective To study the effects of electroacupuncture on gait movement behavior of Parkinson's disease （PD） model mice at early stage. Methods A total of 40 C57BL/6 mice were randomly divided into a control group， a model group， a Madopar group and an electroacupuncture （EA） group， with 10 mice in each group. The control group was given intraperitoneal injection of normal saline. The sub-acute PD mice models were induced by the intraperitoneal injection of MPTP in the model group， the Madopar group and the EA group. The control group and model group were not intervened. The Madopar group was given intragastric administration of Madopar， and the EA group was given electroacupuncture intervention at "Hegu （LI 4）" and "Taichong （LR 3）". After 7 consecutive days， gait behavior experiment， rod climbing experiment， suspension experiment and rod rotation experiment were carried out. Results Compared with the control group， the gait indexes such as average body rotation angle， single support phase， double support phase， average footprint strength， contralateral coordination， speed， average walking cycle， support phase and instantaneous speed were significantly changed in the model group （P<0.05， P<0.01）. Compared with the model group， the gait indexes of the EA group and the Madopar group were significantly improved （P<0.05， P<0.01）， such as single support phase （left back）， single support phase （right back）， speed， average walking cycle， instantaneous speed （left back）， instantaneous speed （right back）， left forward propulsion index， right forward propulsion index， etc. （P<0.05， P<0.01）. Compared with the control group， climbing rod indexes like the lower half time and the total time in the model group were increased significantly （P<0.01）. Compared with the control group， the suspension indexes such as the drop latency and the number of feet on the rods in the model group were decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. While the drop latency of the rod rotation index was decreased significantly （P<0.05） in the model group compared with the control group. Compared with the model group， there were no significant changes in the indexes of climbing rod， suspension and rotating rod in the EA group and Madopar group （P>0.05）. Conclusion Electroacupuncture can improve the gait movement behavior of PD mice in the early stage of treatment， and the automatic mice gait analysis system can accurately and sensitively reflect the subtle changes of the gait movement behavior of PD mice in the early stage of electroacupuncture treatment.

〔Keywords〕 Parkinson's disease; gait; electroacupuncture; Hegu （LI 4）; Taichong （LR 3）

帕金森?。≒arkinson’s disease， PD）中老年常見的神經(jīng)退行性疾病，臨床上表現(xiàn)為靜止性震顫、肌僵直、運動遲緩和平衡障礙四大主癥，主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部多巴胺（dopamine， DA）能神經(jīng)元進行性變性丟失。臨床研究表明，針刺“合谷”“太沖”可以治療PD，并能降低PD運動并發(fā)癥劑末現(xiàn)象（劑末現(xiàn)象一般定義為規(guī)律用藥≥3次/d，每次服用有效劑量的左旋多巴，可緩解PD癥狀時間<4 h）的發(fā)生[1]。動物實驗表明，電針“合谷”“太沖”可促進帕金森小鼠多巴胺神經(jīng)元突觸可塑性，其細胞分子基礎(chǔ)可能與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的神經(jīng)營養(yǎng)作用、神經(jīng)細胞黏附分子的細胞黏附、對內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的原位誘導(dǎo)和促進多巴胺的合成與重攝取有關(guān)[2]。PD臨床上表現(xiàn)的癥狀非常復(fù)雜，主要表現(xiàn)為運動障礙癥狀和非運動癥狀兩大類[3]，其中運動障礙特征及其干預(yù)改善是目前研究的熱點。本實驗研究電針治療早期（7 d）對1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)亞急性PD模型小鼠步態(tài)運動行為的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物與分組

C57BL/6小鼠，雄性，體質(zhì)量28～30 g，購于斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（湘）20147-0011。實驗期間控制室溫在18～22 ℃，12 h交替照明，小鼠自由飲水、取食。動物于造模前進行步態(tài)、爬桿、轉(zhuǎn)棒和懸掛實驗訓(xùn)練，選取訓(xùn)練合格的40只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機分為對照組（注射生理鹽水），模型組（注射MPTP造模）組，美多芭組（注射MPTP造模，模型建立后開始給予美多芭灌胃給藥），電針組（注射MPTP造模，模型建立后開始給予電針干預(yù)），每組10只。實驗過程中對動物的處置符合2006年國家科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

