丹參體內(nèi)Sm-miR858對(duì)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子SmPAP1進(jìn)行靶向負(fù)調(diào)控作用研究

陳 芳 佘婷婷 張 琳 高浩天 李國(guó)梁 王 健，*

（1. 安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，安康 725000；2. 陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，西安 710021；3. 教育部藥用植物資源與天然藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和西北瀕危藥材資源開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710062）

MicroRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸的內(nèi)源單鏈非編碼RNA，主要通過(guò)切割靶基因mRNA 或抑制靶mRNA 翻譯來(lái)調(diào)控植物個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育、代謝和環(huán)境脅迫應(yīng)答等生理過(guò)程［1］。隨著在模式植物中對(duì)miRNA調(diào)控次生代謝途徑的研究逐漸深入，越來(lái)越多的證據(jù)顯示miRNAs 在植物，尤其是某些經(jīng)濟(jì)類作物以及藥用植物次生代謝途徑中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。例如，在擬南芥體內(nèi)，miR156通過(guò)對(duì)其靶標(biāo)基因SPL9的下調(diào)進(jìn)而調(diào)控花青素、黃酮醇以及倍半萜等活性成分的含量［2～3］；miR159a 通過(guò)下調(diào)黃酮醇合酶（Flavonol synthase）基 因 調(diào) 控 花 青 素、黃 酮 醇 的 合 成［4］；miR828 通過(guò)觸發(fā)ta-siRNAs 的形成下調(diào)R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因PAP1、PAP2 以及MYB113 的表達(dá)進(jìn)而廣泛調(diào)控花青素的合成［5］。在其他植物中，如蘋果中miR858通過(guò)對(duì)其靶標(biāo)MYB基因家族的下調(diào)調(diào)控花青素以及原花青素的代謝；紅豆杉中miR164 和miR171 對(duì)其體內(nèi)紫杉烷二萜生物合成的調(diào)控［6］；長(zhǎng)春花中miR5021 以及棉花中miR8156和miR8170對(duì)萜類吲哚生物堿合成的調(diào)控［7～8］。

丹參是我國(guó)傳統(tǒng)大宗道地藥材，為唇形科鼠尾草屬植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）的干燥根及根莖。近年來(lái)，隨著對(duì)丹參體內(nèi)次生代謝合成調(diào)控研究的逐漸深入，丹參被視為研究藥用植物次生代謝途徑的理想材料。丹參體內(nèi)活性成分酚酸類化合物由酪氨酸代謝途徑和苯丙烷類代謝途徑兩條支路共同參與而成［9］。在植物次生代謝途徑中，MYB 類轉(zhuǎn)錄因子已被證實(shí)廣泛參與苯丙烷類代謝途徑的調(diào)控［10］。目前對(duì)丹參酚酸類化合物生物合成途徑調(diào)控機(jī)制的研究主要側(cè)重于探討相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子參與關(guān)鍵酶基因表達(dá)的調(diào)控，而轉(zhuǎn)錄因子自身表達(dá)調(diào)控的研究報(bào)道較為少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照株系相比，丹參SmPAP1特異性基因沉默轉(zhuǎn)化株系中酚酸類化合物合成途徑中酶基因以及丹酚酸B 等酚酸類活性含量均呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)［11］。由此推測(cè)SmPAP1 作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與丹參酚酸類活性物質(zhì)的代謝調(diào)控，但目前關(guān)于丹參體內(nèi)SmPAP1的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

鑒于此，研究選取實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)對(duì)丹參Small RNA 高通量測(cè)序獲得的一條成熟miR858（命名為Sm-miR858）為對(duì)象，首先通過(guò)Small RNA Northern blotting 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該Sm-miR858 序列的真實(shí)性，然后基于在線軟件預(yù)測(cè)Sm-miR858 的靶標(biāo)基因，并通過(guò)Real-time PCR 分析Sm-miR858 和潛在靶標(biāo)SmPAP1之間表達(dá)水平的負(fù)相關(guān)性，再通過(guò)煙草瞬時(shí)表達(dá)體系驗(yàn)證Sm-miR858 的表達(dá)量對(duì)SmPAP1 表達(dá)水平的影響，明確丹參體內(nèi)存在的Sm-miR858對(duì)SmPAP1的靶向負(fù)調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

