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    樺褐孔菌誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞周期阻滯和凋亡的研究

    2019-09-10 05:36:18陳晨李巖卓勤霍軍生萬麗葵
    中國食物與營養(yǎng) 2019年9期
    關(guān)鍵詞:凋亡細(xì)胞周期

    陳晨 李巖 卓勤 霍軍生 萬麗葵

    摘 要:目的:研究樺褐孔菌誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞周期阻滯和凋亡的作用,為樺褐孔菌在抗腫瘤方面的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。方法:將不同濃度的樺褐孔菌與人肺癌A549細(xì)胞共同培養(yǎng)后,采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率,使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果:樺褐孔菌能夠抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng),并誘導(dǎo)其凋亡。濃度為2、4mg/mL的樺褐孔菌液作用于A549細(xì)胞48h后,與對(duì)照組相比,細(xì)胞存活率分別顯著下降至83.32%和69.27%(P<0.05,對(duì)照組為92.11%),早期凋亡率分別顯著增至6.47%和8.07%(P<0.01,對(duì)照組為1.98%),總凋亡率顯著增至14.27%和27.54%(P<0.05,對(duì)照組為5.91%),晚期凋亡率增至7.8%(P>0.05)和19.48%(P<0.01,對(duì)照組為3.94%)。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,4mg/mL樺褐孔菌與A549細(xì)胞孵育24h后,G2/M期細(xì)胞顯著增加至22.12%(P<0.01,對(duì)照組為12.5%);孵育48h后,G0/G1期顯著增加至68.87%(P<0.01,對(duì)照組為59.87%)。結(jié)論:樺褐孔菌能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡,使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期以及G2/M期。

    關(guān)鍵詞: 樺褐孔菌;A549細(xì)胞;凋亡;細(xì)胞周期

    樺褐孔菌是藥用真菌,俗稱白樺茸。國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn),樺褐孔菌具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗氧化、降血壓等多種生物活性[1-7],但是具體的作用機(jī)制并不清楚。本研究以人肺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象,探索樺褐孔菌對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的細(xì)胞周期與凋亡的影響,為進(jìn)一步探討作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料和儀器

    1.1.1 細(xì)胞 樺褐孔菌樣品來源地為俄羅斯,粉末狀。

    1.1.2 試劑 A549人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞,中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫;F-12K培養(yǎng)液,Invitrogen公司;胎牛血清,Gibco公司;AnnexinV/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,BD公司;碘化丙啶,PI,Biolegend公司;CCK-8試劑盒,日本同仁公司;0.25%胰酶,Gibco公司;青鏈霉素,Gibco公司。

    1.1.3 儀器 倒置顯微鏡,Nikon公司;酶標(biāo)儀,Molecular Devices公司;流式細(xì)胞儀,BD公司;低溫冷凍離心機(jī),貝克曼公司;CO2培養(yǎng)箱,Heal Force公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞培養(yǎng)在10%胎牛血清、100U/L青霉素、100μg/mL鏈霉素的F-12K完全培養(yǎng)液,于37℃恒溫、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3d消化傳代1次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 樺褐孔菌溶液的配制 用100℃熱水配制濃度為100mg/mL樺褐孔菌溶液,放置2h冷卻后,用F-12K完全培養(yǎng)液稀釋成濃度為80、40、20、10、5mg/mL的溶液。

    1.2.3 A549細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺癌A549細(xì)胞,用F-12K完全培養(yǎng)液將細(xì)胞調(diào)整為1×105/mL、5×104/mL、2.5×104/mL、1×104/mL濃度的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液加入96孔板中,每孔100μL,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(100μL F-12K完全培養(yǎng)液),于12、24、48、72h使用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性。

    1.2.4 CCK-8法檢測(cè)樺褐孔菌對(duì)人肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺癌A549細(xì)胞,用F-12K完全培養(yǎng)液將細(xì)胞調(diào)整為5×104/mL細(xì)胞懸液,加入96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔加入90μL,然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12h,待A549細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后,分別加入不同濃度樺褐孔菌溶液10μL,使受試物最終濃度為10、8、4、2、1、0.5mg/mL,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組(加入10μL F-12K完全培養(yǎng)液)和空白對(duì)照組(90μL F-12K完全培養(yǎng)液+10uL F-12K完全培養(yǎng)基),每組設(shè)6個(gè)平行孔,細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后,每孔加入10μL CCK-8試劑,放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1~4h,酶標(biāo)儀490nm測(cè)定各孔光密度值(OD)。按式(1)計(jì)算細(xì)胞抑制率,并計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

