除草活性成團(tuán)泛菌ZLSY20菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

吳志美 蘭明先 高熹 李夢(mèng)月 袁遠(yuǎn) 郭子俊 殷興華 吳國(guó)星

摘要：【目的】明確除草活性成團(tuán)泛菌ZLSY20菌株的最佳發(fā)酵條件，為應(yīng)用成團(tuán)泛菌對(duì)紫莖澤蘭進(jìn)行生物防治打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎脝我蛩卦囼?yàn)，對(duì)一株來自澤蘭實(shí)蠅幼蟲消化道的成團(tuán)泛菌ZLSY20菌株進(jìn)行基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基[YSP培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）、LB培養(yǎng)基、細(xì)菌基本培養(yǎng)基（CM）、NYBD培養(yǎng)基和紫莖澤蘭瓊脂培養(yǎng)基（EAS）]和發(fā)酵條件（溫度16～40 ℃、初始pH 4～9、接菌量0.05%～2.50%、通氣量20～160 mL/250 mL、發(fā)酵時(shí)間0～72 h、轉(zhuǎn)速140～240 r/min）篩選， 并用正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。【結(jié)果】ZLSY20菌株在YSP培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，細(xì)菌濃度最大;在葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉和甘露醇6種不同碳源中，蔗糖最有利于ZLSY20菌株生長(zhǎng);在甘氨酸、蛋白胨、硝酸銨、胰蛋白胨和谷氨酸作氮源時(shí)，蛋白胨最有利于ZLSY20菌株生長(zhǎng)，其次為胰蛋白胨;YSP培養(yǎng)基中蛋白胨1.5%、酵母膏2.0%和蔗糖2.0%時(shí)ZLSY20菌株生長(zhǎng)最快。在不同的發(fā)酵條件下，以發(fā)酵時(shí)間24 h、培養(yǎng)溫度32 ℃、pH 8、接菌量0.05%、通氣量20 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速200 r/min的菌株生長(zhǎng)最好。【結(jié)論】?jī)?yōu)化方案下可有效提高ZLSY20菌株的發(fā)酵產(chǎn)量，建立的方案可用于快速、大批量地發(fā)酵ZLSY20菌懸液。

關(guān)鍵詞： 紫莖澤蘭;成團(tuán)泛菌;ZLSY20菌株;發(fā)酵條件

中圖分類號(hào)： S476.11? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）09-1990-08

Abstract：【Objective】The optimum fermentation conditions of Pantoea agglomerans ZLSY20 strain were clarified， which laid a foundation for the biological control of the Eupatorium adenophorum Spreng by using P. agglomerans. 【Me-thod】A single factor experiment was used to optimize the fermentation conditions of a P. agglomerans strain ZLSY20 from the digestive tract of the Procecidochares utilis larvae. The experiments included different media[YSP media， nu-trient agar media（NA）， LB media， bacterial basal media（CM）， NYBD media and Ageratina adenophoraagar media（EAS）]， fermentation conditions（temperature16-40 ℃， initial pH 4-9， inoculation quantity 0.05%-2.50%， ventilation volume 20-160 mL/250 mL， fermentation time 0-72 h， rotational speed 140-240 r/min）. Orthogonal test was used to optimize the media components and culture conditions. 【Result】Strain ZLSY20 grew the fastest on YSP media with the lar-gest bacteria concentration. Among the six carbon sources（glucose， sucrose， maltose， lactose， starch and mannitol）， sucrose was the most favorable to the growth of ZLSY20. When glycine， peptone， ammonium nitrate， tryptone and glutamic acid were used as nitrogen sources， peptone was the best for the growth of strain ZLSY20， followed by tryptone. In YSP media， when peptone was 1.5%， yeast cream 2.0% and sucrose 2.0%， the growth of ZLSY20 strain was the fastest. Under different fermentation conditions， when fermentation time was 24 h， temperature was 32 ℃， pH=8， inoculation amount was 0.05%， ventilation volume was 20-160 mL/250 mL， rotational speed was 200 r/min， the strain ZLSY20 grew the best. 【Conclusion】The optimized fermentation conditions can effectively increase the fermentation yield of ZLSY20 strain， which can be applied in rapid and large-scale fermentation of ZLSY20 bacterial suspension.

