桑葉中生物堿提取工藝的優(yōu)化和功能活性研究

葉甜 謝翰祥 嚴(yán)喜鸞

摘 要：目的：優(yōu)化桑葉生物堿超聲輔助提取法工藝，同時(shí)探究桑葉生物堿在降血脂血糖方面的作用。方法：利用單因素試驗(yàn)分別優(yōu)化超聲提取工藝中的提取試劑比例、提取時(shí)間、提取溫度和提取次數(shù)，然后利用最優(yōu)組合得到桑葉生物堿提取物，以此灌胃小鼠4周后，收集小鼠血液，利用試劑盒測(cè)定小鼠血脂和血糖含量。單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示：找到桑葉生物堿的最佳提取試劑比例、提取時(shí)間、提取溫度和提取次數(shù)分別為70%乙醇、20min、50℃和2次。血糖血脂實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：和正常對(duì)照組相比，灌胃高劑量桑葉生物堿4周能使小鼠血液中的TC、TG含量分別顯著下降19.40%、17.32.% （P<0.05），空腹血糖水平顯著下降9.19%（P<0.05）。結(jié)論：當(dāng)用70%乙醇在50℃條件下提取桑葉中生物堿20min，并提取2次時(shí)，可使生物堿得率最高。桑葉生物堿具有較好的預(yù)防高血脂、高血糖效果。

關(guān)鍵詞：桑葉;生物堿;提取工藝;降血糖;降血脂

中國(guó)是世界上的種植大國(guó)之一，有著悠久的農(nóng)耕文明。小麥、水稻、大豆、花生、玉米等多種農(nóng)作物都是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，除了糧食型種植業(yè)外，還有其他許多生產(chǎn)型種植業(yè)，例如茶葉、桑蠶業(yè)、果蔬等。其中，種桑養(yǎng)蠶在我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)著重要地位，早在幾千年前，我國(guó)就已經(jīng)開(kāi)始了桑蠶業(yè)的生產(chǎn)發(fā)展。我國(guó)的桑樹(shù)種類豐富，種植面積大，產(chǎn)量高，桑樹(shù)所產(chǎn)的桑葉多用于養(yǎng)蠶業(yè)，但是由于養(yǎng)蠶所需的桑葉數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其產(chǎn)量，導(dǎo)致了大量的桑葉資源浪費(fèi)[1-3]?，F(xiàn)代化學(xué)分析手段顯示，桑葉中含有豐富的黃酮、多糖、生物堿、多酚、礦物質(zhì)等成分，能在抗炎癥、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、降血壓血糖等方面為人類健康保駕護(hù)航[4-5]。為此，有諸多學(xué)者在桑葉的保健功能及相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)方面進(jìn)行了許多研究和探索，希望能夠在一定程度上解決人類的健康問(wèn)題，同時(shí)進(jìn)一步提升桑葉的商業(yè)價(jià)值，實(shí)現(xiàn)更大的經(jīng)濟(jì)效益。目前，關(guān)于桑葉中生物堿的研究是一個(gè)熱點(diǎn)。生物堿在桑葉中有著較高的含量，特殊的多羥基結(jié)構(gòu)使得它具有許多生理功能，生物堿的含量高低是衡量桑葉質(zhì)量好壞的一個(gè)重要指標(biāo)[6-8]。關(guān)于生物堿的提取方法主要為熱浸提法、超聲或微波輔助提取法，前者具有加熱溫度高、時(shí)間長(zhǎng)的缺陷，后者相對(duì)改善了這些缺點(diǎn)，是目前最常用的提取方法[9-10]。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別探究最佳的提取試劑比例、提取時(shí)間、提取溫度和提取次數(shù)，尋找這些單因素之間的最優(yōu)組合;然后以此條件進(jìn)行桑葉中生物堿的提取，探究生物堿的降糖降脂效果，為桑葉保健品的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉，湖北省中藥材公司，品種為勝利大葉;1-脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)品（DNJ），北京德威鈉生物技術(shù)有限公司，純度為色譜級(jí);40只4周齡昆明種清潔級(jí)雄鼠（體重20±2g）和基礎(chǔ)飼料、高脂飼料，重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售有限公司;總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血糖測(cè)定用試劑盒，南京建成生物工程研究所;乙腈，天津四友化工試劑廠;其他所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2010型高效液相色譜儀，日本島津公司;超聲清洗儀，天津賽恩斯科學(xué)儀器有限公司;M680型酶標(biāo)儀，美國(guó)伯樂(lè)公司;H2500R-2型冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生物堿含量的測(cè)定 配置標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱量10.0mg DNJ標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，得到濃度為1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別吸取1、2、3、4、5mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，得到濃度為100、200、300、400、500μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。參照文獻(xiàn)[11]和[12]中DNJ的衍生方法和色譜條件設(shè)置，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的曲線方程為y=4 452.3x-215 93 （R2=0.999 4）。提取液中生物堿含量測(cè)定：在上述測(cè)定條件下測(cè)得樣品的峰面積，代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出樣品溶液的生物堿濃度。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 用清水將桑葉清洗干凈，晾干，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過(guò)60目篩。準(zhǔn)確稱取50g桑葉粉末，分別以50%、60%、70%、80%、90%的乙醇為提取試劑，向桑葉中加入100mL，在800W功率、40℃條件下超聲提取30min，提取2次，合并濾液，旋蒸濃縮至5mL左右，利用高效液相色譜法測(cè)定提取液中生物堿含量。關(guān)于提取時(shí)間的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以上述最佳比例為提取試劑，分別設(shè)置提取時(shí)間為10、20、30、40min，其余條件同上。關(guān)于提取溫度的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以最佳比例和時(shí)間為提取條件，分別設(shè)置提取溫度為30、40、50、60℃，其余條件同上。關(guān)于提取次數(shù)的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以最佳比例、提取時(shí)間和溫度為條件，分別設(shè)置提取次數(shù)為1、2、3、4次，其余條件同上。

