UV-B輻射對(duì)神農(nóng)香菊萜類物質(zhì)合成及其相關(guān)基因表達(dá)的影響

何淼 王霽佳 高文杰 劉洋 周蘊(yùn)薇

摘 要： 該研究以神農(nóng)香菊為材料，用強(qiáng)度為400 μw·cm-2的紫外光UV-B對(duì)其進(jìn)行輻射處理，輻射時(shí)間分別為0、0.5、1、2、4 h，探討了UV-B輻射對(duì)神農(nóng)香菊萜類物質(zhì)合成及其相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明：（1）較短時(shí)間的UV-B輻射對(duì)神農(nóng)香菊萜類物質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)量有明顯的促進(jìn)作用。與對(duì)照相比，0.5、1、2、4 h處理對(duì)相關(guān)基因表達(dá)量均有不同程度的提高;在2 h處理下HMGR、DXR、TPS、GPS基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值，在4 h處理下FPS和DXS的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值，其中FPS基因表達(dá)量變化最顯著，為對(duì)照的69倍。（2）MVA途徑中，去氫白菖烯、杜松萜烯的含量與FPS基因表達(dá)量4 h內(nèi)持續(xù)上升的變化趨勢(shì)保持一致，1-石竹烯與HMGR的變化趨勢(shì)保持一致，表現(xiàn)為先升高后降低。（3）MEP合成途徑中，α-側(cè)柏酮、崖柏酮、β-側(cè)柏酮的含量呈現(xiàn)與DXR、GPS、TPS基因表達(dá)量相同的變化趨勢(shì)，桉樹腦在UV-B輻射4 h內(nèi)持續(xù)上升，與DXS基因的變化一致。由此可以推斷，UV-B輻射通過影響各自途徑中一些關(guān)鍵基因的表達(dá)量，進(jìn)而影響了神農(nóng)香菊萜類物質(zhì)的合成量。

關(guān)鍵詞： 神農(nóng)香菊， UV-B輻射， 萜類物質(zhì)， 基因表達(dá)

中圖分類號(hào)： S682.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?文章編號(hào)： 1000-3142（2019）07-0933-07

Abstract： In this study， Chrysanthemum indicum var. aromaticum was used as material. We examined the changes of biosynthesis of terpenoid and expression of related genes in C. indicum var. aromaticum following the treatment of different durations （0， 0.5， 1， 2， 4 h） of 400 μw·cm-2 UV-B radiation. The results were as follows： （1） The short time of UV-B radiation could significantly promote the expression of related genes in C. indicum var. aromaticum. Compared with the control， 0.5， 1， 2， 4 h treatment of UV-B radiation increased the expression of related genes. Meanwhile， relative expressions of HMGR， DXR， TPS， GPS reached the peak after two hours’ treatment of UV-B radiation. As well as the relative expressions of FPS and DXS reached the maximum at four hours’ treatment. A significant increase in FPS gene expression was found when plant exposed to four hours of UV-B duration （69 times compared with control）. （2） In mevalonate pathway（MVA）， the contents of calamenene， cadinene increased following the change of FPS gene expression during four hours of UV-B radiation. The change of the content of 1-caryophyllene was consistent with the change of HMGR gene expression， which increased first and then decreased. （3） In the pathway of 2-methyl-D-erythritol-4-phosphate （MEP）， the contents of α-thujone， thujone and β-thujone showed the same trend as the expressions of DXR， TPS and GPS. The content of cajuputole generally increased during four hours’ treatment responding to the change of DXS gene expression. In summary， the data indicate that UV-B radiation can change the regulation of terpenoid biosynthesis in C. indicum var. aromaticum by affecting some key genes’ expressions.