1.2? 主要試劑與儀器

MPTP（美國Sigma公司，批號M0896），美多芭（上海羅氏制藥有限公司，批號SH3159）;華佗牌針灸針（規(guī)格0.19 mm×10 mm，蘇州醫(yī)藥用品廠有限公司）;華佗牌針刺手法診療儀（型號SXDZ-100，中國蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）;全自動小鼠步態(tài)分析系統(tǒng)（型號MGT-PR，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所、北京鑫海華儀科技有限公司、中國航天員科研訓(xùn)練中心聯(lián)合研制）;轉(zhuǎn)棒式疲勞儀（型號YLS-4C，安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）。小鼠爬桿架（自制）：將一直徑為3 cm的泡沫小球固定于一根長50 cm、粗1.3 cm的金屬桿頂端，金屬桿上纏上紗布。小鼠懸掛線（自制）：固定一根距地面36.5 cm水平放置的電線。

1.3? 模型制作

模型組、美多芭組和電針組在實驗第1天開始腹腔注射MPTP（30 mg/kg），給藥體積0.01 mL/g體質(zhì)量，每天1次，連續(xù)7 d。對照組在實驗第1天開始腹腔注射生理鹽水，劑量計算方法和給藥體積與其余3組相同。

1.4? 干預(yù)方法

電針組：根據(jù)中國針灸學(xué)會實驗針灸分會制定的《動物針灸穴位圖譜》，參照人體經(jīng)穴定位取“合谷”“太沖”。MPTP亞急性PD模型建立后開始電針治療，毫針針刺后不行補瀉手法，接電針診療儀，“合谷”穴接正極、“太沖”穴接負極，參數(shù)為連續(xù)波、100 Hz、1 mA、強度2檔，連續(xù)20 min，每日1次，連續(xù)7 d。

美多芭組：MPTP亞急性PD模型建立后開始按臨床人體給藥劑量折算，6.25 mg/kg，每天灌胃1次，連續(xù)7 d。

對照組、模型組和美多芭組MPTP亞急性PD模型建立后，每天與電針組相同時間相同方法進行抓取、固定，但不給予電針干預(yù)。

上述各組7 d后進行步態(tài)行為學(xué)實驗、爬桿實驗、懸掛實驗、轉(zhuǎn)棒實驗。

1.5? 步態(tài)行為學(xué)實驗

開始實驗前每天每只動物進行3次跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練，連續(xù)7 d，以保證動物可從跑臺的一端不間斷地跑到另一端，訓(xùn)練結(jié)束后進行測試。測試前調(diào)試儀器采光系統(tǒng)，在適當(dāng)?shù)墓饩€條件下，保證動物足印在采集圖像窗口中清晰可見，每只動物不間斷連續(xù)跑過跑臺，并通過高頻攝像機記錄步態(tài)錄像，再通過計算機分析軟件進行圖像分析，計算統(tǒng)計步態(tài)指標(biāo)。

1.6? 爬桿實驗

參照Ogawa等[4]的檢測方法，將一直徑為25 mm的軟木球固定于一根長50 cm粗1 cm的木桿頂端，木桿上纏上紗布以防打滑，然后將被測小鼠放到小球上，并記錄以下幾個時間：小鼠從小球上下來所需要的時間（調(diào)頭時間）、小鼠爬完桿子的上半部所需要的時間、小鼠爬完桿子下半部所用的時間。

1.7? 懸掛實驗

參照Kuribara等[5]的檢測方法，將受試小鼠懸掛于一水平電線上，如小鼠用兩后爪抓住電線則記3分，如用一后爪抓住電線則記2分。如果小鼠兩后爪均抓不住電線則記1分，并記錄各組動物從電線上掉落的潛伏期（s）。

1.8? 轉(zhuǎn)棒實驗

將小鼠置于轉(zhuǎn)棒式疲勞儀上，給予30 s的適應(yīng)時間，然后啟動轉(zhuǎn)棒式疲勞儀，使小鼠在5 r/min的轉(zhuǎn)棒上爬行90 s。將轉(zhuǎn)棒式疲勞儀轉(zhuǎn)速調(diào)為16 r/min，開始記時，小鼠從轉(zhuǎn)棒跌落下來時可以被紅外裝置所監(jiān)測，自動停止記時并顯示小鼠在轉(zhuǎn)桿上運動的時間，記錄小鼠第一次從棒上跌落的時間（潛伏期）。

1.9? 統(tǒng)計學(xué)方法

運用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對所得數(shù)據(jù)進行處理，用“x±s”表示，先對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差分析。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布以及方差齊性則采用LSD法進行組間比較，若符合正態(tài)分布不符合方差齊性則采用Dunnett's T3法， 若不滿足正態(tài)分布則采用秩和檢驗，當(dāng)P<0.05時為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 電針對MPTP亞急性帕金森病小鼠步態(tài)行為的改善作用

模型組與對照組比較，平均體轉(zhuǎn)角、單支撐時相、雙支撐時相、足跡平均強度、對側(cè)協(xié)調(diào)性、速度、平均步行周期、支撐時相、瞬時速度等步態(tài)指標(biāo)均有明顯變化（P<0.05，P<0.01），提示造模成功。

