野生與種植黃連植株不同部位的生物堿含量比較研究

曾燕 朱俊平 范詩琪 梁慧慧 何紅

〔摘要〕 目的 采用UV和HPLC法比較野生與種植黃連植株不同部位生物堿含量差異。方法 UV法在波長(zhǎng)345 nm處測(cè)定黃連總生物堿含量，HPLC采用C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）色譜柱，乙腈和0.4%磷酸水溶液（25∶75）等度洗脫，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm，柱溫30 ℃以測(cè)定鹽酸小檗堿含量。結(jié)果 黃連不同部位的總生物堿含量：種植黃連根莖含（9.88±0.03）%、須根含（6.41±0.03）%、莖葉含（1.92±0.04）%;野生黃連根莖含（7.95±0.03）%、莖葉含（0.64±0.03）%。黃連不同部位的的鹽酸小檗堿含量：種植黃連根莖含（0.45±0.04）%、須根含（0.17±0.03）%、莖葉含（0.09±0.03）%;野生黃連根莖含（0.38±0.03）%、莖葉含（0.16±0.03）%。結(jié)論 種植黃連植株不同部位的總生物堿含量高于野生黃連，但其鹽酸小檗堿含量低于野生黃連植株;野生與種植黃連均為根莖部總生物堿和鹽酸小檗堿含量最高。

〔關(guān)鍵詞〕 黃連;UV;HPLC;鹽酸小檗堿;生物堿標(biāo)志物

〔中圖分類號(hào)〕R284.1? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.07.014

〔Abstract〕 Objective To compare the alkaloid content in different parts of wild and cultivated Coptis chinensis by UV and HPLC. Methods Determination of total alkaloids in Coptis chinensis by ultraviolet spectrophotometry at 345 nm. HPLC was performed on C18（4.6 mm × 250 mm， 5 μm） chromatographic column by isocratic elution with acetonitrile -0.4% phosphoric acid aqueous （25：75） as mobile phase， the flow rate was 1 mL/min， the injection volume was 10 μL， the detection wave length was 345 nm， the column temperature was set at 30 ℃. Results The content of total alkaloids in cultivated Coptis chinensis： the rhizome， fibrous root， cauline contains （9.88±0.03）%， （6.41±0.03）%， （1.92±0.04）%， respectively; The content of total alkaloids in wild Coptis chinensis： rhizome was （7.95±0.03）%， stem and leaf was （0.64±0.03）%. The content of berberine hydrochloride in cultivated Coptis chinensis： rhizome was （0.45±0.04）%， fibrous root， and stem and leaf contain （0.17±0.03）%， （0.09±0.03）%， respectively. The content of berberine hydrochloride in wild Coptis chinensis： rhizome was （0.38±0.03）%， and that of stem and leaf was （0.16±0.03）%. Conclusion The content of total alkaloids in different parts of cultivated Coptis chinensis was higher than that in wild Coptis chinensis， but the content of berberine hydrochloride was lower than that in wild Coptis chinensis. The rhizome part in both wild and cultivated Coptis chinensis had the highest content of total alkaloids and berberine hydrochloride.

〔Keywords〕 Coptis chinensis; UV; HPLC; berberine hydrochloride; alkaloid markers

隨著中醫(yī)藥臨床療效顯著、臨床應(yīng)用擴(kuò)大，中藥材的需求量越來越大[1]，中藥種植及其GAP應(yīng)運(yùn)而生，極大程度地解決了中藥資源短缺等問題。然而，傳統(tǒng)觀點(diǎn)則認(rèn)為野生中藥材的質(zhì)量均優(yōu)于種植的，無需考察首選野生藥材[2]。也因此使得野藥材的價(jià)位遠(yuǎn)高于種植的。課題組在多年中藥材質(zhì)量研究中發(fā)現(xiàn)，并不是所有的中藥質(zhì)量均為野生優(yōu)于種植，某些種植藥材的質(zhì)量反而優(yōu)于野生的，臨床上種植藥材逐漸取代了野生藥材，不會(huì)因此而影響臨床療效。

黃連為毛茛科植物黃連（Coptis chinensis Franch.）、三角葉黃連（Coptis deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao）或云連（Coptis teeta Wall.）的干燥根莖，主產(chǎn)于四川、重慶、湖南、云南、貴州、陜西等地，具有清熱燥濕、清心除煩、瀉火解毒功效[3]。藥理實(shí)驗(yàn)表明，其主要成分生物堿中的小檗堿具有明顯的抗菌[4-5]、抗炎[6]、抑制乳腺癌細(xì)胞[7-8]、干預(yù)非酒精性脂肪性肝炎[9]、抑制前列腺癌[10]。其功效多而顯著，在臨床上應(yīng)用極廣[11]，既有其單味藥制劑“黃連膠囊”，也有很多其參與的復(fù)方制劑。隨著黃連在臨床使用范圍及中藥茶、中藥保健品開發(fā)等應(yīng)用力度越來越大，黃連的須根、莖葉部位也逐漸打入市場(chǎng)，進(jìn)而存在市售的黃連成藥中極易摻雜使用黃連根莖、須根、莖葉等部位而導(dǎo)致其質(zhì)量不一的現(xiàn)象。因此本研究通過HPLC和UV測(cè)定野生與種植黃連不同部位有效成分鹽酸小檗堿及總生物堿的含量，通過比較分析野生與種植黃連植株不同部位生物堿的含量，揭示其質(zhì)量?jī)?yōu)劣的真實(shí)情況，以期指導(dǎo)臨床使用，確保臨床療效。

