雌雄小鼠對傷害性刺激敏感度不同和韁外側(cè)核反應(yīng)有關(guān)

景興科，馬小蘭，尹 潔，景玉宏

(1. 寶雞職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，陜西寶雞 721013；2. 蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)研究所，甘肅蘭州 730000)

研究表明雌雄小鼠對傷害性刺激的表現(xiàn)不同，雌性小鼠對傷害性刺激更為敏感，尚不明確雌雄小鼠對傷害性刺激的不同反應(yīng)是否與腦內(nèi)相關(guān)核團對傷害性信息的敏感度不同有關(guān)[1]。傷害性信息的鞏固與儲存和韁外側(cè)核的關(guān)系非常密切，韁外側(cè)核是大腦的一個重要組成部分，進化上相對保守，嚙齒類動物的韁外側(cè)核位于大腦皮層下、腦的中軸線附近，屬于上丘腦的一部分，和其他核團分界清晰，分內(nèi)外側(cè)兩部分，和分泌多巴胺的腹側(cè)被蓋核及分泌5-羥色胺(5-HT)的中縫背核之間有往返的纖維聯(lián)系[2-3]?；谏窠?jīng)影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn)抑郁患者韁外側(cè)核活動度增加[4]，在抑郁動物模型上也有類似發(fā)現(xiàn)[5]，因此，韁外側(cè)核是治療重癥抑郁的重要靶點。CaMK-2β是調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞內(nèi)鈣信號的重要蛋白，在多個腦區(qū)有表達[6]。研究表明小鼠給予傷害性刺激誘導(dǎo)抑郁樣行為，韁外側(cè)核神經(jīng)元CaMK-2β表達水平會明顯升高，給抗抑郁藥氟西汀能顯著下調(diào)韁外側(cè)核中CaMK-2β蛋白的表達，抑郁癥狀也隨之好轉(zhuǎn)[7]。抑郁及創(chuàng)傷后應(yīng)激綜合征(PTSD)呈現(xiàn)出較為明顯的性別差異，女性的發(fā)病率明顯高于男性，但基礎(chǔ)研究大多采用雄性動物，很少做雌雄兩類動物的比較，有關(guān)韁外側(cè)核的性別差異也鮮有報道。雌性和雄性動物對傷害性刺激的反應(yīng)不同，是否和傷害性刺激導(dǎo)致的韁外側(cè)核神經(jīng)元反應(yīng)性不同有關(guān)，目前尚不清楚。本研究探討給予等量的傷害性刺激后，雌性和雄性C57B/L小鼠對傷害性信息的存儲和反應(yīng)有何不同，與韁外側(cè)核CaMK-2β的表達有何關(guān)系，以期為同類研究提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料CaMK-2β抗體購自Proteintech公司，GAPDH購自Immunoway公司，DAB試劑盒購自中杉金橋生物公司，一抗及二抗均購自北京博奧森公司。蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物科技公司。其他普通試劑購自上海生物工程公司。

1.2 實驗動物60只SPF級C57B/L小鼠，體質(zhì)量20～22 g(蘭州大學(xué)實驗動物中心提供)，小鼠齡2個月，雌雄分開，每籠4只，安靜清潔環(huán)境飼養(yǎng)，12 h光照周期，溫度22～25 ℃，濕度40%左右，水和食物供給充分。適應(yīng)環(huán)境1周后，利用曠場實驗篩選探索行為相對趨同的48只小鼠用于實驗，其中雌雄小鼠各24只，分別隨機分為對照組(Control，無給電刺激)和電刺激組(stress)，共4組。24 h后檢測動物對傷害性場景的反應(yīng)，48 h后檢測小鼠條件性消退反應(yīng)，隨后處死動物，取材用于檢測。全部實驗經(jīng)蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物倫理委員會批準。

1.3 行為學(xué)實驗實驗裝置：泰盟STT-100穿梭實驗視頻分析系統(tǒng)。穿梭箱由2個箱體組成，每個箱體的規(guī)格(長×寬×高)為：14.3 cm×15.5 cm×21.0 cm，穿梭門洞4.0 cm×3.7 cm，頂部裝有紅外攝像頭可記錄小鼠的活動，底部為電柵欄(柵欄直徑4 mm，中心距8.9 mm)與電刺激器相連。