Key words： Chrysanthemum indicum var. aromaticum， UV-B radiation， terpenoid， gene expression

神農(nóng)香菊（Chrysanthemum indicum var. aromaticum）是菊科菊屬植物，分布于湖北神農(nóng)架地區(qū)（劉啟宏和張樹藩，1983），有清熱解毒、殺菌消炎、平肝明目、散風(fēng)降壓的功效（劉啟紅等，1986）。神農(nóng)香菊全株都具有特殊的香氣，因此成為菊科菊屬中重要的芳香型觀賞花卉。神農(nóng)香菊這種自然香氣在菊科植物中十分罕見，不僅具有廣闊的園林應(yīng)用前景，而且對(duì)研發(fā)具有濃香型菊科新品種具有重要的意義。在我們課題組前期的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)神農(nóng)香菊葉片、花瓣表面均密被腺毛。神農(nóng)香菊植株的香氣與腺毛分泌物中的萜烯類等化合物有密切關(guān)系（何淼等，2015），而與萜類化合物合成相關(guān)的基因可以有效調(diào)控植物體內(nèi)的萜類化合物的種類和含量。

萜類化合物是指由不同數(shù)量的異戊二?。–5H8）單元所組成的化合物及其衍生物。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩條主要的萜類物質(zhì)生物合成途徑，甲羥戊酸途徑（mevalonate pathway， MVA）和甲基赤蘚糖醇-4-磷酸途徑（methylerythritol-4-phosphate pathway， MEP ）（Dudareva et al.， 2005）。植物萜類化合物生物合成途徑中的相關(guān)酶種類多種多樣，酶基因不僅決定了后續(xù)反應(yīng)中合成萜類產(chǎn)物的種類，還對(duì)產(chǎn)物積累的量具有重要調(diào)控作用。目前研究較多的有位于MVA 途徑中的HMGR、FPS等（Chappell， 1995;嵇保中等，2007），以及位于MEP途徑的DXS、DXR、GPS等（Malhotra et al.， 2014;張玲等，2013）。而TPS同時(shí)位于兩種途徑的下游，催化底物生成單萜、倍半萜或二萜（Martin et al.， 2012）。這些關(guān)鍵酶基因可以催化形成萜類化合物的各種前體以及中間體（唐亮等，2014），它們位于合成途徑的重要分支點(diǎn)或者在產(chǎn)物形成的下游位置。若是能通過生物學(xué)手段來調(diào)節(jié)這些關(guān)鍵酶基因在植物體內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量，就可以不斷地來提高相關(guān)萜類物質(zhì)的產(chǎn)量。植物萜類化合物的合成在受植物不同發(fā)育階段影響的同時(shí)，昆蟲、病原菌等生物以及光照、溫度、濕度等非生物因子也對(duì)植物萜類的生物合成產(chǎn)生影響（梁宗鎖等，2017）。在光生態(tài)因子中，UV-B輻射是極其重要的一類，它能直接或間接影響植物的形態(tài)、生物量、光合作用、生理代謝、蛋白質(zhì)和核酸等，從而影響植物的生長發(fā)育（蒲曉宏等，2017）。受UV-B輻射后一些植物的基因表達(dá)、酶活性及次生代謝均會(huì)發(fā)生變化（Searles et al.， 2001）。

本研究利用紫外線UV-B對(duì)引種于湖北神農(nóng)架地區(qū)的神農(nóng)香菊進(jìn)行輻射處理，采用GC/MS和qRT-PCR技術(shù)對(duì)不同輻射時(shí)間下的神農(nóng)香菊葉片萜類物質(zhì)及其相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)分析，初步從UV-B輻射對(duì)神農(nóng)香菊萜類物質(zhì)合成及其相關(guān)基因表達(dá)方面進(jìn)行相關(guān)影響的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