與模型組比較，電針組和美多芭組在單支撐時相_左后、單支撐時相_右后、速度、平均步行周期、瞬時速度_左后、瞬時速度_右后、左前推進指數(shù)、右前推進指數(shù)等步態(tài)指標(biāo)方面，均有明顯恢復(fù)（P<0.05，P<0.01），提示電針組和美多芭組在治療早期（7 d）均可以改善PD小鼠的步態(tài)行為。

與模型組比較，電針組的平均體轉(zhuǎn)角、雙支撐時相_左前_右后、雙支撐時相_左后_右前、右后足跡平均強度等4個步態(tài)指標(biāo)有明顯減少（P<0.05），而美多芭組的改善無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與模型組比較，美多芭組瞬時速度_右前有明顯增加（P<0.05），但電針組的改善無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），說明在某些步態(tài)指標(biāo)方面，電針組和美多芭組的改善作用各有不同。具體見表1。

2.2? 電針對MPTP亞急性帕金森病小鼠爬桿行為的影響

爬桿實驗結(jié)果顯示，模型組與對照組比較，下半部時間、總時間均明顯增加（P<0.01），提示造模成功。電針組、美多芭組與模型組比較，掉頭時間、上半部時間、下半部時間、總時間等爬桿指標(biāo)無明顯變化（P>0.05）。見表2。

2.3? 電針對MPTP亞急性帕金森病小鼠懸掛及轉(zhuǎn)棒行為的影響

懸掛實驗結(jié)果顯示，模型組與對照組比較，掉落潛伏期、在桿足數(shù)得分均有明顯下降（P<0.05，P<0.01），提示造模成功。電針組、美多芭組與模型組比較，掉落潛伏期、在桿足數(shù)得分等懸掛指標(biāo)無明顯變化（P>0.05）。轉(zhuǎn)棒實驗結(jié)果顯示，模型組與對照組比較，掉落潛伏期明顯下降（P<0.05），電針組、美多芭組與模型組比較，轉(zhuǎn)棒掉落潛伏期無明顯變化（P>0.05）。見表3。

3 討論

爬桿實驗、懸掛實驗、轉(zhuǎn)棒實驗是3種目前公認、常用、傳統(tǒng)經(jīng)典的評價帕金森動物運動行為的方法。越來越多的學(xué)者關(guān)注并運用Catwalk自動步態(tài)分析系統(tǒng)來評價各種PD動物模型的行為學(xué)特征和評估治療效果[6-7]，而本研究采用國產(chǎn)的MGT-PR全自動小鼠步態(tài)分析系統(tǒng)，通過封閉式圖像采集系統(tǒng)實現(xiàn)了步態(tài)分析視頻采集系統(tǒng)內(nèi)部穩(wěn)定、均一的光線環(huán)境，步態(tài)實驗可在任何光線環(huán)境下順利進行，且全過程均由計算機自動識別記錄，具有智能化和自動化的優(yōu)點，可從距離、時間、速度、壓力分布和體態(tài)5大方面對動物運動行為進行精確全面的評價，極大得彌補了傳統(tǒng)經(jīng)典方法的不足。

太沖、合谷合稱“四關(guān)”穴，兩穴合用，陰陽相合，互根互用，氣血雙調(diào)，既可養(yǎng)肝血以養(yǎng)經(jīng)脈，又可解肝郁以息肝風(fēng)[1]，是針灸治療PD的常用腧穴。因此本研究中電針組取穴太沖、合谷，并用公認的陽性藥物美多芭對照。本研究采用公認的MPTP誘導(dǎo)亞急性PD模型小鼠造模方法[8]，在步態(tài)行為學(xué)實驗中發(fā)現(xiàn)PD小鼠平均體轉(zhuǎn)角（度）、對側(cè)協(xié)調(diào)性等可反映動物運動協(xié)調(diào)能力的指標(biāo)顯著下降，四肢足跡平均強度和四肢推進指數(shù)可反映動物行走時肢體力量的指標(biāo)也顯著下降等，比傳統(tǒng)的3種方法更為直接準確、客觀敏感。另外，傳統(tǒng)行為學(xué)方法不僅費時，費力，易受主觀因素影響，準確性差，尤其重要的是對動物的刺激較大，比如從轉(zhuǎn)棒或線繩上掉落后對本來就虛弱的小鼠來講，是一個不小的損傷和刺激，對接下來評價或深入機制的研究均可產(chǎn)生一定的影響，而步態(tài)行為學(xué)實驗中小鼠是自發(fā)行走的實驗過程，全程對小鼠未添加較大的刺激。