訓(xùn)練過程(傷害性信息建立)：包括測試場景的學(xué)習(xí)和熟悉、傷害性刺激信息的建立。第1天每只小鼠在1號穿梭箱適應(yīng)180 s后接受5次聲音和足底配對刺激(聲音4 s，足底電刺激24 V，0.5 s，間隔60 s，圖1A)。

傷害性場景測試(圖1B)：訓(xùn)練后24 h，放置小鼠于2號箱內(nèi)，關(guān)閉聲音刺激，去除電刺激，但有光刺激，持續(xù)時間3 min，記錄小鼠在進入2號箱內(nèi)，光照后靜止不動的時間，作為探索潛伏期，以此時間長度代表動物對傷害性刺激的鞏固程度。

條件性消退測試(圖1C、D)：傷害性場景測試完成后24 h，小鼠置于1號箱，給予聲音刺激(4 s)，但沒有電刺激，聲音刺激促使小鼠進入2號箱，2號箱內(nèi)有光刺激，3個循環(huán)。測試期，關(guān)閉穿梭門洞，小鼠直接置于1號箱內(nèi)，給予聲音刺激(4 s)，觀察3 min內(nèi)小鼠在1號箱內(nèi)靜止不動的時間，作為探索潛伏期，此時間長度代表給予消退治療后小鼠對傷害性場景信息的鞏固程度。

圖1 行為學(xué)測試

Fig.1 Behavioral test

A：非條件聯(lián)合條件刺激模式圖；B：24 h后，檢測小鼠對刺激場景反應(yīng)的模式圖；C：48 h后，給予3次消退訓(xùn)練，消退訓(xùn)練模式圖；D：檢測消退訓(xùn)練后對條件刺激反應(yīng)模式圖。

1.4 小鼠全腦連續(xù)冠狀切片共4組動物，每組選取6只小鼠，共24只。水合氯醛(350 mg/kg，i.p)麻醉，固定于手術(shù)臺上，開胸，暴露心臟，經(jīng)左心室穿刺進針，連接蠕動泵，持續(xù)勻速(28 r/min)灌注9 g/mL的生理鹽水20 min，灌注時長5 min。保證循環(huán)系統(tǒng)的血液全部置換沖洗干凈，然后灌注0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PB)配置多聚甲醛(40 g/L，PA)固定液30 mL，灌注時長7 min。灌注完畢，打開顱骨，分離全腦，剝除腦膜，繼續(xù)放入PA后固定12 h，經(jīng)梯度蔗糖脫水，恒冷切片機切片，全腦連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚25 μm，收集于冷凍保護液中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 免疫組化染色參照小鼠腦圖譜，選取韁外側(cè)核平面(AP：-0.94 mm～-2.18 mm，以bregma為參照點)。采用漂片法，切片經(jīng)0.01 mol/L磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)漂洗5 min，3次。加入0.3 mL/L過氧化氫，室溫孵育30 min。0.01 mol/L PBS漂洗，加入100 mL/L羊血清，37 ℃孵育1 h，加入兔抗CaMK-2β抗體(1∶200)4 ℃過夜，漂洗，加入生物素化羊抗兔IgG(1∶200)，37 ℃孵育2 h。0.01 mol/L PBS漂洗，加入Strep-avidin-HRP(1∶200)，37 ℃孵育2 h，0.01 mol/L PBS漂洗。DAB顯色，脫水、透明、樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 韁外側(cè)核新鮮腦組織分離和總蛋白提取4組動物，每組選取6只，斷頭處死，冰臺上分離全腦，體視顯微鏡下分離韁外側(cè)核。分離的新鮮組織，稱重，加入RIPA蛋白裂解液(含有蛋白酶抑制劑)，剪碎，經(jīng)細胞超聲破碎，提取總蛋白。利用Nanao Drop檢測蛋白濃度。

1.7 Western blot檢測韁外側(cè)核CaMK-2β蛋白表達配置100 mL/L SDS-PAGE，蛋白上樣總量為100 μg。電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，50 g/L脫脂牛奶封閉。加入兔抗CaMK-2β抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜，0.1 mol/L TBST漂洗，加入羊抗兔IgG-HRP(1∶2 000)。內(nèi)參照加入小鼠抗GAPDH抗體(1∶2 000)。利用化學(xué)放光法顯色，條帶經(jīng)灰度掃描，用相對表達量表示。