1 儀器與試藥

1.1? 儀器

Waters液相色譜儀（Waters 1525）;TU-1900雙光束紫外分光光譜計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）;KQ5200DE型數(shù)控超聲波震蕩儀（上?？茖W(xué)超聲儀器有限公司）;YD601N型電子天平（上海恒平科技儀器有限公司）;YP1002N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司）;超純水機(jī)（長(zhǎng)沙市科臨電子科技有限公司）。

1.2? 試藥

新鮮黃連樣品為實(shí)地采集，有野生黃連（未知年限黃連，多為單只，細(xì)瘦彎曲，狀如蝎尾。）、種植黃連（6年生黃連，根狀莖黃色，微彎曲如蠶狀，具較長(zhǎng)的“過橋”。），均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)石繼連教授鑒定為毛茛科黃連屬黃連（Coptis chinensis Franch.）。及時(shí)將鮮品黃連進(jìn)行清洗、分裝等前處理，分裝為種植黃連根莖、種植黃連須根、種植黃連莖葉;野生黃連根莖、野生黃連莖葉（由于野生黃連植株須根極短而少，故沒有收集處理其須根部位）于-80℃冰箱儲(chǔ)存。

鹽酸小檗堿對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)：86.8%，批號(hào)：110713-200208）購于中國(guó)藥品生物制品檢定所;甲醇（色譜純，LOT：13050085）、乙腈（色譜純，No.0000406281/03）均購自美國(guó)TEDIA公司;磷酸（AR，批號(hào)：20150930）、磷酸二氫鉀（AR，批號(hào)：20170109）、十二烷基磺酸鈉（CP，批號(hào)：20160829），鹽酸（AR，批號(hào)：20131023）、氫氧化鈣（AR，批號(hào)：20161227）均購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1? 對(duì)照品溶液的制備

2.1.1? UV對(duì)照品溶液? UV測(cè)定時(shí)以鹽酸小檗堿計(jì)總生物堿含量，精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每l mL含90.5 μg的對(duì)照品溶液，備用。

2.1.2? HPLC對(duì)照品溶液? “2.1.1”項(xiàng)下同法制得濃度為90.5 μg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，超聲脫氣，0.22 μm的微孔濾膜濾過，即得。

2.2? 供試品溶液的制備[3]

2.2.1? UV供試品溶液? 稱取種植黃連根莖、種植黃連須根、種植黃連莖葉、野生黃連根莖、野生黃連莖葉各0.100 g，剪碎，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液各 50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，備用。

2.2.2? HPLC供試品溶液? 取“2.2.1”項(xiàng)下制得的種植黃連根莖、種植黃連須根、種植黃連莖葉、野生黃連根莖、野生黃連莖葉溶液，超聲脫氣，0.22 μm的微孔濾膜濾過，即得。

2.3? 儀器條件

2.3.1? UV檢測(cè)波長(zhǎng)的確定? 取“2.1.1”和“2.2.1”項(xiàng)下的UV對(duì)照品和供試品溶液，以甲醇為空白，在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，選擇最佳檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm。

2.3.2? HPLC色譜條件? 采用C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為0.4%磷酸水溶液-乙腈（75∶25），等度洗脫30 min;流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm;柱溫30 ℃。

2.4? 方法學(xué)考察

2.4.1? 線性關(guān)系考察? UV法 精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品18.00 mg于5 mL量瓶中加甲醇稀釋定容，記為鹽酸小檗堿對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別量取儲(chǔ)備液125、140、250、500、1 000 μL于10 mL量瓶中甲醇稀釋定容，搖勻，即得0.045、0.05、0.09、0.18、0.36 mg/mL的鹽酸小檗堿溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下條件測(cè)定吸光度。以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為

A=6.439×C-0.01776，r=0.9999。

HPLC法 精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品45.25 mg于5 ml量瓶中加甲醇稀釋定容，記為鹽酸小檗堿對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別量取儲(chǔ)備液1 000、250、125、83.3、62.5、50.0 μL于100 ml量瓶中甲醇稀釋定容，搖勻，既得90.5、22.63、11.31、7.54、5.66、4.53 μg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，并按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為

Y=284166X-127968，r=0.9994。

2.4.2? 精密度試驗(yàn)? UV法 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，適當(dāng)稀釋后，按“2.3.1”項(xiàng)下條件連續(xù)測(cè)定6次，吸光度RSD為0.12%，表明儀器精密度良好。

HPLC法 取“2.2.2”項(xiàng)下鹽酸小檗堿對(duì)照品按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，鹽酸小檗堿峰面積RSD為0.67%，表明儀器精密度良好。