研究所用的植物丹參和煙草幼苗均來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)。用于構(gòu)建Sm-miR858 和Sm-PAP1植物表達(dá)載體的pCambia1302，大腸桿菌DH5α 和根癌農(nóng)桿菌EHA105 均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室。用于overlapping PCR 模板的質(zhì)粒pRSC300（weigel@weigel?world.org.）由中科院遺傳所友情贈(zèng)送提供。cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒Primer ScriptTMRT Reagent Kit、One step Primer miRNA cDNA Synthesis Kit 購(gòu)自中國(guó)大連TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其在煙草葉片中的瞬時(shí)表達(dá)

對(duì)于Sm-miR858 植物過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建，首先利用在線軟件WMD（http：//wmd3.weigelworld.org/）設(shè)計(jì)用于over-Lapping PCR 的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ引物（見(jiàn)表1），然后以質(zhì)粒pRSC300為模板進(jìn)行擴(kuò)增，使其形成合適、對(duì)應(yīng)于載體中擬南芥miR319a與miR319a*之間的“莖環(huán)”狀二級(jí)結(jié)構(gòu)，over-Lap?ping PCR 所采用的方法和步驟均嚴(yán)格按照“Clon?ing of artificial microRNAs”Protocol by Rebecca Schwab操作方法進(jìn)行［12］。隨后以測(cè)序正確的over-Lapping PCR 產(chǎn)物為模板，在引物Ⅰ和Ⅲ兩端分別加上BglⅡ和BstEⅡ酶切位點(diǎn)以形成用于PCR 的上游引物（5′CATGGTNACCgaTTCATTGTCTGTTC?GACCTTA3′）和上游引物（5′CATAGATCTgaTAC?GGTCGAACAGTCAATGAT3′）對(duì)Sm-miR858 與Sm-miR858*之間的前體“莖環(huán)”狀二級(jí)結(jié)構(gòu)序列進(jìn)行再次擴(kuò)增。其后PCR 產(chǎn)物的酶切及其與pCam?bia1302 的連接、重組載體對(duì)農(nóng)桿菌EHA105 的轉(zhuǎn)化均參照文獻(xiàn)［13］所描述的方法進(jìn)行，構(gòu)建的SmmiR858植物過(guò)表達(dá)載體命名為35S：Sm-miR858。

對(duì)于Sm-PAP1 植物過(guò)表達(dá)載體（35S：Sm-PAP1）的構(gòu)建以及包含有重組目的載體農(nóng)桿菌的活化、搖菌、菌液濃度值的測(cè)定、乙酰丁香酮的添加、農(nóng)桿菌液對(duì)煙草葉片的注射等詳細(xì)操作步驟以及注射后煙草植物的培養(yǎng)條件和時(shí)間完全按照文獻(xiàn)［14］里面的操作方法進(jìn)行。

1.2.2 植物RNA 的提取以及Sm-miR858 和Sm-PAP1 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)中植物的總RNA 提取采用鹽酸胍法，試劑配制及具體操作程序均參照Bubier 和Schlappi所述方法進(jìn)行［15］。采用甲醛變性膠進(jìn)行總RNA提取完整度的檢測(cè)。對(duì)于miRNA 表達(dá)豐富的檢測(cè)，為了減少DNA 的干擾，在反轉(zhuǎn)錄之前利用DNaseⅠ對(duì)所提取的總RNA 里面殘存的痕量DNA 進(jìn)行去除，然后使用miRNA 加尾及反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)經(jīng)過(guò)純化的總RNA 里面的miRNAs 進(jìn)行polyA 加尾反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄，詳細(xì)操作步驟均按照One step Primer miRNA cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行。利用（5′TTCATTGTCTGTTCGACCTT3′）和 通 用 引 物Uni-miR qPCR primer （5′GACTGCGATCTCT CTTTTGTATTCC3′）作為Real-Time qPCR（RT-qP?CR）的上、下游引物，丹參及煙草的Ubiquitin 基因作為各自RT-qPCR 的內(nèi)參照基因；對(duì)于Sm-PAP1表達(dá)水平的檢測(cè)，使用常規(guī)cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)經(jīng)純化的總RNA 里面的mRNAs 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以生成cDNAs 鏈。RT-qPCR 反應(yīng)程序及溫度設(shè)定參照“IQTM5 多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 說(shuō)明”進(jìn)行操作，具體引物序列見(jiàn)表1。

表1 Over-lapping PCR和RT-qPCR所用引物序列信息Table 1 List of primers used for Over-lapping PCR and RT-qPCR

