大孔樹(shù)脂純化巖高蘭多酚的工藝研究

高 媛 邢文馨 王慧梅*

（1. 東北林業(yè)大學(xué)，森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，哈爾濱 150040；2. 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040）

巖高蘭（Empetrum nigrum）是巖高蘭科（Empe?traceae）巖高蘭屬（Empetrum）植物，巖高蘭科共有3 屬10 種，而在中國(guó)，巖高蘭科僅有巖高蘭1 個(gè)變種，是國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物［1～2］。在我國(guó)主要分布在東北部大興安嶺的高海拔地區(qū)，在吉林省長(zhǎng)白山高海拔地區(qū)也有很少的分布［3］。作為一種珍貴的藥用植物，巖高蘭具有獨(dú)特的生物學(xué)特性和藥用價(jià)值。

巖高蘭中含有豐富的黃酮類、黃酮醇類、黃烷三醇類、酚酸類等多酚類化合物［4～5］。近年來(lái)，多酚類化合物因其強(qiáng)大的生物活性功能，如抗氧化、抗輻射、防治心腦血管疾病、預(yù)防癌癥等，越來(lái)越受到人們的關(guān)注［6～7］。植物多酚還具有解酒護(hù)肝、抗炎鎮(zhèn)痛、保護(hù)牙齒等作用［8］。因此，巖高蘭具有很好的開(kāi)發(fā)利用前景。

研究表明，巖高蘭的地上部分具有良好的抗血管生成、抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性［5，9～10］。大孔吸附樹(shù)脂法作為一種高效、綠色分離提取技術(shù)，具有選擇性高、干擾因素少、可重復(fù)循環(huán)利用等特點(diǎn)，從而被廣泛用于化工、醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域［11～12］。目前還未有通過(guò)大孔樹(shù)脂富集純化巖高蘭地上部分多酚的報(bào)道，因此本研究將利用大孔樹(shù)脂法提取巖高蘭地上部分的多酚，為巖高蘭多酚的提取純化工藝提供新的技術(shù)路線和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 巖高蘭多酚樣品的制備

將巖高蘭的地上部分（莖和葉）洗凈烘干，用粉碎機(jī)粉碎樣品并過(guò)60目篩。精確稱取10 g巖高蘭樣品粉末，加入400 mL 醋酸鹽緩沖溶液（50 mmol·L-1，pH=5）。精確吸取387 U·g-1單寧酶、224 U·g-1纖維素酶加入到樣品溶液中，在38℃下以125 r·min-1培養(yǎng)3.4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，在錐形瓶中加入無(wú)水乙醇，使此時(shí)瓶?jī)?nèi)的乙醇濃度為60%。將其置于42℃、300 W 的超聲波清洗儀中超聲22 min后，在9 600×g 離心10 min，將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去溶劑，備用。

1.2 多酚含量的測(cè)定

采用Folin-ciocalten 法測(cè)定巖高蘭中多酚的含量［13］，并以沒(méi)食子酸為對(duì)照。精確吸取1.0 mL 樣品于試管中，并加入2.5 mL，濃度為0.2 mol·L-1的Folin-ciocalten 試劑。將試管充分振蕩后靜置3～4 min，加入0.8 mL，濃度為10%的Na2CO3溶液，定容到10 mL。搖勻后置于25℃恒溫水浴中反應(yīng)2 h。同時(shí)做試劑空白，于765 nm 下測(cè)定吸光度。以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，確定其回歸方程為Y=0.348X+0.005，R2=0.999 3。

1.3 大孔吸附樹(shù)脂的篩選

1.3.1 樹(shù)脂預(yù)處理

將不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂在95%乙醇中浸泡24 h，使其充分腫脹；采用濕法裝柱，用蒸餾水沖洗至無(wú)醇味；用5% HCl 溶液浸泡4 h，用蒸餾水沖至流出液為中性；用5%NaOH溶液浸泡4 h，用蒸餾水沖至流出液為中性；將沖洗后的樹(shù)脂在蒸餾水中浸泡24 h，收集備用［14］。具體樹(shù)脂類型及其參數(shù)見(jiàn)表1［15］。