Key words： Eupatorium adenophorum Spreng; Pantoea agglomerans; ZLSY20 strain; fermentation conditions

0 引言

【研究意義】紫莖澤蘭（Eupatorium adenophorum Spreng）隸屬于菊科澤蘭屬，是一種入侵性極強(qiáng)的多年生惡性雜草。紫莖澤蘭于20世紀(jì)40年代經(jīng)中緬邊境傳入我國(guó)，因其生命力強(qiáng)、繁殖快而迅速蔓延至四川、貴州和西藏等地。紫莖澤蘭可破壞生態(tài)系統(tǒng)，影響土壤理化性質(zhì)，嚴(yán)重阻礙入侵地農(nóng)林牧業(yè)的發(fā)展，是我國(guó)外來入侵物種中危害最嚴(yán)重的植物之一（楊國(guó)慶等，2008;王翀等，2014;蘭明先等，2017）。澤蘭實(shí)蠅是紫莖澤蘭的重要專食性天敵，可有效控制紫莖澤蘭的蔓延（魯武峰等，2018）。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，從澤蘭實(shí)蠅幼蟲腸道分離獲得的成團(tuán)泛菌ZLSY20菌株具有一定的除草活性，對(duì)紫莖澤蘭葉片具有侵害作用（蘭明先等，2018），因此，明確除草活性成團(tuán)泛菌ZLSY20菌株的最佳發(fā)酵條件，可為成團(tuán)泛菌應(yīng)用于紫莖澤蘭的生物防治提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，人們對(duì)控制入侵植物紫莖澤蘭的危害有防治和利用兩種思路，一方面是試圖將紫莖澤蘭變廢為寶以減少侵害，但尚未成熟;另一方面，對(duì)防除紫莖澤蘭進(jìn)行大量研究，包括機(jī)械防除、化學(xué)防除、生物防治和替代控制等（歐國(guó)騰等，2012;李霞霞等，2017;朱文達(dá)等，2018），但對(duì)紫莖澤蘭發(fā)生嚴(yán)重的區(qū)域，如單純采用機(jī)械或化學(xué)方法防治效果并不理想，且成本高、污染重（朱文達(dá)等，2013;王亞麒等，2016）。利用澤蘭實(shí)蠅控制紫莖澤蘭是生物防治的一項(xiàng)重要措施。張某等（2016）采用16S rDNA基因文庫(kù)技術(shù)和Illumina Hi Seq測(cè)序技術(shù)檢測(cè)自然種群澤蘭實(shí)蠅幼蟲腸道內(nèi)的細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌多樣性豐富，但未作進(jìn)一步的活性研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組前期研究從澤蘭實(shí)蠅幼蟲中分離純化得到22株共生菌，且發(fā)現(xiàn)有6株菌（分別屬于芽孢桿菌屬和泛菌屬等）對(duì)紫莖澤蘭葉片有侵害作用（蘭明先等，2018），目前僅初步進(jìn)行了澤蘭實(shí)蠅幼蟲共生細(xì)菌的活性探究，尚缺乏詳細(xì)的發(fā)酵條件研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)1株來自澤蘭實(shí)蠅幼蟲消化道的成團(tuán)泛菌ZLSY20菌株的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件（溫度、初始pH、接種量、通氣量、發(fā)酵時(shí)間、轉(zhuǎn)速）進(jìn)行優(yōu)化，明確其最佳發(fā)酵條件，為利用細(xì)菌防治紫莖澤蘭打下一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試菌種 成團(tuán)泛菌屬（Pantoea agglome-rans）ZLSY20菌株為本課題組前期分離所得，系澤蘭實(shí)蠅幼蟲內(nèi)生細(xì)菌，保存于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1. 1. 2 供試培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏0.60 g，蛋白胨2.00 g，NaCl 1.00 g，瓊脂18.00 g，水200 mL;121 ℃滅菌20 min。LB培養(yǎng)基：蛋白胨2.00 g，酵母提取物1.00 g，氯化鈉2.00 g，瓊脂3.00 g，蒸餾水200 mL;121 ℃滅菌20 min。細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CM）：葡萄糖1.00 g，（NH4）2SO4 0.40 g，檸檬酸鈉0.20 g，MgSO4·7H2O 0.04 g，K2HPO4 0.80 g，KH2PO4 1.20 g，瓊脂3.00 g，蒸餾水200 mL;121 ℃滅菌20 min。NYBD培養(yǎng)基：牛肉浸膏1.60 g，酵母浸粉1.00 g，葡萄糖2.00 g，蒸餾水200 mL;121 ℃滅菌20 min。YSP培養(yǎng)基：蛋白胨2.00 g，酵母膏1.00 g，蔗糖4.00 g，蒸餾水200 mL;121 ℃滅菌20 min。紫莖澤蘭瓊脂培養(yǎng)基（EAS）：選取幼嫩的紫莖澤蘭莖、葉、花等50 g，洗凈，加水200 mL，在勻漿機(jī)中搗碎10 min，煮沸30 min，用4層紗布過濾，將濾液定容至200 mL，加入瓊脂3.00～4.00 g;121 ℃滅菌20 min。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響 分別向含有100 mL YSP、NA、NYBD、CM、EAS和LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中加入50 μL ZLSY20菌懸液，于220 r/min的搖床中25 ℃下分別振蕩培養(yǎng)24、48和72 h，采用分光光度法測(cè)定菌液在600 nm波長(zhǎng)處的OD，以確定菌液濃度（高偉等，2009）。