2 結(jié) 果

2.1 雌雄小鼠行為學(xué)測試結(jié)果傷害性場景測試結(jié)果可見，雌性小鼠[(23±3.1)s]在測試箱內(nèi)(2號箱)對條件刺激誘導(dǎo)的潛伏期時間明顯長于雄性小鼠[(10.2±2.6)s，圖2A，P=0.007]。條件性消退測試結(jié)果可見，雌性小鼠對條件刺激誘導(dǎo)的潛伏期時間[(13.2±2.4)s]明顯長于雄性小鼠[(9.6±2.1)s，圖2B，P=0.032]。上述結(jié)果表明雌性小鼠對非條件刺激的敏感性高于雄性小鼠，且雌性小鼠對條件性消退訓(xùn)練的耐受性高于雄性小鼠。

圖2 雌雄小鼠行為學(xué)測試結(jié)果

Fig.2 Results of behavioral test (n=12)

A：雌雄小鼠對條件刺激反應(yīng)潛伏期；B：雌雄小鼠對消退訓(xùn)練后刺激反應(yīng)潛伏期。與雌性小鼠比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 各組小鼠韁外側(cè)核CaMK-2β陽性細胞計數(shù)在連續(xù)冠狀切片上，每只動物挑取韁外側(cè)核3～5個平面，免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測韁外側(cè)核CaMK-2β陽性細胞數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)非條件刺激后48 h，雌性小鼠韁外側(cè)核CaMK-2β陽性細胞計數(shù)[(210±8.9)μm2]明顯高于對照組[(133.3±7.6)μm2]，但雄性小鼠兩組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(圖3)。這說明傷害性刺激誘導(dǎo)雌性小鼠韁外側(cè)核更多神經(jīng)元出現(xiàn)活化。

2.3 各組小鼠韁外側(cè)核CaMK-2β蛋白的表達水平Western blot結(jié)果顯示，傷害性刺激后48 h，雌性小鼠韁外側(cè)核CaMK-2β表達水平比對照組升高了1.43倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4，P=0.027)；雄性小鼠CaMK-2β和對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.083)。

3 討 論

神經(jīng)退行性疾病及神經(jīng)精神類疾病常常表現(xiàn)出一定的性別傾向，如阿爾茨海默病患者女性多于男性，帕金森病患者男性多于女性，抑郁和焦慮則女性更為易感[8]，研究腦的性別二態(tài)性，可能會對此類疾病的發(fā)生提供有意義的解釋。嚙齒類動物也有類似反應(yīng)，雌性和雄性小鼠對傷害性刺激的反應(yīng)閾值往往不同，主要表現(xiàn)為雌小鼠對傷害性刺激更為敏感，更容易強化該行為信息，對此類傷害性信息的消退需要更長時間。這一特性可能是由于進化過程中，雌性動物在種群延續(xù)方面付出更多，因此行為模式的選擇更為謹慎，攻擊性、冒險性行為相對降低，傷害性信息在雌性動物腦內(nèi)的預(yù)警系統(tǒng)閾值更低[9]。

圖3 免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測小鼠韁外側(cè)核CaMK-2β的表達

Fig.3 Immunohistochemical detection of the expression level of CaMK-2β in the lateral habenula nucleus (n=6)

A：CaMK-2β免疫組化代表性圖片。虛線示意韁外側(cè)核的位置，右上角黑框圖片系虛線區(qū)局部高倍放大；藍色箭頭示意陽性細胞。B：陽性細胞計數(shù)。Control：對照組；stress：非條件聯(lián)合條件刺激組。與對照組比較，*P<0.05。

圖4 Western blot檢測小鼠韁外側(cè)核CaMK-2β的表達

Fig.4 The expression level of CaMK-2β in the habenula detected by Western blot (n=6)