2.4.3? 重復(fù)性試驗(yàn)? UV法 取種植黃連根莖的同一批樣品6份，等量，按“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下條件測(cè)定種植黃連根莖的總生物堿含量，其RSD為1.07%，表明本方法重復(fù)性良好。

HPLC法 取種植黃連根莖的同一批樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，鹽酸小檗堿峰面積的RSD為1.24%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.4? 穩(wěn)定性試驗(yàn)? UV法 取“2.2.1”項(xiàng)下的5個(gè)供試品溶液，分別在0、1、2、4、6、12 h，345 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，甲醇空白，供試品中總生物堿的RSD分別為0.86%、1.37%、1.78%、1.50%、0.99%，表明5個(gè)供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

HPLC法 取“2.2.2”項(xiàng)下的5個(gè)供試品溶液，分別在0、4、8、16、24、48 h進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量10 μL，供試品中對(duì)應(yīng)的鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為1.36%、1.21%、0.98%、1.12%、0.79%，表明5個(gè)供試品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5? 加樣回收試驗(yàn)? UV法 精密稱取種植黃連根莖、種植黃連須根、種植黃連莖葉、野生黃連根莖、野生黃連莖葉各0.100 g，各6份，分別置具塞錐形瓶中，精密加入90.5 μg/mL鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液5 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下處理，“2.3.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，分別計(jì)算回收率。其平均回收率分別為98.05%、97.12%、97.52%、98.03%、97.08%，RSD分別為1.20%、1.12%、1.61%、1.05%、0.84%。表明本方法準(zhǔn)確性良好。

HPLC法 精密稱取種植黃連根莖、種植黃連須根、種植黃連莖葉、野生黃連根莖、野生黃連莖葉各0.100 g，各6份，分別置具塞錐形瓶中，精密加入90.5 μg/mL鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液5 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下處理至“用甲醇補(bǔ)足減失的重量”，搖勻，0.22 μm的微孔濾膜濾過，按“2.3.2”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，分別計(jì)算回收率。其平均回收率分別為98.31%、99.02%、98.52%、98.83%、99.50%，RSD分別為0.97%、1.32%、1.81%、1.25%、1.54%。表明本方法準(zhǔn)確性良好。

2.5? 樣品生物堿含量測(cè)定

2.5.1? UV法? 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備野生與種植黃連不同部位供試品溶液，分別取種植黃連根莖0.4 mL、種植黃連須根0.4 mL、種植黃連莖葉5.0 mL、野生黃連根莖0.4 mL、野生黃連莖葉10.0 mL，于10 mL容量瓶甲醇定容。結(jié)果見表1。

2.5.2? HPLC法? 按“2.2.2”項(xiàng)下制備5種供試品溶液各6批，并按照“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見圖1。采用外標(biāo)法計(jì)算鹽酸小檗堿含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1? 測(cè)定方法的確定

本實(shí)驗(yàn)在2015版《中華人民共和國(guó)藥典》基礎(chǔ)上優(yōu)化了HPLC測(cè)定黃連中鹽酸小檗堿含量的方法，建立了UV測(cè)定黃連中總生物堿含量的簡(jiǎn)易方法，并分別進(jìn)行了方法學(xué)研究。HPLC通過鹽酸小檗堿外標(biāo)法得出種植黃連根莖、種植黃連須根、種植黃連莖葉、野生黃連根莖、野生黃連莖葉的鹽酸小檗堿含量，通過UV法測(cè)定了黃連中總生物堿含量，并對(duì)野生與種植黃連不同部位HPLC差異的總體趨勢(shì)進(jìn)行復(fù)核。兩種方法分析效率高、操作簡(jiǎn)便、測(cè)定結(jié)果均準(zhǔn)確可靠，為黃連的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

3.2? 黃連不同部位含量差異分析

本實(shí)驗(yàn)分析部位主要包括種植黃連根莖、須根、莖葉和野生黃連根莖、莖葉（因野生黃連植株須根極短而少，故野生須根未進(jìn)行分離）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明種植黃連不同部位的鹽酸小檗堿含量及總生物堿含量差異明顯，根莖的鹽酸小檗堿和總生物堿含量均高于須根和莖葉部位;野生黃連植株根莖的鹽酸小檗堿和總生物堿含量遠(yuǎn)高于莖葉部位。通過鹽酸小檗堿含量分析可以鑒別分析黃連植株的不同部位，避免市場(chǎng)上黃連粉質(zhì)量良莠不齊。

3.3? 野生與種植黃連藥用部位含量差異分析

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)野生與種植黃連根莖鹽酸小檗堿含量及總生物堿含量的比較，顯示種植6年生的黃連根莖高于野生未知年限黃連根莖的鹽酸小檗堿含量及總生物堿含量。說明野生黃連質(zhì)量不一定優(yōu)于種植黃連，也可能由于野生黃連為未知年限黃連，但目前野生黃連生長(zhǎng)年限不易確定，而種植黃連為6年生黃連，其有效成分含量差異受生長(zhǎng)年限影響。

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