1. 2. 2 培養(yǎng)基組分優(yōu)化

1. 2. 2. 1 不同碳源對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響 以1.2.1中篩選出的適宜ZLSY20菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉和甘露醇作碳源，配制不同發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行ZLSY20菌株發(fā)酵培養(yǎng)，24 h后分別測(cè)定不同碳源培養(yǎng)基下菌液在600 nm波長(zhǎng)處的OD，比較不同碳源對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響，確定最佳碳源（高偉等，2009）。

1. 2. 2. 2 不同氮源對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響 以1.2.1中篩選出的適宜ZLSY20菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入甘氨酸、蛋白胨、硝酸銨、胰蛋白胨和谷氨酸作氮源，配制不同發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行ZLSY20菌株發(fā)酵培養(yǎng)，24 h后分別測(cè)定不同氮源培養(yǎng)基下菌液在600 nm波長(zhǎng)處的OD，比較不同氮源對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響（高偉等，2009），確定最佳氮源。

1. 2. 2. 3 碳、氮源最佳濃度單因素試驗(yàn) 分別將1.2.2.1和1.2.2.2篩選出的最佳碳、氮源設(shè)置不同濃度（碳源質(zhì)量濃度分別為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%），氮源質(zhì)量濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%），配制成不同濃度的發(fā)酵液進(jìn)行ZLSY20菌株發(fā)酵培養(yǎng)。試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定發(fā)酵液在600 nm波長(zhǎng)處的OD（陳哲等，2016）。

1. 2. 2. 4 培養(yǎng)基濃度正交試驗(yàn) 采用L9（33）對(duì)碳、氮源濃度的組合進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定發(fā)酵液的OD（陳哲等，2016）。

1. 2. 3 發(fā)酵條件優(yōu)化

1. 2. 3. 1 溫度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響 在優(yōu)化培養(yǎng)基組分的基礎(chǔ)上，將ZLSY20菌株接種于最佳培養(yǎng)基中，在不同的溫度條件下（16、20、24、28、32、36和40 ℃）置于轉(zhuǎn)速為220 r/min的搖床中培養(yǎng)，24 h后測(cè)定各溫度下菌液在600 nm波長(zhǎng)處的OD，從而判斷溫度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響（張根偉，2005）。

1. 2. 3. 2 初始pH對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響 制備優(yōu)化的培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)初始pH分別為 4、5、6、7、8和9，將ZLSY20菌株接種于不同pH的培養(yǎng)基中，置于轉(zhuǎn)速為220 r/min的搖床中培養(yǎng)，24 h后測(cè)定不同pH條件下菌液在600 nm波長(zhǎng)處的OD，以此判斷pH對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響（張根偉，2005）。

1. 2. 3. 3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響 制備優(yōu)化的培養(yǎng)基，采用上述優(yōu)化的溫度和pH，分別發(fā)酵0、12、24、36、48、60和72 h，測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)ZLSY20菌株生長(zhǎng)速度的影響（高偉等，2009）。

1. 2. 3. 4 時(shí)間、溫度和pH正交試驗(yàn) 按優(yōu)化的培養(yǎng)基組分配制培養(yǎng)液，分別選擇3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，篩選ZLSY20菌株的最佳發(fā)酵時(shí)間、溫度和pH（陳哲等，2016）。