本研究發(fā)現(xiàn)PD小鼠移動速度發(fā)生非常急劇的下降，步行周期顯著升高，提示小鼠行走整體功能發(fā)生了非常明顯的障礙，而電針對其有明顯的改善作用。本研究通過觀察PD小鼠步行過程中體軸與水平線之間的平均夾角以及標(biāo)準偏差，客觀準確地反映了小鼠步行時體態(tài)的變化規(guī)律。PD小鼠平均體轉(zhuǎn)角發(fā)生顯著變化，平均體轉(zhuǎn)角標(biāo)準偏差有增加的趨勢，提示小鼠對行走方向的控制能力或平衡能力發(fā)生了顯著的下降，且行走的穩(wěn)定性也受到了一定的影響，而電針有明顯的改善作用。本研究發(fā)現(xiàn)PD小鼠對側(cè)協(xié)調(diào)性指數(shù)發(fā)生顯著的異常，提示在行走過程中其行走的協(xié)調(diào)性也出現(xiàn)嚴重的失調(diào)，而電針有明顯的改善作用。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象，PD小鼠后肢的平均足跡強度顯著增加，前肢的推進指數(shù)顯著增加，提示小鼠步態(tài)異常的特點可能是其行走過程中發(fā)生了非常明顯的前肢支撐或著力功能下降，通過后肢代償性的增加支撐或著力功能來完成步行過程（此發(fā)現(xiàn)可能為今后進一步挖掘PD運動功能障礙的神經(jīng)生物學(xué)機制提供重要線索），而電針對這2個步態(tài)指標(biāo)也有明顯的改善作用。

總之，本研究表明PD小鼠的步態(tài)出現(xiàn)嚴重異常，電針“合谷”“太沖”在治療早期（7 d）即可改善小鼠的步態(tài)運動行為，與文獻研究結(jié)果相一致[9]，該研究報告電針預(yù)治療組和電針治療7 d、14 d、21 d、28 d組，均可以改善PD大鼠曠場實驗垂直運動和水平運動的得分。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)模型組小鼠在經(jīng)典的爬桿、懸掛和轉(zhuǎn)棒實驗中均出現(xiàn)了陽性結(jié)果，提示MPTP誘導(dǎo)的亞急性帕金森病模型小鼠造模是成功的。然而與模型組相比，電針組、美多芭組在爬桿、懸掛和轉(zhuǎn)棒實驗中卻未能出現(xiàn)顯著性差異，僅出現(xiàn)了一定的改善趨勢，可能是由于電針組僅實施了7 d干預(yù)，其改善作用程度是目前經(jīng)典的行為評價方法無法捕捉到的。相比之下，全自動小鼠步態(tài)分析系統(tǒng)能夠在電針治療早期準確敏感反映PD小鼠步態(tài)運動行為的細微改變，值得科研中應(yīng)用。

參考文獻

[1] 林? 鐸，賴新生，莊子齊，等.針刺四關(guān)穴治療帕金森病劑末現(xiàn)象的臨床觀察[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2018，42（2）：157-159.

[2] 唐? 勇，余曙光，陳? 瑾.電針對帕金森小鼠黑質(zhì)致密部腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的影響[J].針刺研究，2006，31（1）：38-42.

[3] 李? 軍，劉存勇.中西醫(yī)結(jié)合治療對帕金森患者生活質(zhì)量的影響及臨床療效觀察[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，37（7）：789-791.

[4] OGAWA N， HIROSE Y， OHARA S， et al. A simple quantitative bradykinesia test in MPTP-t reated mice[J]. Research Communications in Chemical Pathology & Pharmacology， 1985，50（3）：435-441.

[5] KURIBARA H， HIGUCHI Y， TADOKORO S. Effects of central depressants on rota-rod and traction performances in mice[J]. The Japanese Journal of Pharmacology， 1977， 27（1）：117-126.

[6] MING Z， ZHANG W， CHANG J， et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson's disease[J]. Neuroscience Letters， 2015， 584：184-189.

[7] KUCINSKI A， ALBIN R L， LUSTIG C， et al. Modeling falls in Parkinson's disease： slow gait， freezing episodes and falls in rats with extensive striatal dopamine loss[J]. Behavioural Brain Research， 2015， 282（6）：155-164.

[8] 呂? 娥，費學(xué)超，李 侃，等.血管活性腸肽對MPTP亞急性帕金森病模型小鼠突觸的影響[J].解剖學(xué)報，2018，49（1）：29-34.

[9] 馬? 駿，王中明，王述菊，等.電針對帕金森病模型大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1α—ASK1-JNK通路的影響[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2018，33（6）：658-680.