神農(nóng)香菊引自湖北神農(nóng)架地區(qū)（110°23′57″ E， 31°28′07″ N），并成功培育于東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院苗圃內(nèi)。2017年5月選取長勢(shì)整齊一致的神農(nóng)香菊健壯莖尖進(jìn)行扦插，待扦插苗生根后，換土上盆，在東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院溫室中培養(yǎng)。植株培養(yǎng)35 d左右，待長出7～8片功能葉時(shí)，取生長健壯、整齊一致、無病蟲害的植株進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 UV-B輻射處理 選擇長勢(shì)一致的神農(nóng)香菊植株，用UV-B 紫外燈（南京華強(qiáng)電子有限公司）進(jìn)行輻射處理。以植株上數(shù)第3片功能葉輻射強(qiáng)度為400 μw·cm-2（由深圳欣寶瑞儀器有限公司生產(chǎn)的UV340B紫外線輻照計(jì)測(cè)定）設(shè)置UV-B 紫外燈輻射強(qiáng)度。將用于試驗(yàn)的神農(nóng)香菊植株分為5個(gè)組，每組5棵，3次重復(fù)。分別輻射0、0.5、1、2、4 h。在5個(gè)不同UV-B輻射時(shí)間內(nèi)取樣，5個(gè)分組各取3 g植株的第3片功能葉片（12～15片葉），使用液氮速凍保存到-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 神農(nóng)香菊萜類物質(zhì)合成相關(guān)基因分析 按照TRNzoI Universal總RNA提取試劑（TIANGEN）說明書提取不同處理后神農(nóng)香菊葉片總RNA，ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，樣品保存于-20 ℃冰箱。依據(jù)神農(nóng)香菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中 HMGR、DXR、TPS、GPS、FPS、DXS基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)引物。根據(jù)熒光定量試劑盒（TransStart Top Green qPCRSuperMix）以CmEF1α為內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。用于qRT-PCR檢測(cè)的引物序列見表1。利用公式2-△△Ct進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算（Livak & Schmittgen， 2001）。

1.2.3 神農(nóng)香菊葉片萜類物質(zhì)提取與分析 將保存于-80 ℃冰箱的神農(nóng)香菊葉片材料放入研缽中充分研磨至粉末狀，先后在3個(gè)裝有100 mL二氯甲烷的燒杯中浸提，分別浸提3次，每次浸提2 s，用裝有20 g無水硫酸鈉的漏斗將浸提液過濾至圓底燒瓶中，接著置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中40 ℃濃縮，隨后將濃縮液移至棕色進(jìn)樣瓶中，并定容至0.5 mL，保存于0 ℃冰箱中備用（Hu et al.， 2012）。

采用GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國Hewlett-Packard公司）對(duì)葉片表面分泌物進(jìn)行分析。GC條件：色譜柱HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱;進(jìn)樣量1 μL;分流比5∶1;程序升溫，首先設(shè)定50 ℃時(shí)間30 min，隨后以5 ℃·min-1的速率升溫至160 ℃，最終設(shè)定溫度升高的速率為10 ℃·min-1，升至270 ℃，溶劑延遲時(shí)間設(shè)為3.5 min。MS條件：以EI源為電離方式，設(shè)置儀器四極桿的溫度為150 ℃，離子源的溫度為230 ℃，接口的溫度為280 ℃，電離能量設(shè)為70 eV，電子倍增器的電壓設(shè)置2 100 V，掃描范疇（m/z）4～500，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫NIST08L。

鑒定方法：采用Turbo Mass 5.4.2 GC/MS軟件對(duì)神農(nóng)香菊的萜類物質(zhì)進(jìn)行分析。利用峰面積歸一法對(duì)每種組分的相對(duì)含量進(jìn)行計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

所得數(shù)據(jù)使用SPASS17.0進(jìn)行相關(guān)性分析，采用Excel 2003進(jìn)行計(jì)算和繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 UV-B輻射對(duì)神農(nóng)香菊萜類物質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響

以神農(nóng)香菊CmEF1α為內(nèi)參基因，在UV-B輻射4 h內(nèi)采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)HMGR、DXR、TPS、GPS、FPS、DXS的表達(dá)強(qiáng)度情況進(jìn)行檢測(cè)，圖1至圖4的結(jié)果顯示如下：隨著UV-B輻射處理時(shí)間的延長，HMGR、DXR、TPS、GPS基因表達(dá)量先升高后降低。HMGR、DXR、TPS、GPS基因表達(dá)量在UV-B輻射期間的前0～1 h平穩(wěn)增長，在輻射的第2小時(shí)相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)明顯升高，均達(dá)到輻射處理期間的最大值，對(duì)比0 h的相對(duì)表達(dá)量差異性顯著，變化幅度也最高，但在隨后的第4小時(shí)卻出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。