1. 2. 3. 5 初始接菌量對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響 將經(jīng)搖床培養(yǎng)24 h的ZLSY20菌懸液按100 mL裝液量的0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、2.00%和2.50%分別接入優(yōu)化培養(yǎng)基中，測(cè)定在不同接菌量條件下菌液在600 nm波長(zhǎng)處的OD，測(cè)定不同初始接菌量對(duì)ZLSY20菌株生長(zhǎng)速度的影響（張根偉，2005）。

1. 2. 3. 6 通氣量對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響 在250 mL三角瓶中分別放入優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基20、40、80、120和160 mL，在220 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h后測(cè)定不同通氣量下菌液在600 nm波長(zhǎng)處的OD（張根偉，2005）。

1. 2. 3. 7 轉(zhuǎn)速對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響 將ZLSY20菌株接種到優(yōu)化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件采用1.2.3.4中的優(yōu)化條件，設(shè)搖床轉(zhuǎn)速分別為140、160、180、200、220和240 r/min，測(cè)定不同轉(zhuǎn)速下菌液在600 nm波長(zhǎng)處的OD（張根偉，2005）。

1. 2. 3. 8 接菌量、通氣量、轉(zhuǎn)速正交試驗(yàn) 按優(yōu)化的培養(yǎng)基組分配制培養(yǎng)液，分別選擇3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，篩選ZLSY20菌株的最佳接菌量、通氣量和轉(zhuǎn)速（陳哲等，2016）。

1. 3 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

按最優(yōu)方案配制發(fā)酵液，并在最適發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在0～24 h內(nèi)每隔2 h測(cè)一次OD，24 h后每隔12 h測(cè)一次OD，并制作生長(zhǎng)曲線圖。

1. 4 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS 18.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響

由圖1可看出，ZLSY20菌株在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度存在差異，其中在YSP培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，細(xì)菌濃度最大，OD為2.35，其次為NA和LB培養(yǎng)基;ZLSY20菌株在EAS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢，且顯著慢于除CM外的其他培養(yǎng)基處理（P<0.05，下同），表明該菌不適宜在EAS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

2. 2 培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2. 2. 1 碳源對(duì)ZLSY20菌株生長(zhǎng)速度的影響 由圖2可知，ZLSY20菌株在以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉和甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上其生長(zhǎng)速度存在一定差異，但總體上差異不明顯，其中以蔗糖為碳源時(shí)細(xì)菌的濃度最大，OD為1.82。

2. 2. 2 氮源對(duì)ZLSY20菌株生長(zhǎng)速度的影響 由圖3可知，ZLSY20菌株在以甘氨酸、谷氨酸、硝酸銨、蛋白胨、胰蛋白胨和酵母膏為氮源的培養(yǎng)基上其生長(zhǎng)速度存在明顯差異，其中在蛋白胨和胰蛋白胨上的生長(zhǎng)速度較快，細(xì)菌濃度較大，OD分別為2.29和2.28，均顯著高于其他氮源處理。

2. 2. 3 碳源和氮源濃度單因素試驗(yàn)結(jié)果 由圖4～圖6可知，蔗糖采用2.0%、3.0%和4.0% 3個(gè)水平，酵母膏采用1.0%、1.5%和2.0% 3個(gè)水平，蛋白胨采用0.5%、1.0%和1.5% 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)較合理。

2. 2. 4 碳、氮源濃度正交試驗(yàn)結(jié)果 碳、氮源濃度正交試驗(yàn)結(jié)果（表1）顯示，RA>RB>RC，即氮源蛋白胨（A）對(duì)細(xì)菌總數(shù)的影響最大，其次為酵母膏（B）和蔗糖（C），表明蛋白胨（A）含量變化對(duì)ZLSY20菌株生長(zhǎng)速度的影響最大，而蔗糖（C）含量變化對(duì)ZLSY20菌株生長(zhǎng)的影響相對(duì)較小，對(duì)應(yīng)的最佳組合為A3B3C1，即蛋白胨1.5%、酵母膏2.0%和蔗糖2.0%。方差分析結(jié)果（表2）顯示，3種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)ZLSY20菌株生長(zhǎng)的影響無顯著差異（P>0.05，下同）。