表1 6種類型大孔吸附樹(shù)脂物理參數(shù)Table 1 Physical parameters of six types of macropo‐rous resins

1.3.2 樹(shù)脂含水率的測(cè)定

將預(yù)處理好的大孔樹(shù)脂分別精密稱取1.0 g，在90℃下烘干至恒重，稱取質(zhì)量。計(jì)算不同型號(hào)樹(shù)脂的平均含水率。每組實(shí)驗(yàn)做三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 靜態(tài)吸附試驗(yàn)

分別稱取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的6 種大孔樹(shù)脂各1.0 g，置于100 mL 具塞錐形瓶中，再加入25 mL 0.4 mg·mL-1的巖高蘭多酚粗提液。在30℃，100 r·min-1的恒溫?fù)u床中充分振蕩吸附8 h。取1 mL上清液，按照Folin-Ciocalteu 法測(cè)定A 值、計(jì)算其多酚濃度，并計(jì)算各樹(shù)脂的吸附率。

式中：C0、C1為吸附前、后吸附液中多酚濃度。

1.3.4 靜態(tài)解吸附試驗(yàn)

將靜態(tài)吸附后的樹(shù)脂過(guò)濾，用5 BV 蒸餾水沖洗除雜，并吸干表面水分。再置于具塞錐形瓶中，加入25 mL 60%乙醇，在30℃，100 r·min-1恒溫?fù)u床中充分解吸附8 h，取1 mL 上清液，測(cè)定A 值并根據(jù)下式計(jì)算解吸率。

式中：C2為解吸液多酚濃度。

1.4 動(dòng)態(tài)曲線的測(cè)定

1.4.1 動(dòng)態(tài)吸附曲線的測(cè)定

取0.4 mg·mL-1粗 提 物 上 樣 液100 mL，以1 mL·min-1的流速上樣至裝有最佳大孔吸附樹(shù)脂5 g的層析柱（15 mm×200 mm）中，每流出10 mL 收集一份流出液。測(cè)定各流出液多酚的質(zhì)量濃度。以上樣液體積為橫坐標(biāo)，流出液質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制動(dòng)態(tài)吸附曲線。

1.4.2 動(dòng)態(tài)解吸曲線的測(cè)定

采用5 BV 蒸餾水除去樹(shù)脂間的雜質(zhì)，用60%乙醇以1 mL·min－1的流速進(jìn)行解吸附，每流出5 mL 收集一份解吸液，共收集10 份。測(cè)定解吸液中巖高蘭多酚的質(zhì)量濃度。以解吸液體積為橫坐標(biāo)，流出液質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制動(dòng)態(tài)解吸曲線。

1.5 響應(yīng)面法優(yōu)化提取純化工藝設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果（數(shù)據(jù)未列出），選取對(duì)巖高蘭多酚提取效果影響較大的上樣濃度、乙醇濃度、洗脫流速、洗脫體積為考察因素，以提取率為響應(yīng)值，利用Design Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定巖高蘭多酚的最佳提取工藝。試驗(yàn)因素水平及編碼見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)因素水平及編碼Table 2 Test factor levels and codes

1.6 驗(yàn)證試驗(yàn)與放大試驗(yàn)

1.6.1 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得到大孔樹(shù)脂純化巖高蘭多酚的最佳工藝。在該條件下進(jìn)行3 次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得在最佳工藝條件下巖高蘭多酚的實(shí)際值。并計(jì)算與理論值的相對(duì)誤差百分?jǐn)?shù)、純化前后多酚的純度及回收率，具體公式如下：

式中：V1為上樣液體積；V2為解吸液體積；M0為洗脫液干燥后樣品的質(zhì)量。

1.6.2 放大試驗(yàn)