A：Western blot檢測結(jié)果；B：利用灰度掃描計算的CaMK-2β相對表達的比較。與對照組比較，*P<0.05。

行為的性別差異意味著腦的結(jié)構(gòu)和功能存在性別二態(tài)性，哺乳動物性別二態(tài)性最明顯的腦區(qū)是下丘腦的視前核，該區(qū)域和生殖行為關(guān)系密切，損傷雌性大鼠視前核導(dǎo)致動情周期及母性行為發(fā)生變化[10]。形態(tài)上，雄性大鼠視前核是雌性的5～8倍，人的視前核也呈現(xiàn)性別差異，男性是女性的2倍[11]。外側(cè)韁外側(cè)核不但在種系進化上相對保守，其功能也非常復(fù)雜，一般認為外側(cè)韁外側(cè)核在前腦與后腦、中腦單胺類神經(jīng)元信息傳導(dǎo)中起到重要的調(diào)節(jié)作用[12-13]，涉及非常廣泛的功能調(diào)節(jié)，如疼痛、對壓力刺激的適應(yīng)性反應(yīng)、母性行為、晝夜節(jié)律、睡眠、成癮、焦慮和抑郁等[14-17]。最近研究發(fā)現(xiàn)，韁外側(cè)核參與負性情緒相關(guān)的神經(jīng)信息處理，決定信息輸出的閾值，與重度抑郁發(fā)病過程中無助感和快感缺失癥狀關(guān)系密切[18-19]。但對韁外側(cè)核是否在結(jié)構(gòu)上存在性別差異尚未見相關(guān)報道。本研究結(jié)果顯示，雌性小鼠和雄性小鼠韁外側(cè)核的形態(tài)并沒有明顯差異，對雌雄小鼠韁外側(cè)核細胞密度(尼氏染色)的定量測量也未見顯著差異(數(shù)據(jù)未展示)。但雌性小鼠對傷害性刺激的敏感性以及對傷害性信息消退的耐受性和雄性小鼠比較存在明顯差異，這一差異可能和韁外側(cè)核CaMK-2β的表達有關(guān)；雌性小鼠韁外側(cè)核傷害性刺激誘導(dǎo)的CaMK-2β表達水平明顯高于對照組，而CaMK-2β水平可以作為韁外側(cè)核神經(jīng)元活動性的標(biāo)志，可以推斷，在傷害性刺激后48 h，雌性小鼠韁外側(cè)核神經(jīng)元依然處于較高的活動水平，而雄性小鼠CaMK-2β的表達和正常對照組比較沒有統(tǒng)計學(xué)差別，與行為學(xué)檢測結(jié)果基本一致。

行為的性別差異是自然界非常普遍的現(xiàn)象，該差異很大程度上和中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)上的微細差別有關(guān)，尤其是本能行為，如求偶和幼仔照護行為在雌雄動物之間有明顯不同[20-22]。哺乳動物神經(jīng)結(jié)構(gòu)上的細微差異可能是神經(jīng)發(fā)育過程中雌激素和雄激素調(diào)控的結(jié)果?，F(xiàn)有的研究證據(jù)也表明雌激素和雄激素通過各自的受體，影響神經(jīng)元內(nèi)性別特異性基因的表達，誘導(dǎo)發(fā)育期神經(jīng)元發(fā)生不可逆分化，改變特定腦區(qū)神經(jīng)元數(shù)量和神經(jīng)元之間的連接方式，導(dǎo)致神經(jīng)功能出現(xiàn)性別差異[23-27]。雄激素和雌激素受體在很多腦區(qū)均有表達，參與了神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)。其中腹側(cè)被蓋的多巴胺神經(jīng)元和中縫背核的5-HT神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)有雌激素受體和雄激素受體的分布[28]，這兩個腦區(qū)參與獎賞環(huán)路和行為的動機形成，傷害性刺激誘導(dǎo)的厭惡行為，導(dǎo)致動物對傷害性環(huán)境的逃避增加、探索行為減少。目前認為韁外側(cè)核是厭惡行為和逃避行為調(diào)節(jié)的關(guān)鍵腦區(qū)[29]，腹側(cè)被蓋及中縫背核是獎賞行為調(diào)節(jié)的關(guān)鍵腦區(qū)[30]。韁外側(cè)核和腹側(cè)被蓋及中縫背核之間有往返纖維，這表明對某種刺激，選擇厭惡性逃避還是進一步探索，可能是上述腦區(qū)協(xié)同調(diào)節(jié)的結(jié)果。如果韁外側(cè)核神經(jīng)元有更多活化，對腹側(cè)被蓋及中縫背核的抑制可能增加，表現(xiàn)為探索行為減少。反之，獎賞環(huán)路活化，探索行為增加。本研究中，傷害性刺激導(dǎo)致的韁外側(cè)核神經(jīng)元活化(表現(xiàn)為CaMK-2β表達水平增加)可能抑制了獎賞環(huán)路，減少了行為動機，表現(xiàn)為探索行為的減少。但有關(guān)傷害性刺激的性別差異和韁外側(cè)核在其中的作用，需要更多研究予以證實，尤其性激素在韁外核神經(jīng)元的分布及調(diào)節(jié)功能需要進一步的研究。