1.2.3 Small RNA Northern blotting雜交檢測(cè)

在電泳上樣之前，首先使用50%的PEG 8000以及3.0M 的NaAc 對(duì)提取且經(jīng)過(guò)完整度檢測(cè)的總RNA 進(jìn)行重新沉淀、富集，以增加樣品中miRNAs的濃度。然后配制含有15%尿素的聚丙烯酰胺（PAGE）膠，灌制膠于玻璃槽上，靜置1 h 左右。將RNA 樣品用2×Small RNA 上樣緩沖液稀釋，依次將RNA 樣品加入到上樣孔中，靜置5 min。然后用150 V 的電壓跑膠1.5 h 左右直至樣品到達(dá)膠底部，再進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、交聯(lián)、預(yù)雜交、探針的標(biāo)記、雜交、壓片及曝光等操作，具體操作參照Li 等操作方法［16］。實(shí)驗(yàn)使用T4PNK 對(duì)探針進(jìn)行P32的同位素標(biāo)記以增加雜交檢測(cè)的靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sm-miR858 序列的保守性分析及其真實(shí)性驗(yàn)證

miR858 在相關(guān)植物體內(nèi)的報(bào)道并不多見(jiàn)，截止目前，僅陸續(xù)在擬南芥、番茄、蘋果等植物中被鑒定［6，17～18］，因此，為了研究miR858的序列保守性，本實(shí)驗(yàn)將Sm-miR858 和上述物種中的miR858 序列進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果顯示（見(jiàn)圖1a），7種植物中都具有“UUGUCUGUUCGACCU”這一高度保守的核心序列，但Sm-miR858 的序列長(zhǎng)度只有20nt，其它6 種植物miR858 的序列長(zhǎng)度均為21nt；與擬南芥miR858 相比，Sm-miR858 除了第4 個(gè)核苷酸為A 外，其它位置的核苷酸種類完全一樣；與棉花miR858 相比，Sm-miR858 從第1 個(gè)到第19 個(gè)核苷酸種類完全一樣；與其它3 個(gè)物種的miR858 序列分別存在2～3 個(gè)核苷酸的差異。序列比對(duì)結(jié)果說(shuō)明，與其它已經(jīng)鑒定的miR858相比，Sm-miR858具有高度的序列保守性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SmmiR858 序列在丹參體內(nèi)的真實(shí)存在，本實(shí)驗(yàn)以Sm-miR858 的反向互補(bǔ)序列為探針?lè)謩e對(duì)丹參的根、莖和葉組織進(jìn)行Small RNA Northern blotting 雜交驗(yàn)證，同時(shí)以Sm-miR156 的Small RNA blotting雜交作為陽(yáng)性對(duì)照。雜交信號(hào)結(jié)果顯示（見(jiàn)圖1b），Sm-miR858 在丹參的根、莖和葉組織中均有表達(dá)，葉中表達(dá)水平最高，根中次之，莖中最低，但表達(dá)水平均不高，明顯低于Sm-miR156 在上述組織中的表達(dá)水平，這與研究團(tuán)隊(duì)前期丹參Small RNA 高通量測(cè)序中顯示的不同miRNAs 的Reads是高度一致的，在丹參Small RNA高通量測(cè)序結(jié)果中，Sm-miR156 有33949 個(gè)Reads，而Sm-miR858 僅僅有904 個(gè)Reads?；赟mall RNA blotting 雜交結(jié)果，我們可以確認(rèn)在丹參體內(nèi)該Sm-miR858 序列的真實(shí)性。

2.2 丹參體內(nèi)Sm-miR858靶標(biāo)基因的預(yù)測(cè)