    細(xì)胞抑制率(%)=(陰性對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/(陰性對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%(1)

    1.2.5 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期及凋亡 用F-12K完全培養(yǎng)液將細(xì)胞調(diào)整為5×104/mL細(xì)胞懸液,取2mL接種于6孔板,實(shí)驗(yàn)分為4、2、1mg/mL劑量組和陰性對(duì)照組4個(gè)組,孵育過夜。樺褐孔菌用完全培養(yǎng)基稀釋成40、20、10mg/mL,吸去上層培養(yǎng)基,每孔加入1.8mL完全培養(yǎng)基,另加0.2mL相應(yīng)劑量的樺褐孔菌溶液,陰性對(duì)照組加入0.2mL F-12K完全培養(yǎng)基。

    (1)細(xì)胞周期檢測(cè):樺褐孔菌處理細(xì)胞24h和48h后,收集細(xì)胞,調(diào)整為106/mL,PBS洗2次,250r/min離心5min,盡可能去除上清,-20℃預(yù)冷的70%乙醇1mL固定細(xì)胞,逐滴加入,邊加邊振蕩,確保充分的固定又防止細(xì)胞成團(tuán),4℃固定30min以上。用PBS洗2次,2 000/min離心5min,小心地棄上清,防止細(xì)胞損失。加入50μL 100μg/mL的RNase,37℃孵育30min,加入200μL 50μg/mL碘化丙啶(PI),充分振蕩,孵育15min后,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(2)細(xì)胞凋亡檢測(cè):樺褐孔菌處理細(xì)胞48h后,收集上清液和底層全部細(xì)胞。加入5μL FITC Annexin V和5μL PI,輕微振蕩,室溫下孵育15min,加入400μL Binding Buffer,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)活細(xì)胞、壞死細(xì)胞、早期凋亡、晚期凋亡細(xì)胞百分比,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。3組以上數(shù)據(jù)的比較,若方差齊,則進(jìn)行方差分析,有顯著性差異時(shí),使用Dunnet t檢驗(yàn)進(jìn)行各劑量組與對(duì)照組的比較;若方差不齊,使用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行多組比較。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

    如圖1所示,5×104/mL濃度細(xì)胞接種于96孔板后孵育48h即達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

    2.2 樺褐孔菌對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的影響

    如圖2~3所示,樺褐孔菌孵育A549細(xì)胞48h,隨著樺褐孔菌濃度增加,450nm OD值下降,細(xì)胞抑制率升高,IC50為4.73mg/mL。

    2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

    如表2所示,2mg/mL和4mg/mL樺褐孔菌孵育A549細(xì)胞48h后,A549細(xì)胞的活細(xì)胞率顯著下降(P<0.05),早期凋亡率和總凋亡率顯著升高(P<0.01、P<0.05)。4mg/mL劑量組晚期凋亡和壞死細(xì)胞率顯著升高(P<0.01)。如圖4所示,隨著樺褐孔菌濃度升高,晚期凋亡和壞死細(xì)胞率亦升高。

    2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布

    如表3所示,樺褐孔菌孵育A549細(xì)胞處理24h后4mg/mL劑量組A549細(xì)胞G2/M期細(xì)胞顯著升高(P<0.01),12mg/mL劑量組A549細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞顯著升高(P<0.05、P<0.01),1、2、4mg/mL劑量組S期細(xì)胞顯著降低(P<0.05、P<0.01、P<0.01)。如表4所示,處理48h后各劑量組A549細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞顯著升高(P<0.01),S期細(xì)胞顯著降低(P<0.05),4mg/mL劑量組G2/M期細(xì)胞顯著升高(P<0.05)。