1.3.3 桑葉生物堿的制備 在確定了桑葉生物堿的最佳提取試劑、提取時(shí)間、提取溫度和提取次數(shù)后，稱取適量的桑葉粉末于該條件下進(jìn)行超聲提取，制備生物堿提取液，濃縮后凍干成粉末，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.3.4 生物堿的降糖降脂作用實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物飼養(yǎng)：對(duì)購(gòu)買的40只小鼠用基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)平均分成4組，分別為正常對(duì)照組，生物堿低、中、高劑量組。分別按照50、100、200mg/kg·BW的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃操作，同時(shí)正常對(duì)照組小鼠灌胃等體積的生理鹽水。灌胃持續(xù)4周，灌胃期間飼喂高脂飼料。實(shí)驗(yàn)期間，小鼠每周稱重2次并記錄，小鼠飼養(yǎng)環(huán)境條件符合相關(guān)規(guī)定。

血樣采集：灌胃結(jié)束后，對(duì)小鼠采取禁食不禁水措施，然后進(jìn)行眼眶取血，所得血液放于含有肝素鈉的離心管中，并做低溫離心操作，4 000 r/min離心15 min，收集上層血清用于測(cè)定TC、TG和血糖含量。利用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行測(cè)定，相關(guān)操作按照試劑盒中附帶的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測(cè)定結(jié)果用±s表示。采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，P<0.05認(rèn)為差異有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的乙醇對(duì)提取桑葉生物堿效果的影響

由圖1可知，利用醇提法提取桑葉中的生物堿時(shí)，乙醇的濃度對(duì)生物堿的得率有較大的影響（P<0.05）。隨著乙醇濃度的增加，生物堿的提取率呈現(xiàn)上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)用70%的乙醇作為提取溶劑時(shí)，生物堿的得率最高，此時(shí)為85%。因此，可以確定用醇提法提取生物堿時(shí)的最佳提取試劑是70%乙醇。

2.2 提取時(shí)間對(duì)桑葉生物堿提取效果的影響

由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，生物堿的提取率呈增加趨勢(shì)，但是增加趨勢(shì)逐漸變緩，幅度減小。提取時(shí)間為10～20min之間時(shí)，提取率增加明顯，之后增加比較平緩。考慮到實(shí)驗(yàn)的效率性，將最佳提取時(shí)間定為20min。

2.3 提取溫度對(duì)桑葉生物堿提取效果的影響

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，提取率會(huì)上升，但之后會(huì)下降。可能是因?yàn)楫?dāng)溫度較高時(shí)，生物堿中的某些成分穩(wěn)定性下降，從而使得提取率下降。

2.4 提取次數(shù)對(duì)桑葉生物堿提取效果的影響

由圖4可知，隨著提取次數(shù)的增加，生物堿的提取率會(huì)逐漸增加。但是當(dāng)次數(shù)為3次或4次時(shí)，提取率增加幅度并不明顯，基本上提取2次后，便可將桑葉中的生物堿提取完全。因此，生物堿的最佳提取次數(shù)為2次。