植物miRNA是通過(guò)促進(jìn)靶標(biāo)基因mRNA的降解或翻譯抑制來(lái)負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育等功能作用，因此，為了研究Sm-miR858 的功能，我們首先利用psRNATarget（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/home）（一款專門對(duì)植物miRNA靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè)的在線分析服務(wù)器），以最新的丹參基因組編碼基因CDS 文庫(kù)為對(duì)象對(duì)Sm-miR858 的靶標(biāo)基因進(jìn)行預(yù)測(cè)［19］。在線分析結(jié)果顯示，Expect 值小于2.5 的靶標(biāo)基因共有13 個(gè)，其中MYB 類轉(zhuǎn)錄因子基因10 個(gè)，超大鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白基因1個(gè)，另外兩個(gè)靶基因功能不詳。在這些潛在的靶標(biāo)基因中，有一個(gè)R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因Sm-PAP1（見(jiàn)圖2a）。該基因是一個(gè)重要的參與丹參酚酸類活性物質(zhì)代謝調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子基因，與其他物種中已鑒定的miR858靶標(biāo)基因具有高度的相似性。為了進(jìn)一步分析Sm-miR858 對(duì)靶標(biāo)基因Sm-PAP1 的準(zhǔn)確性，我們挑選了已經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的擬南芥和葡萄中miR858靶標(biāo)基因的作用位點(diǎn)并與Sm-miR858的靶向作用位點(diǎn)進(jìn)行比較分析。位點(diǎn)分析結(jié)果顯示（見(jiàn)圖2b），Sm-miR858 的靶向作用位點(diǎn)位于Sm-PAP1cDNA 的 第290～309 的 核 苷 酸 序 列，AtmiR858 和Vv-miR858 的靶向作用位點(diǎn)分別位于AtMYB104 和VvMYB114 cDNA 序列的第365～385以及第551～571 的片段，這些不同植物中miR858的靶向作用位點(diǎn)在核苷酸序列上具有高度的特異性（見(jiàn)圖2c），都編碼PGRTDNE這樣一段特異的氨基酸多肽序列（見(jiàn)圖2d），該多肽序列呈現(xiàn)高度的保守型，均位于R2R3-MYB 基因家族的R3 結(jié)構(gòu)域內(nèi)。因此，基于上述這些分析結(jié)果，我們認(rèn)為在丹參體內(nèi)Sm-PAP1 是Sm-miR858 的靶標(biāo)基因在理論上是可行的。

2.3 丹參體內(nèi)Sm-miR858 和潛在靶標(biāo)基因Sm-PAP1之間的表達(dá)相關(guān)性分析

運(yùn)用生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)的靶基因僅是理論分析得出的結(jié)果，存在一定的假陽(yáng)性。鑒于在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中miRNA的表達(dá)具有高度的組織及時(shí)空特異性，不同組織中miRNA 及其靶基因共表達(dá)水平相關(guān)性分析的檢測(cè)便成為miRNA生物學(xué)功能研究的重要信息和依據(jù)?；诖?，為了進(jìn)一步分析丹參體內(nèi)Sm-miR858 是否作用于靶標(biāo)基因Sm-PAP1，利用Real-time qPCR 分別對(duì)丹參根、莖、葉及花不同組織中Sm-miR858 和SmPAP1 的組織特異性表達(dá)水平進(jìn)行分子檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（見(jiàn)圖3a），與Small RNA Northern blotting 高度一致，Sm-miR858 在葉中表達(dá)水平最高，然后是花及根中，在莖中的表達(dá)水平最低，葉中的表達(dá)水平幾乎是莖中的5 倍；反觀SmPAP1 的組織表達(dá)水平（見(jiàn)圖3b），在莖中最高，隨后是根中，葉及花中表達(dá)水平均較低，在莖中的表達(dá)水平幾乎是葉中的4倍。二者在丹參相關(guān)各組織中的表達(dá)水平之間存在著明顯的負(fù)相關(guān)性。這種表達(dá)水平之間的負(fù)相關(guān)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步暗示，在丹參體內(nèi)Sm-PAP1的表達(dá)可能被Sm-miR858靶向負(fù)調(diào)控。