FPS和DXS的相對(duì)表達(dá)量在UV-B輻射處理期間出現(xiàn)明顯變化（圖5，圖6），具體表現(xiàn)為FPS基因的相對(duì)表達(dá)量在0.5 h內(nèi)急劇上升后在2 h內(nèi)變化較小，相對(duì)表達(dá)量在第4小時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)FPS基因的相對(duì)表達(dá)量較UV-B輻射處理0 h有顯著性差異，總體上呈現(xiàn)一直上升的趨勢(shì);DXS基因的相對(duì)表達(dá)量在0.5 h內(nèi)變化不明顯，在第1小時(shí)和第2小時(shí)內(nèi)上升迅速，在第4小時(shí)達(dá)到最大值，這時(shí)DXS基因的相對(duì)表達(dá)量較0 h有顯著性差異，總體上呈現(xiàn)一直上升的趨勢(shì)。FPS和DXS的相對(duì)表達(dá)量在UV-B輻射處理期間隨著時(shí)間的延長而一直上升，在第4小時(shí)時(shí)達(dá)到最大值。其中FPS基因表達(dá)量變化最顯著，在4 h為對(duì)照的69倍。

2.2 UV-B輻射對(duì)神農(nóng)香菊萜類物質(zhì)合成的影響

MVA途徑參與植物萜類物質(zhì)中倍半萜、三萜及多萜合成，而MEP途徑參與單萜、二萜和四萜的生物合成。本研究主要研究位于MVA合成途徑的倍半萜α-蓽澄茄油烯、1-石竹烯、去氫白菖烯、杜松萜烯和位于MEP合成途徑的單萜桉樹腦、左旋樟腦、α-側(cè)柏酮、崖柏酮和β-側(cè)柏酮。對(duì)HMGR、DXR、TPS、GPS、FPS、DXS表達(dá)量進(jìn)行分析后，本研究選擇變化較顯著的2 h和4 h進(jìn)行神農(nóng)香菊次生代謝產(chǎn)物中的萜類物質(zhì)合成量的檢測(cè)。

由表2可知，位于MVA合成途徑的烯萜類物質(zhì)的相對(duì)含量隨著UV-B輻射時(shí)間的延長呈現(xiàn)不同趨勢(shì)的變化。α-蓽澄茄油烯呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢(shì)，在0、2、4 h的相對(duì)含量分別為17.04%、15.37%、18.05%;1-石竹烯呈先顯著增加后再減少的趨勢(shì)，0、2、4 h的相對(duì)含量分別為2.61%、28.36%、21.32%。去氫白菖烯和杜松萜烯呈持續(xù)增長的趨勢(shì)。去氫白菖烯在0、2、4 h的相對(duì)含量分別為4.51%、5.32%、7.97%;杜松萜烯在0、2、4 h的相對(duì)含量分別為0.7%、1.65%、3.16%。

隨著UV-B輻射時(shí)間的延長，位于MEP合成途徑的樟腦類桉樹腦的相對(duì)百分含量呈持續(xù)升高的趨勢(shì)，其0、2、4 h分別為4.76%、5.93%、10.63%;左旋樟腦的相對(duì)含量呈持續(xù)降低的趨勢(shì)，在0、2、4 h分別為6.04%、4.1%、2.1%。

MEP合成途徑中醇酮類物質(zhì)α-側(cè)柏酮、崖柏酮和β-側(cè)柏酮的相對(duì)百分含量隨著UV-B輻射時(shí)間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，除α-側(cè)柏酮外4 h時(shí)的相對(duì)含量均高于0 h。α-側(cè)柏酮在處理0、2、4 h時(shí)的相對(duì)含量分別為1.9%、2.63%、1.31%;崖柏酮在0、2、4 h時(shí)的相對(duì)含量分別為0.68%、1.01%、0.97%;β-側(cè)柏酮在0、2、4 h時(shí)的相對(duì)含量分別為6.34%、10.36%、8.36%。