2.5 桑葉生物堿降血脂效果

目前，高血脂是嚴(yán)重危害人類健康的一個(gè)因素，高血脂癥已成為一個(gè)普遍現(xiàn)象。血液中的TG和膽固醇含量需要維持在一個(gè)正常水平，才不會(huì)對(duì)機(jī)體健康造成威脅[13-15]。但是當(dāng)脂肪攝入過(guò)多時(shí)，機(jī)體消耗的脂肪低于攝入的脂肪，就會(huì)造成脂肪蓄積，最直接的結(jié)果就是血脂升高，對(duì)脂代謝造成負(fù)擔(dān)[16-18]。由表1可知，與正常對(duì)照組相比，桑葉生物堿處理有助于降低血脂水平。對(duì)于TC來(lái)說(shuō)，高劑量生物堿可以使其含量顯著下降19.40%（P<0.05），中、低劑量可分別使TC下降8.96%、2.99%，不具有顯著性（P>0.05）;對(duì)于TG來(lái)說(shuō)，高、中劑量生物堿可以使其含量分別顯著下降17.32%、13.41%（P<0.05），低劑量可下降4.47%，不具有顯著性（P>0.05）?？梢?jiàn)，桑葉生物堿具有預(yù)防高脂血癥的作用，適量生物堿可以降低血液中TG和膽固醇的含量。

2.6 桑葉生物堿降血糖效果

空腹血糖指隔夜空腹、采食早餐前測(cè)定的血糖值，能夠反映基礎(chǔ)胰島素的分泌功能，在糖尿病的監(jiān)測(cè)中是一個(gè)重要指標(biāo)[19-21]。正常的血糖值是一個(gè)范圍，當(dāng)超過(guò)上限的某一程度時(shí)就會(huì)被判定為糖尿病，控制血糖水平在正常水平是保證機(jī)體健康的重要舉措之一[22-23]。由表2可知，與正常對(duì)照組相比，桑葉生物堿處理能夠在一定程度上降低血糖水平。高劑量生物堿可以使空腹血糖含量顯著下降9.19%（P<0.05），中、低劑量可分別使血糖下降5.07%、0.94%，不具有顯著性（P>0.05）?？梢?jiàn)，桑葉生物堿具有預(yù)防血糖升高的作用，適量生物堿可以降低血糖水平，減少機(jī)體的糖代謝負(fù)擔(dān)。

3 討論

目前關(guān)于桑葉生物堿的降糖降脂研究較少，本研究對(duì)其在降糖降脂方面的作用做了一個(gè)初步探究，并對(duì)它的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，當(dāng)使用超聲輔助提取法時(shí)，用70%乙醇在50℃條件下提取桑葉中生物堿20min，并提取2次時(shí)，可使生物堿得率最高。關(guān)于桑葉生物堿的降糖降脂作用研究顯示，一定量的桑葉生物堿可以降低血液中TG和膽固醇含量，說(shuō)明它具有較好的預(yù)防高血脂作用，這和仝義超[12]的研究結(jié)果一致。同時(shí)還能夠降低空腹血糖值，還能夠預(yù)防血糖升高，楊旭等[4]的研究結(jié)果同樣顯示桑葉生物堿對(duì)緩解糖尿病有效果。

綜上所述，桑葉生物堿的最佳提取工藝為70%乙醇、50℃條件下提取20min，提取2次。桑葉生物堿具有一定的預(yù)防高血脂和高血糖的作用，這有助于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)桑葉的保健和藥用價(jià)值，提升桑葉的經(jīng)濟(jì)效益。本研究只是初步探索了桑葉生物堿的降糖降脂作用，但對(duì)于作用機(jī)制目前還不明晰，后續(xù)需要更深入的研究。

參考文獻(xiàn)

[1]王嬰，王巖，吳新榮，等.桑葉生物堿提取工藝研究進(jìn)展[J].廣東化工，2014，41（19）：94-94.

[2]桑葉生物堿的檢測(cè)提取及含量分析[D].重慶：西南大學(xué)，2016.

[3]賀勝，周杏子，何海，等.響應(yīng)面法優(yōu)化桑葉總生物堿超聲提取工藝[J].中國(guó)藥房，2015（25）：3537-3540.

[4]楊旭.桑葉中總生物堿提取工藝優(yōu)化及降血糖活性研究[D].南京：南京理工大學(xué)，2012.