2.4 Sm-miR858 靶向負(fù)調(diào)控Sm-PAP1 表達(dá)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

盡管通過(guò)靶標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)果和Sm-miR858、Sm-PAP1 二者之間存在的明顯表達(dá)負(fù)相關(guān)性均表明Sm-miR858 的靶標(biāo)基因是Sm-PAP1，但仍缺少直接的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為了進(jìn)一步確認(rèn)在丹參體內(nèi)存在著Sm-miR858 對(duì)Sm-PAP1 基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控關(guān)系，研究分別構(gòu)建Sm-miR858 和Sm-PAP1 的植物過(guò)表達(dá)載體，利用煙草瞬時(shí)表達(dá)體系將Sm-PAP1植物過(guò)表達(dá)載體和Sm-miR858 植物過(guò)表達(dá)載體在煙草葉片細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)共表達(dá)，以檢測(cè)是否存在Sm-miR858 的過(guò)表達(dá)對(duì)Sm-PAP1 的mRNA 水平進(jìn)行顯著的下調(diào)。為了減少實(shí)驗(yàn)的誤差，隨機(jī)選取被農(nóng)桿菌菌液浸潤(rùn)的3 株煙草植株相近部位的多個(gè)不同葉片進(jìn)行總RNA 的提取以進(jìn)行3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，分析在不同的葉片中不同的SmmiR858 表達(dá)水平對(duì)Sm-PAP1 表達(dá)的影響。首先利用Small RNA Northern blotting 檢測(cè)了在不同煙草葉片細(xì)胞中Sm-miR858 的瞬時(shí)表達(dá)情況，以U6作為總RNA 上樣量?jī)?nèi)參，以檢驗(yàn)Sm-miR858 是否能夠在煙草細(xì)胞中表達(dá)以及表達(dá)序列的真實(shí)性。雜交結(jié)果如圖4a 所示，在3 泳道中都檢測(cè)到了雜交信號(hào)，表明3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組中Sm-miR858 都有表達(dá)，證明構(gòu)建的Sm-miR858 植物過(guò)表達(dá)載體中的人工莖環(huán)結(jié)構(gòu)在煙草細(xì)胞中能夠被正確加工、剪切并表達(dá)；同時(shí)在陰性對(duì)照組（僅含pCambia1302 空載體）中無(wú)任何雜交信號(hào)出現(xiàn)，說(shuō)明在煙草細(xì)胞中不存在與Sm-miR858 一樣的內(nèi)源miRNA 序列存在。但不同實(shí)驗(yàn)組中Sm-miR858 的瞬時(shí)表達(dá)水呈現(xiàn)出一定的差異，2#實(shí)驗(yàn)組煙草葉片中Sm-miR858 的表達(dá)水平最高，1#組中略微降低，3#組中表達(dá)水平最低，推測(cè)造成Sm-miR858 植物過(guò)表達(dá)載體在不同實(shí)驗(yàn)組煙草葉片中的表達(dá)水平不一致的原因可能跟菌液的浸潤(rùn)程度不一致有關(guān)。接下來(lái)對(duì)3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組煙草組織中Sm-PAP1 及Sm-miR858 的瞬時(shí)共表達(dá)水平進(jìn)行了Real-time qPCR 檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示（見(jiàn)圖4b），與陰性對(duì)照組（僅含35S：Sm-PAP1 表達(dá)載體）相比，3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組中Sm-PAP1 的mRNA 水平在Sm-miR858 過(guò)表達(dá)情況下均出現(xiàn)下降，且Sm-PAP1 mRNA 水平下降的程度與SmmiR858 的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)性，即在2#實(shí)驗(yàn)組中Sm-miR858 的表達(dá)水平最高，Sm-PAP1 的mRNA 表達(dá)水平最低；而在3#實(shí)驗(yàn)組中SmmiR858 的表達(dá)水平最低，Sm-PAP1 的mRNA 表達(dá)水平相對(duì)較高，呈現(xiàn)出顯著的“劑量效應(yīng)”。由于在上述煙草瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中Sm-PAP1 的mRNA 表達(dá)水平直接受Sm-miR858 表達(dá)水平的調(diào)控，因此，可以證明Sm-PAP1 在mRNA 表達(dá)水平上確受Sm-miR858的靶向負(fù)調(diào)控。