2. 3 ZLSY20菌株發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2. 3. 1 培養(yǎng)基初始pH 由圖7可知，最適ZLSY20菌株生長(zhǎng)的pH在6～8，其中pH 6時(shí)生長(zhǎng)較快，而pH 4和pH 5時(shí)基本不生長(zhǎng)，因此選擇pH 6、7和8進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2. 3. 2 培養(yǎng)溫度 由圖8可知，在24～32 ℃溫度范圍內(nèi)ZLSY2菌株生長(zhǎng)較好，20 ℃及以下不適合該細(xì)菌生長(zhǎng)，因此選擇24、28 和32 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2. 3. 3 培養(yǎng)時(shí)間 由圖9可知，ZLSY20菌液濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，但培養(yǎng)48 h后趨于穩(wěn)定，為提高細(xì)菌產(chǎn)量并在發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)能接入活性好、功效強(qiáng)的菌株，選擇12、24和48 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2. 3. 4 培養(yǎng)時(shí)間、溫度和初始pH正交試驗(yàn) 培養(yǎng)時(shí)間、溫度和初始pH的正交試驗(yàn)結(jié)果（表3）顯示，RC>RB>RA，即初始pH（C）對(duì)ZLSY20菌株產(chǎn)量的影響最大，其次為培養(yǎng)溫度（B）和培養(yǎng)時(shí)間（A），對(duì)應(yīng)的最佳組合為A2B3C3，即最佳培養(yǎng)時(shí)間24 h、最佳培養(yǎng)溫度32 ℃、最適pH 8。方差分析結(jié)果（表4）顯示，3種發(fā)酵條件對(duì)ZLSY20菌株生長(zhǎng)的影響無顯著差異。

2. 3. 5 初始接菌量、通氣量和轉(zhuǎn)速優(yōu)化 由圖10～圖12可看出，接菌量選擇0.05%、0.10%和0.50% 3個(gè)水平，通氣量選擇20、40和80 mL 3個(gè)水平，轉(zhuǎn)速選擇160、180和200 r/min 3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)較適宜。

2. 3. 6 初始接菌量、通氣量和轉(zhuǎn)速正交試驗(yàn) 初始接菌量、通氣量和轉(zhuǎn)速的正交試驗(yàn)結(jié)果（表5）顯示，RB>RC>RA，即通氣量（B）對(duì)ZLSY20菌株生長(zhǎng)的影響最大，其次是轉(zhuǎn)速（C）和接菌量（A），對(duì)應(yīng)的最佳組合是A1B1C3，即接菌量0.05%、通氣量20 mL、轉(zhuǎn)速200 r/min。方差分析結(jié)果（表6）顯示，通氣量對(duì)ZLSY20菌株的生長(zhǎng)速度影響顯著。

2. 4 ZLSY20菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

按最優(yōu)方案配制發(fā)酵液，并在最適發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果（圖13）顯示，菌株接種后0～2 h為生長(zhǎng)延遲期，2～24 h其生長(zhǎng)曲線接近直線，細(xì)菌生長(zhǎng)速度最快，為生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，在24～48 h內(nèi)細(xì)菌緩慢增長(zhǎng)，隨后進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，最高產(chǎn)菌量為48 h時(shí)，OD為2.14;84 h后ZLSY20菌株的OD開始緩慢下降。

3 討論

目前，大部分細(xì)菌采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，因?yàn)樵贚B培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌類群相對(duì)單一，存在單一類群優(yōu)勢(shì)或抑制其他類群生長(zhǎng)的現(xiàn)象（代先祝等，2010;吳海波等，2018）。本研究分別采用YSP、NA、NYBD、CM、EAS和LB培養(yǎng)基對(duì)除草活性成團(tuán)泛菌ZLSY20菌株進(jìn)行搖床培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該菌在YSP培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，其次為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。為提高細(xì)菌產(chǎn)量并在發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)能接入活性好、功效強(qiáng)的菌株，對(duì)ZLSY20菌株進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵2～24 h為其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，因此后續(xù)可在該對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中后期時(shí)發(fā)酵和取樣。