    3 討論

    研究表明,樺褐孔菌對(duì)乳腺癌、胃癌、皮膚癌、肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞有抑制作用,其抗腫瘤機(jī)制主要可能是通過影響腫瘤細(xì)胞周期、抑制其增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等途徑發(fā)揮作用[8-11]。目前肺癌缺乏有效的治療手段,在中藥中找到能夠抑制腫瘤的高效低毒性的藥物成為研究的熱點(diǎn)之一。CCK-8法是一種操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、步驟少、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好的細(xì)胞活性檢測(cè)方法,對(duì)實(shí)驗(yàn)者和環(huán)境危害低[12-13]。本研究使用人肺癌A549細(xì)胞,運(yùn)用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期,評(píng)價(jià)樺褐孔菌誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞凋亡和周期阻滯的作用。本研究發(fā)現(xiàn),樺褐孔菌可降低A549細(xì)胞活力,進(jìn)而由流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。肺腺癌主要與腫瘤細(xì)胞周期紊亂進(jìn)而引起細(xì)胞過度生長(zhǎng)、增殖有關(guān)。細(xì)胞周期依賴性激酶(CDK)和細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)展,在細(xì)胞有絲分裂周期不同時(shí)段起重要作用,可引起細(xì)胞周期失衡,導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)、分化障礙,后導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖,腫瘤隨之發(fā)生[14]。Youn等[15]研究發(fā)現(xiàn),樺褐孔菌提取物使肝癌HepG2細(xì)胞阻滯于G0 /G1期,并通過抑制CDK6、CDK4、CDK2、CyclinE、CyclinD1、CyclinD2抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。王文娟[16]等研究發(fā)現(xiàn),樺褐孔菌提取物能夠顯著抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖,樺褐孔菌提取物使腫瘤細(xì)胞阻滯在G2期,使細(xì)胞增殖受到抑制。本研究發(fā)現(xiàn),4mg/mL樺褐孔菌與A549細(xì)胞孵育24h后,G2/M期細(xì)胞顯著增加至22.12%(P<0.01,對(duì)照組為12.5%);孵育48h后,G0/G1期顯著增加至68.87%(P<0.01,對(duì)照組為59.87%),使細(xì)胞周期阻滯于G2/M和G0/G1期。

    本研究發(fā)現(xiàn),樺褐孔菌對(duì)人肺癌細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡和周期阻滯作用,使A549細(xì)胞產(chǎn)生G2/M期和G0/G1期阻滯,為樺褐孔菌成為抗肺癌的物質(zhì)提供了科學(xué)依據(jù),為下一步作用機(jī)制研究打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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    Abstract:Objective To study apoptosis and cycle arrest of lung cancer cells induced by Inonotus obliquus,and provide new evidence for anti-tumor therapy of Inonotus obliquus.MethodHuman lung cancer cell line A549 was incubated with different concentrations of Inonotus obliquus.Cell viability was measured by CCK-8 method.Apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometry.Result Inonotus obliquus inhibitted the growth and induced apoptosis of A549 cells.The results of the Inonotus obliquus groups on the concentrations of 2 mg/mL and 4 mg/mL were compared with control group.Viable cell percentages were significantly decreased to 83.32% and 69.27%,respectively (P<0.05,92.11% in the control group),the early apoptotic rate significantly increased to 6.47% and 8.07% (P<0.01,1.98% in control group),the total apoptotic rate significantly increased to 14.27% and 27.54% (P<0.05,5.91% in control group),the late apoptosis rate significantly increased to 7.8% (P>0.05)and 19.48% (P<0.01,3.94% in control group).Compared with the control group,the cells in G2/M phase increased significantly to 22.12% after incubating A549 cells with 4mg/mL Inonotus obliquus for 24h (P<0.01,12.5% ?in control group),the cells in G0/G1 phase increased significantly to 68.87% after incubating A549 cells for 48h (P<0.01,59.87% in control group).Conclusion Inonotus obliquus can induce the apoptosis of A549 cells,and arrest cells in G0/G1 phase and G2/M phase.

    Keywords:Inonotus obliquus;A549 cells;apoptosis;cell cycle

    (責(zé)任編輯 唐建敏)

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