前期試驗(yàn)使用的層析柱均為15 mm×200 mm小型柱，故在實(shí)際操作過(guò)程中，管壁效應(yīng)等一些不確定因素會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響［16］。為確定試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，采用40 mm×400mm 中型柱進(jìn)行30倍放大試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔吸附樹(shù)脂的篩選結(jié)果

通過(guò)對(duì)6種類型的大孔樹(shù)脂進(jìn)行含水率、吸附率和解吸率3種性能的考察，可以發(fā)現(xiàn)AB-8、D101和HPD-600 型大孔樹(shù)脂的含水率和吸附率較高，分別達(dá)到73%以上和62%以上；HPD-100、X-5、和HPD-600 的解吸率較高，可以達(dá)到53%以上。結(jié)合表中數(shù)據(jù)綜合分析，HPD-600 型大孔樹(shù)脂的含水率為76.74%、吸附率為72.49%、解吸率為77.25%，均為最高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），故可確定HPD-600 型大孔樹(shù)脂為純化巖高蘭多酚的最佳樹(shù)脂（具體結(jié)果見(jiàn)表3）。

表3 6種類型大孔樹(shù)脂的含水率、吸附率、解吸率Table 3 Moisture content，adsorption rate and desorp‐tion rate of six types of macroporous resin

2.2 動(dòng)態(tài)曲線的繪制

由圖1A可知，當(dāng)上樣液體積為10 mL時(shí)，巖高蘭多酚開(kāi)始少量泄露，隨著上樣液體積的增大，流出液中多酚的濃度呈上升趨勢(shì)。當(dāng)上樣液體積達(dá)到40 mL 后，可能由于大孔樹(shù)脂的吸附達(dá)到飽和，故隨著上樣體積的增加，流出液巖高蘭多酚的質(zhì)量濃度趨于平緩［17］，故確定上樣體積為40 mL。

由圖1B 可知，60%乙醇對(duì)巖高蘭多酚的洗脫效果良好。當(dāng)洗脫體積為10 mL 時(shí)，可以獲得較純的巖高蘭多酚解吸液，當(dāng)洗脫液體積大于10 mL后，多酚質(zhì)量濃度開(kāi)始下降。故確定10 mL 為解吸液最適體積。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 巖高蘭多酚濃度回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

HPD-600 型大孔樹(shù)脂提取純化巖高蘭多酚的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4。

通過(guò)Design Expert.V8.0.6 軟件進(jìn)行回歸擬合分析［18］，建立提取條件和提取率之間的二次多項(xiàng)式模型為：

Y=209.83+37.15A-0.55B10.16C+58.48D+1.20 AB+9.73AC+9.75AD+12.37BC-3.52BD-16.78CD-37.78A2-32.77B2-19.35C2-44.42D2

二次回歸模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。由表可知，本模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.000 1），各因素影響程度依次為洗脫體積（D）>上樣濃度（A）>洗脫流速（C）>乙醇濃度（B）。其具備良好的準(zhǔn)確性和通用性（R2=0.9359，R2adj=0.871 9），因此可以用此模型進(jìn)行大孔樹(shù)脂純化巖高蘭多酚的分析與檢測(cè)。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 The experiment design and results of Box-Behnken