影響微生物發(fā)酵的因子較多，主要包括碳源、氮源、溫度和初始pH等，但不同的微生物對(duì)碳源、氮源和溫度等條件的選擇存在差異（梁艷瓊等，2011;鄒立飛等，2018）。本研究結(jié)果表明，各碳源對(duì)ZLSY20菌株生長(zhǎng)速度的影響差異不明顯，說明ZLSY20菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)碳源的選擇范圍較廣，其中對(duì)蔗糖的利用效果較好;對(duì)于氮源，發(fā)現(xiàn)蛋白胨和胰蛋白胨均有利于菌體生長(zhǎng)，而銨態(tài)氮源硝酸銨等難以被利用，且銨態(tài)氮作氮源時(shí)在一定程度上抑制了ZLSY20菌株的生長(zhǎng)。在發(fā)酵條件優(yōu)化方面，通過正交試驗(yàn)，對(duì)培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度、接種量、通氣量和轉(zhuǎn)速進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)ZLSY20菌株最適pH為8，說明該菌適合在中性或略偏堿性的環(huán)境中生長(zhǎng);ZLSY20菌株在16～40 ℃內(nèi)均能正常生長(zhǎng)，說明其對(duì)溫度環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng)，在32 ℃下生長(zhǎng)最好，但在24 ℃以下生長(zhǎng)較慢，表明低溫不適合用于該菌的發(fā)酵培養(yǎng)。轉(zhuǎn)速和通氣量均與培養(yǎng)液中的氧氣溶解量有關(guān)，正交試驗(yàn)結(jié)果表明，通氣量對(duì)ZLSY20菌株的生長(zhǎng)效果影響顯著;通氣量20 mL、轉(zhuǎn)速200 r/min時(shí)的菌液濃度最大;接菌量為0.05%時(shí)ZLSY20菌株生長(zhǎng)最好，細(xì)菌能充分利用養(yǎng)分和空間，接菌量過大則因養(yǎng)分和空間有限而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。

張曉宇（2014）研究報(bào)道成團(tuán)泛菌XM2發(fā)酵的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為酵母膏15 g、麥芽糖5 g、NaC1 5 g、蒸餾水1000 mL、初始pH 7.0;最優(yōu)培養(yǎng)條件為溫度20 ℃、裝液量40 mL/250 mL、接種量10%、發(fā)酵時(shí)間24 h。柯紅嬌等（2014）制備成團(tuán)泛菌Ljb-2發(fā)酵培養(yǎng)液的條件為溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min、接種量1%、培養(yǎng)時(shí)間48 h。上述研究結(jié)果表明，不同菌株的最佳發(fā)酵條件不同，可能與其遺傳特征和生理特性不同有關(guān)，也與所獲取菌株的特定生境有關(guān)。

本研究對(duì)ZLSY20菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化并確定了最佳條件，提高其發(fā)酵產(chǎn)量，有望從中分離得到有益的活性物質(zhì)，為利用細(xì)菌防治紫莖澤蘭打下一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但對(duì)于發(fā)酵液的活性成分尚不清楚，后續(xù)將對(duì)菌株的除草活性成分進(jìn)行深入探究。

4 結(jié)論

通過對(duì)除草活性成團(tuán)泛菌ZLSY20菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)最適合ZLSY20菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基及組分為YSP培養(yǎng)基（蛋白胨1.5%、酵母膏2.0%、蔗糖2.0%），最適合ZLSY20菌株生長(zhǎng)的發(fā)酵條件為培養(yǎng)時(shí)間24 h、培養(yǎng)溫度32 ℃、初始pH 8、接菌量0.05%、通氣量20 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速200 r/min。優(yōu)化方案下可有效提高ZLSY20菌株的發(fā)酵產(chǎn)量，建立的方案可用于快速、大批量地發(fā)酵ZLSY20菌懸液。

參考文獻(xiàn)：

陳哲，梁宏，黃靜，趙佳. 2016. 解淀粉芽孢桿菌CM3培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，44（11）：1577-1583. [Chen Z，Liang H，Huang J，Zhao J. 2016. Optimization of medium and fermentation condition for Bacillus amyloliquefaciens CM3[J]. Journal of Shanxi Agricultural Sciences，44（11）： 1577-1583.]

代先祝，梁曉麗，邱勤. 2010. 低營(yíng)養(yǎng)濃度培養(yǎng)基分離培養(yǎng)生物膜中的細(xì)菌及其鑒定[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，37（7）： 951-955. [Dai X Z，Liang X L，Qiu Q. 2010. Isolation and identification of bacteria from biofilm with culture me-dium of low medium concentration[J]. Microbiology China，37（7）： 951-955.]