3 討論

UV-B輻射對(duì)植物的遺傳物質(zhì)造成影響，包括對(duì)植物基因表達(dá)的影響（Hartmann et al.， 1998;Safrany et al.， 2008）。Dolzhenko et al.（2010）研究發(fā)現(xiàn)UV-B輻射會(huì)改變胡椒薄荷（Mentha piperita）萜類物質(zhì)生物合成基因的表達(dá)。本研究同樣也發(fā)現(xiàn)UV-B輻射對(duì)神農(nóng)香菊萜類物質(zhì)合成相關(guān)基因HMGR、DXR、TPS、GPS、FPS、DXS的表達(dá)量均產(chǎn)生影響，并且不同的UV-B輻射時(shí)間對(duì)基因表達(dá)量產(chǎn)生不同程度的影響（齊艷等，2014）。MVA途徑中HMGR基因的表達(dá)量在UV-B輻射4 h內(nèi)先升高后降低，而FPS持續(xù)上升。MEP途徑中的DXR、GPS和TPS基因在處理期間先升高后降低，DXS卻持續(xù)上升。根據(jù)這一結(jié)果推測(cè)UV-B輻射對(duì)分屬于同一途徑不同基因的表達(dá)量產(chǎn)生的影響也不完全相同。

植物次生代謝產(chǎn)物的合成主要受合成途徑中的一系列合成酶的活性和基因的表達(dá)量所決定（Broun， 2004）。本研究發(fā)現(xiàn)MVA途徑中，去氫白菖烯、杜松萜烯的相對(duì)含量與FPS基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)保持一致。1-石竹烯與HMGR的變化保持一致。MEP合成途徑中，α-側(cè)柏酮、崖柏酮、β-側(cè)柏酮的相對(duì)含量呈現(xiàn)與DXR、GPS、TPS基因表達(dá)量相同的變化。桉樹腦與DXS基因的變化一致。這些結(jié)果表明，UV-B輻射通過影響各自途徑中一些關(guān)鍵基因的表達(dá)量，進(jìn)而在一定程度上影響了神農(nóng)香菊萜類物質(zhì)的合成量。在植物萜類物質(zhì)代謝途徑中，改變MVA和MEP兩條萜類代謝途徑的關(guān)鍵酶的表達(dá)量，可以影響下游代謝產(chǎn)物的合成量發(fā)生變化（Enfissi et al.， 2005;Morris et al.， 2006）。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UV-B輻射對(duì)神農(nóng)香菊萜類物質(zhì)合成的相關(guān)基因表達(dá)量可產(chǎn)生一定的影響，而且在較短的輻射時(shí)間內(nèi)對(duì)本研究中的酶基因表達(dá)量都有明顯的促進(jìn)作用，在研究的4 h內(nèi)萜類合成相關(guān)基因的表達(dá)量均高于對(duì)照，但對(duì)不同種酶基因的促進(jìn)程度不完全相同。在各自的合成途徑中，本研究中的萜類物質(zhì)大都呈現(xiàn)與該途徑中的關(guān)鍵基因相同的變化趨勢(shì)，在短期UV-B輻射下化合物合成量高于對(duì)照，呈現(xiàn)不同程度的促進(jìn)作用。而位于MVA途徑的α-蓽澄茄油烯在4 h內(nèi)先降低后升高不同于HMGR、FPS這兩個(gè)關(guān)鍵基因的變化趨勢(shì)，位于MEP合成途徑的左旋樟腦相對(duì)含量在4 h內(nèi)持續(xù)降低不同于DXR、GPS、TPS和DXS的變化趨勢(shì)。這一結(jié)果說明萜類物質(zhì)在各自的合成途徑中不只是受一些關(guān)鍵基因的調(diào)控，而是有著更為復(fù)雜的分子機(jī)制，有關(guān)這一機(jī)制有待深入研究。

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