3 討論

近年來(lái)，通過(guò)構(gòu)建小RNA 文庫(kù)進(jìn)行直接測(cè)序和利用生物學(xué)信息法（in silico）已經(jīng)獲得了許多植物物種的不同miRNA 序列，如miR858在擬南芥和其它一些植物物種中已陸續(xù)被鑒定。然而大部分miR858 在植物體內(nèi)的生物學(xué)功能仍未知，特別是在一些重要的藥用植物如丹參中的生物學(xué)功能急需研究清楚。目前對(duì)丹參酚酸類活性成分合成途徑調(diào)控機(jī)制的研究主要側(cè)重于探討相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子參與關(guān)鍵酶基因表達(dá)調(diào)控上，而對(duì)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子自身表達(dá)調(diào)控尤其是如何被體內(nèi)相關(guān)miRNA調(diào)控的研究報(bào)道較少。研究團(tuán)隊(duì)前期通過(guò)對(duì)丹參Small RNA 高通量測(cè)序獲得了一條在其他植物中已經(jīng)鑒定出來(lái)的miR858高度相似的miRNA 序列，命名為Sm-miR858。丹參是傳統(tǒng)大宗道地藥材，隨著對(duì)丹參體內(nèi)次生代謝合成調(diào)控研究的逐漸深入，丹參已被視為研究藥用植物次生代謝途徑的理想研究材料。但截至目前Sm-miR858 在丹參體內(nèi)的生理功能尚不清楚，本研究圍繞Sm-miR858在丹參體內(nèi)的生理功能展開(kāi)研究，為深入研究丹參體內(nèi)次生代謝合成調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)miR858 的靶標(biāo)基因絕大多數(shù)都屬于MYB 類轉(zhuǎn)錄因子，尤其是R2R3-MYB 類轉(zhuǎn)錄因子，比如在擬南芥中4個(gè)與黃酮類合成密切相關(guān)的R2R3-MYB 被miR858 靶向調(diào)控，棉花中多達(dá)20 個(gè)R2R3-MYBs，蘋果中66 個(gè)MYBs，其中絕大多數(shù)都與苯丙烷類代謝途徑相關(guān)［6，17，20］。除了miR858 對(duì)MYB 類基因進(jìn)行靶向調(diào)控外，miR828 也對(duì)一些MYB 類轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行調(diào)控，并且作用位點(diǎn)均位于MYB 基因的高度保守的R3 結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的核苷酸序列區(qū)。MiR858 的作用位點(diǎn)在miR828 作用位點(diǎn)的上游區(qū)，并且作用位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的核苷酸序列更為保守［6］。在研究miRNA 作用靶標(biāo)基因預(yù)測(cè)結(jié)果中，顯示Sm-PAP1 是Sm-miR858 潛在的靶標(biāo)基因。有研究表明，Sm-PAP1 是一個(gè)重要的參與丹參體內(nèi)酚酸類代謝途徑調(diào)控的R2R3-MYB 類轉(zhuǎn)錄因子［11］。從不同植物miR858 核心種子區(qū)序列比對(duì)來(lái)看，丹參Sm-miR858和其他已經(jīng)鑒定的miR858s完全一致。因?yàn)閙iRNA核心種子區(qū)與靶標(biāo)基因作用位點(diǎn)核苷酸序列之間的堿基互補(bǔ)配對(duì)狀況對(duì)miRNA 的剪切或翻譯抑制作用是至關(guān)重要的，在這個(gè)區(qū)域序列的差異將直接影響miRNA的剪切或翻譯抑制效率。從Sm-miR858 對(duì)Sm-PAP1 作用位點(diǎn)來(lái)看，其核苷酸序列及其對(duì)應(yīng)的氨基酸保守序列PGRTDNE 也是高度一致的，顯示出了不同植物中miR858 功能的高度保守性。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)靶標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示Sm-miR858 的潛在靶標(biāo)基因僅有Sm-PAP1，并且在我們的丹參Small RNA 高通量測(cè)序結(jié)果中也沒(méi)有相關(guān)的miR828 序列出現(xiàn)，這似乎與其他雙子葉植物中MYB 類轉(zhuǎn)錄因子被miR858和miR828 雙重調(diào)控現(xiàn)象不一致。我們分析出現(xiàn)這種結(jié)果的可能原因有兩方面，一方面是研究所提供的丹參cDNA 文庫(kù)的基因表達(dá)信息量不夠?qū)е耂m-miR858 的預(yù)測(cè)靶標(biāo)沒(méi)有出現(xiàn)；另一方面可能是丹參Small RNA 高通量測(cè)序深度不夠沒(méi)有檢測(cè)到丹參體內(nèi)MiR828的序列信息。

總之，論文依次對(duì)從丹參Small RNA高通量測(cè)序獲得的Sm-miR858 進(jìn)行序列真實(shí)性驗(yàn)證、靶標(biāo)預(yù)測(cè)以及Sm-miR858 與Sm-PAP1 之間表達(dá)相關(guān)性等進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究。研究結(jié)果證實(shí)在丹參體內(nèi)Sm-PAP1 是Sm-miR858 的靶標(biāo)基因。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為在miRNA水平通過(guò)基因工程提高丹參體內(nèi)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)奠定了理論基礎(chǔ)。

致謝 感謝陜西師范大學(xué)王喆之教授在實(shí)驗(yàn)構(gòu)思上所給予的指導(dǎo)和幫助。