高偉，魏松紅，王翀，胡沙，蘇翠萍，李麗. 2009. 除草活性細(xì)菌SY9的篩選與發(fā)酵條件研究[J]. 雜草科學(xué)，（1）： 20-23. [Gao W，Wei S H，Wang C，Hu S，Su C P，Li L. 2009. Screening and fermentation conditions of herbicidal active bacteria SY9[J]. Weed Science，（1）： 20-23.]

柯紅嬌，王勇，衛(wèi)甜，谷春，劉紅霞，郭堅(jiān)華. 2014. 成團(tuán)泛菌Ljb-2對(duì)番茄黃化曲葉病毒病的田間防效初步研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，41（5）： 985-993. [Ke H J，Wang Y，Wei T，Gu C，Liu H X，Guo J H. 2014. Suppression of tomato yellow leaf curl virus disease by the Pantoea agglomerans strain Ljb-2 in the field[J]. Acta Horticulturae Sinica，41（5）： 985-993.]

蘭明先，馬沙，張某，郝克強(qiáng)，魯武峰，吳國(guó)星，高熹. 2017. 澤蘭實(shí)蠅的研究進(jìn)展[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，48（3）： 459-464. [Lan M X，Ma S，Zhang M，Hao K Q，Lu W F，Wu G X，Gao X. 2017. Procecidochares utilis Stone： A review[J]. Journal of Southern Agriculture，48（3）： 459-464.]

蘭明先，張某，李建一，魯武鋒，李召波，夏濤，李麗芳，吳國(guó)星，高熹. 2018. 澤蘭實(shí)蠅幼蟲內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及除草活性研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，30（1）：59-64. [Lan M X，Zhang M，Li J Y，Lu W F，Li Z B，Xia T，Li L F，Wu G X，Gao X. 2018. Isolation，identification and herbicidal activity of symbiotic bacteria in Procecidochares utilis larvae[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，30（1）：59-64.]

李霞霞，張欽弟，朱珣之. 2017. 近十年入侵植物紫莖澤蘭研究進(jìn)展[J]. 草業(yè)科學(xué)，34（2）： 283-292. [Li X X，Zhang Q D，Zhu X Z. 2017. Progress of the research on invasive plant species Eupatorium adenophorum over the last decade[J]. Pratacultural Science，34（2）： 283-292.]

梁艷瓊，雷照鳴，賀春萍，鄭肖蘭，鄭服叢. 2011. 解磷菌株黑曲霉PSFM發(fā)酵條件優(yōu)化研究[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，42（3）： 240-245. [Liang Y Q，Lei Z M，He C P，Zheng X L，Zheng F C. 2011. Optimization of fermentation condition for phosphate-solubilizing fungi（Aspergillus niger）[J]. Journal of Southern Agriculture，42（3）： 240-245.]

魯武峰，蘭明先，夏濤，李召波，廖賢斌，李夢(mèng)月，高熹，吳國(guó)星. 2018. 澤蘭實(shí)蠅幼蟲和蟲癭空間分布型及抽樣技術(shù)[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，49（5）： 844-890. [Lu W F，Lan M X，Xia T，Li Z B，Liao X B， Li M Y，Gao X，Wu G X.2018. Spatial distribution pattern and sampling technique for larvae and galls of Procecidochares utilis Stone[J]. Journal of Southern Agriculture，49（5）： 844-890.]

歐國(guó)騰，趙宇翔，江贏，韓勇，徐德全，蔡衛(wèi)東. 2012. 貴州南部山區(qū)紫莖澤蘭的替代控制研究[J]. 中國(guó)森林病蟲，31（2）： 23-26. [Ou G T，Zhao Y X，Jiang Y，Han Y，Xu D Q，Cai W D. 2012. Biological substitution control of Eupatorium adenophorum Spreng in the southern mountai-nous regions of Guizhou Province[J]. Forest Pest and Di-sease，31（2）： 23-26.]

王翀，林慧龍，何蘭，曹坳程. 2014. 紫莖澤蘭潛在分布對(duì)氣候變化響應(yīng)的研究[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，23（4）： 20-30. [Wang C，Lin H L，He L，Cao A C. 2014. Research on responses of Eupatorium adenophorum's potential distribution to climate change[J]. Acta Prataculturae Sinica，23（4）：20-30.]