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化的交互作用

響應(yīng)面分析各因素之間的交互作用對(duì)巖高蘭多酚提取率的影響見(jiàn)圖2。圖2A 為上樣濃度和乙醇濃度對(duì)提取率的影響。當(dāng)乙醇濃度一定時(shí)，上樣濃度由0.60%增加至0.87%，多酚提取率增加趨勢(shì)顯著，當(dāng)上樣濃度大于0.87%后，提取率略微降低。如圖2B 所示，提取率隨著上樣濃度和洗脫流速的提高有先上升后下降的趨勢(shì)。上樣濃度對(duì)提取率影響的顯著性要明顯大于洗脫流速對(duì)其的影響，當(dāng)上樣濃度保持不變時(shí)，隨著洗脫流速的增大，提取率增加的趨勢(shì)較為平緩，達(dá)到最大值后，呈緩慢下降的趨勢(shì)。由圖2C 可知，隨著上樣濃度和洗脫體積的增大，提取率急劇增大，其3D 圖呈一個(gè)開(kāi)口朝下的陡峭的曲面。當(dāng)上樣濃度一定時(shí)，洗脫體積由1.0 BV 增至2.8 BV 的過(guò)程中，提取率一直急劇增加，當(dāng)洗脫體積大于2.8 BV 后，提取率才出現(xiàn)了緩慢降低的趨勢(shì)。從圖2D 可以看出，隨著乙醇濃度和洗脫流速的改變，提取率變化不明顯。由此可見(jiàn)，乙醇濃度和洗脫流速對(duì)提取率影響的程度較小。圖2E 為乙醇濃度和洗脫體積對(duì)提取率的影響。乙醇濃度較低時(shí)，洗脫體積與提取率呈正相關(guān)，洗脫體積越大，提取率越大；但當(dāng)洗脫體積大于2.7 BV 時(shí)，提取率略有降低。從圖2F 中可以看出，當(dāng)洗脫體積保持不變時(shí)，洗脫流速在0.50～0.91 mL·min-1的范圍內(nèi)，提取率略有上升；當(dāng)洗脫流速大于0.91 mL·min-1后，提取率逐漸降低。

表5 二次回歸模型的方差分析Table 5 Analysis of variance of quadratic regression model

綜上所述，分析可知最優(yōu)純化工藝條件為：上樣濃度0.84 mg·min-1；乙醇濃度62.15%；洗脫流速0.67 mL·min-1；洗脫體積2.71 BV。在此條件下，巖高蘭多酚提取率為229.18 mg·g-1。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)與放大試驗(yàn)

2.4.1 驗(yàn)證試驗(yàn)

考慮實(shí)際操作的便利性與局限性，將最佳提取工藝條件修正為［19］：上樣濃度0.85 mg·mL-1；乙醇濃度62%；洗脫流速0.65 mL·min-1；洗脫體積2.70 BV。在該條件下進(jìn)行3 次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得巖高蘭提取率為230.61 mg·g-1與理論值（229.18 mg·g-1）相對(duì)誤差為0.62%，說(shuō)明該提取方法具有準(zhǔn)確性和可靠性，可應(yīng)用為大孔樹(shù)脂提取純化巖高蘭多酚的工藝路線。在最佳工藝的基礎(chǔ)上，計(jì)算得出純化后多酚純度由8.11% 提高到22.56%，回收率為67.78%。

2.4.2 放大試驗(yàn)

通過(guò)將HPD-600 型大孔樹(shù)脂進(jìn)行放大30 倍試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后巖高蘭多酚提取率為253.38 mg·g-1，而純化前多酚提取率為56.47 mg·g-1，我們可以看出經(jīng)樹(shù)脂純化后的多酚產(chǎn)量明顯提高，純化后多酚濃度為純化前多酚濃度的4.49 倍。因此HPD-600 型大孔樹(shù)脂可用于巖高蘭多酚的提取純化。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用大孔吸附樹(shù)脂提取純化巖高蘭中的多酚，通過(guò)對(duì)6種樹(shù)脂含水率、吸附率、解吸率性能的篩選，選擇HPD-600 型樹(shù)脂作為最佳的樹(shù)脂。并通過(guò)動(dòng)態(tài)吸附、解吸試驗(yàn)確定上樣體積和解吸體積分別為40 和10 mL。采用響應(yīng)面法對(duì)純化條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝條件下的多酚提取率為229.18 mg·g-1。經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后多酚純度由8.11%提高到22.56%，回收率為67.78%。因此，大孔樹(shù)脂對(duì)巖高蘭多酚具有較好的純化效果，且工藝選擇性強(qiáng)、環(huán)保性高、成本低廉，可為巖高蘭的深入研究提供參考。