[5]李平平.桑葉生物堿的變化規(guī)律及其降血糖作用研究[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[6]劉一衡，楊玲.正交設(shè)計(jì)優(yōu)化新疆藥桑桑葉總生物堿超聲提取工藝[J].食品工業(yè)科技，2013，34（24）：306-308.

[7]蔣小飛，趙忠啟，張憲黨.桑葉中生物堿脫氧野尻霉素（DNJ）的最佳提取工藝探討[J].西昌學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，24（4）：50-52.

[8]李凡，裘雅漁，錢文春，等.桑葉中總生物堿和1-脫氧野尻霉素的含量考察[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2008，43（3）：176-179.

[9]蒲俊松.桑葉生物堿的檢測(cè)提取及含量分析[D].重慶：西南大學(xué)，2016.

[10]劉凡，李平平，廖森泰，等.98份不同桑樹(shù)品種資源的桑葉總生物堿及1-脫氧野尻霉素含量測(cè)定[J].蠶業(yè)科學(xué)，2012，38（2）：185-191.

[11]劉韋鋆，趙駿，曾森，等.桑葉總生物堿中1-脫氧野尻霉素的測(cè)定及方法學(xué)考察[J].天津中醫(yī)藥，2010，27（2）：166-168.

[12]仝義超.桑葉降血糖降血脂研究及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)[D].杭州：浙江工商大學(xué)，2010.

[13]李君.桑葉降血糖有效部位提取工藝優(yōu)化及桑葉原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[D].南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[14]馮亮.布渣葉總生物堿降血脂作用機(jī)制研究[J].遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，36（5）：15-18.

[15]石琳，劉楠，楊平.荷葉中生物堿對(duì)昆明小鼠減肥降脂作用的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊），2013（9）：9-10.

[16]侯宏，孫勝亮，黃靜，等.黃連生物堿抗高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22（10）：2462-2464.

[17]吳洪麗，郝瑜，周洪英，等.桑樹(shù)生物堿研究進(jìn)展[J].北方蠶業(yè)，2016，37（4）：1-5.

[18]劉凡，廖森泰，李平平，等.桑葉總生物堿降血糖活性研究[C].廣東省食品學(xué)會(huì)第六次會(huì)員大會(huì)暨學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集，2012.

[19]陳新，黃靜，李盼盼，等.黃連生物堿對(duì)糖尿病小鼠降糖和氧化應(yīng)激作用研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2012，8（4）：24-25.

[20]楊旭.桑葉中總生物堿提取工藝優(yōu)化及降血糖活性研究[D].南京：南京理工大學(xué)，2012.

[21]趙駿，高嵐，齊召朋.荷葉總生物堿及其鹽的提取和降脂作用的比較[J].天津中醫(yī)藥，2005，22（2）：161-162.

[22]胡瑞君，車振明，徐丹，等.微波輔助提取桑葉生物堿DNJ的工藝研究[J].食品科技，2007，32（8）：139-141.

[23]徐冰，劉泉，劉率男.桑葉總生物堿的抗糖尿病活性研究[J].中藥材，2015，38（5）：1024-1026.

Abstract：Objective To optimize the extraction process of mulberry leaf alkaloids by ultrasound-assisted extraction，and to explore the role of mulberry leaf alkaloids in lowering blood lipid and blood sugar.Method Single factor experiments were used to optimize the proportion of extraction reagents，extraction time，extraction temperature and extraction times，and then the best combination was used to obtain the alkaloid extract of mulberry leaves.After 4 weeks of intragastric administration，the blood of mice was collected and the blood lipid and blood sugar content of mice were determined by kits.Result The results of single factor experiment showed that the optimum ratio of extraction reagents，extraction time，extraction temperature and extraction times were 70% ethanol，20 min，50℃ and 2 times，respectively.The results of blood glucose and lipid test showed that compared with the normal control group，the TC and TG contents in blood of mice were significantly decreased by 19.40% and 17.32% after 4 weeks of administration of high-dose mulberry leaf alkaloids （P<0.05），and the fasting blood glucose level was significantly decreased by 9.19% （P<0.05）.Conclusion When the alkaloids in mulberry leaves were extracted with 70% ethanol for 20 min at 50℃ twice，the yield of alkaloids was the highest.Mulberry leaf alkaloids have better preventive effects on hyperlipidemia and hyperglycemia.

Keywords：mulberry leaf;alkaloids;extraction technology;hypoglycemia;hypolipidemia

（責(zé)任編輯 唐建敏）