王亞麒，焦玉潔，陳丹梅，袁玲，黃玥，吳葉寬，杜如萬(wàn). 2016. 紫莖澤蘭浸提液對(duì)牧草種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，25（2）： 150-159. [Wang Y Q，Jiao Y J，Chen D M，Yuan L，Huang Y，Wu Y K，Du R W. 2016. Effects of Eupatorium adenophorum extracts on seed germination and seedling growth of pasture species[J]. Acta Prataculturae Sinica，25（2）： 150-159.]

吳海波，王櫻潼，葉維雁，劉惠民. 2018. 4株番木瓜根際解磷細(xì)菌發(fā)酵條件優(yōu)化研究[J]. 西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），38（2）： 117-125. [Wu H B，Wang Y T，Ye W Y，Liu H M. 2018. Optimization of fermentation conditions of 4 Rhizosphere phosphate-solubilizing bacteria of Carica papaya[J]. Journal of Southwest Forestry University（Natural Sciences），38（2）： 117-125.]

楊國(guó)慶，萬(wàn)方浩，劉萬(wàn)學(xué). 2008. 入侵雜草紫莖澤蘭的化感作用研究進(jìn)展[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，35（5）： 463-468. [Yang G Q，Wan F H，Liu W X. 2008. Alleopathy research pro-gress on an invasive weed，Ageratina adenophora Sprengel[J]. Acta Phytophylacica Sinica，35（5）： 463-468.]

張根偉. 2005. 枯草芽孢桿菌BS-6液體發(fā)酵條件的研究[J]. 河北省農(nóng)科院學(xué)報(bào)，22（1）： 54-57. [Zhang G W. 2005. Studies on liquid fermentation conditions of Bacillus subtilis BS-6[J]. Journal of the Hebei Academy of Sciences，22（1）： 54-57.]

張某，楊璞，朱家穎，袁遠(yuǎn)，桂富榮，高熹，吳國(guó)星. 2016. 基于16S rDNA基因序列的澤蘭實(shí)蠅幼蟲腸道細(xì)菌多樣性分析[J]. 昆蟲學(xué)報(bào)，59（2）： 200-208. [Zhang M，Yang P，Zhu J Y，Yuan Y，Gui F R，Gao X，Wu G X. 2016. Ana-lysis of the bacterial diversity in the intestine of larval Procecidochares utilis（Diptera： Trypetidae） based on 16S rDNA gene sequence[J]. Acta Entomologica Sinica，59（2）： 200-208.]

張曉宇. 2014. 黃金梨采后病害生防菌的分離篩選及抗菌蛋白研究[D]. 太谷： 山西農(nóng)業(yè)大學(xué). [Zhang X Y. 2014. Study on isolating，screening and actibiotic protein of biological controlling bacteria against gold pear postharvest disease[D]. Taigu： Shanxi Agricultural University.]

朱文達(dá)，曹坳程，顏冬冬，李林，劉曉燕，郭章碧，陳耕. 2013. 除草劑對(duì)紫莖澤蘭防治效果及開花結(jié)實(shí)的影響[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，22（5）： 820-825. [Zhu W D，Cao A C，Yan D D，Li L，Liu X Y，Guo Z B，Chen G. 2013. Evaluation the efficacy and influence of herbicides on flowering and fruitification of Eupatorium adenophorum Spreng[J]. Eco-logy and Environmental Sciences，22（5）： 820-825.]

朱文達(dá)，顏冬冬，何燕紅，李林，歐陽(yáng)燦彬，曹坳程. 2018. 石榴替代控制紫莖澤蘭的種植模式研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，30（1）： 65-69. [Zhu W D，Yan D D，He Y H，Li L，Ou-yang C B，Cao A C. 2018. Study on cultivation pattern of pomegranate（Punica granatum） for replacement and control of Eupatorium adenophorum[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，30（1）： 65-69.]

鄒立飛，余小蘭，鄒雨坤，李光義，李曉亮，鄭鵬，李勤奮. 2018. 拮抗甜瓜枯萎病鏈霉菌D2菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，49（5）： 905-911. [Zou L F，Yu X L，Zou Y K，Li G Y，Li X L，Zheng P，Li Q F. 2018. Opti-mition of fermentation conditions of streptomyces strain D2，an antagonistic strepomyces against muskmelon fusarium wilt[J]. Journal of Southern Agriculture，49（5）： 905-911.]

（責(zé)任編輯 麻小燕）