基于非標記蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究白羽肉雞不同部位肌肉的蛋白差異

劉志紅，奈日樂，謝遇春，米 璐，馬麗娜，趙 濛，孫 昂，李金泉，王志新,*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，內(nèi)蒙古自治區(qū)動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，農(nóng)業(yè)部肉羊遺傳育種重點實驗室，內(nèi)蒙古自治區(qū)山羊遺傳育種工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學經(jīng)濟管理學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

白羽肉雞別名AA雞，具有抗病力強、肉質(zhì)細嫩、飼養(yǎng)周期短等特點。相比于其他肉類，雞肉具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇和低熱量等特點[1-2]。每100 g雞肉中含有接近其總質(zhì)量1/5的蛋白質(zhì)[3]，相比于豬肉、牛肉、羊肉等高產(chǎn)量肉類，雞肉的蛋白質(zhì)含量最高。研究表明，烘干基礎(chǔ)上，機械去骨雞肉與新鮮雞胸肉蛋白質(zhì)含量分別高達90.5%和82.2%，雞肉的氨基酸組成比例均一，蛋白功效比和利用率均很高[4-5]，具有很高的生物價值和消化率。隨著白羽肉雞胴體質(zhì)量等級的增加，雞胸肉與雞腿肉的質(zhì)量與內(nèi)聚性、咀嚼性呈顯著負相關(guān)，與硬度呈極顯著負相關(guān)[6]。雞胸肉是典型的白肌肌肉，雞腿肉是典型的紅肌肌肉，紅肌和白肌的化學組成和功能特性均存在差異，雞胸肉中含B族維生素較多，因此可以保護皮膚，減輕疲勞，雞腿肉中含有較多的鐵質(zhì)，可以改善缺鐵性貧血[7]。不同部位的雞肉蛋白質(zhì)組存在差異。雞肉蛋白質(zhì)的氨基酸組成比例均衡，且鮮味氨基酸、支鏈氨基酸和抗氧化性氨基酸含量較高，但組成蛋白質(zhì)的各氨基酸比例存在較大差異[8]。

作為肌肉的重要組成部分，蛋白質(zhì)的改變會引起肌肉品質(zhì)的變化[9]。蛋白質(zhì)的變化規(guī)律有其自身的特定性，通常這些特性無法通過基因組學直接反應(yīng)出來[10]，而蛋白質(zhì)組學是有效的檢測工具。隨著組學技術(shù)的發(fā)展，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學技術(shù)廣泛應(yīng)用于豬[11]、雞[12]、牛[13]、羊[14]肉質(zhì)的研究中。Lamctsch等[15]運用質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)，宰后肌肉組織中鈣蛋白酶的含量與豬肉的嫩度相關(guān)。黃曉毅[16]研究發(fā)現(xiàn)，肉品質(zhì)變化可能與熱休克蛋白相關(guān)。Doherty等[17]闡述了蛋雞胸肌蛋白質(zhì)的組成，揭示了相關(guān)蛋白質(zhì)在生長期集中表達的差異。這些研究表明，蛋白質(zhì)組學技術(shù)是鑒定肉質(zhì)蛋白差異的有利工具。本研究利用非標記蛋白質(zhì)組學定量技術(shù)SWATH（sequential window acquisition of all theoretical fragment-ion spectra）和數(shù)據(jù)非依賴型采集（data independent acquisition，DIA）技術(shù)，對白羽肉雞雞腿肉與雞胸肉進行蛋白質(zhì)鑒定和定量分析，以期為雞肉肉質(zhì)形成的分子機制和品質(zhì)快速鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣本由3 只白羽肉雞（35 日齡）作為生物重復，分別采集3 只雞的雞腿肉與雞胸肉。

蛋白裂解液、尿素、胰蛋白酶（Trypsin）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碳酸氫銨 美國賽默飛世爾公司。

1.2 儀器與設(shè)備

－80 ℃冰箱 美國賽默飛世爾公司；98-IIIN超聲波粉碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；Z323K低溫離心機 德國Hermle公司；QT-901渦旋儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Eksigent Technologies液相色譜儀、TOF 5600質(zhì)譜儀 美國AB Sciex公司。

1.3 方法

1.3.1 總蛋白提取

取適量樣品置于含有液氮的研缽中研磨成粉末狀，將樣本轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入1 g/100 mL十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）裂解液，每隔1 min在渦旋儀上渦旋30 s，20 min后結(jié)束；超聲破碎2 min，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清；使用BCA（Bioteke）試劑盒進行總蛋白質(zhì)量濃度測定。

1.3.2 總蛋白酶解

取蛋白含量100 μg的樣品，加入200 μL含8 mol/L尿素和10 mmol/L DTT的混合溶液，37 ℃變性1 h，12 000 r/min離心40 min，加入200 μL尿素，振蕩、12 000 r/min離心30 min，重復2 次；加入200 μL 50 mmol/L IAA避光反應(yīng)30 min，12 000 r/min離心30 min；加入100 μL 100 mmol/L碳酸氫銨，12 000 r/min離心20 min，重復3 次；加入適量Trypsin 37 ℃孵育過夜，12 000 r/min離心30 min；加入50 μL 100 mmol/L碳酸氫銨，12 000 r/min離心30 min，重復2 次；收集濾液，凍干，備用。

1.3.3 總蛋白鑒定

取100 μg凍干粉，50 μL 2%乙腈水溶液復溶，利用DIA與SWATH方法上機鑒定總蛋白與差異蛋白。離子源：DIA掃描模式：正離子模式；噴霧電壓2.3 kV；離子源溫度150 ℃。蛋白鑒定模式：一級掃描模式：全掃描；一級掃描范圍：150～1 200m/z；質(zhì)譜分辨率設(shè)為30 000；選擇窗口：0.4 Da；碎裂模式：誘導碰撞解離（collision-induced dissociation，CID）；碎裂能量：動態(tài)碎裂；二級掃描范圍：100～1 500m/z；循環(huán)模式：動態(tài)排除掃描；動態(tài)排除時間18 s；SWATH定量模式：一級掃描模式：全掃描；一級掃描范圍：150～1 200m/z；質(zhì)譜分辨率設(shè)為30 000；間隔窗口25 u（如400～425（m/z）、424～449、448～473, ,1 175～1 200）；碎裂模式：CID；碎裂能量：動態(tài)碎裂；二級掃描范圍：100～1 500m/z；循環(huán)模式：依次均勻掃描。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 蛋白鑒定

將液相色譜-質(zhì)譜連用采集的雞腿肉與雞胸肉DIA數(shù)據(jù)利用Protien Pilot 4.5軟件進行搜庫，蛋白數(shù)據(jù)庫來源于UniProt/Swiss-Prot。

保留時間校準：利用PeakView軟件，對雞腿肉和雞胸肉的SWATH數(shù)據(jù)與DIA數(shù)據(jù)進行比對，進行保留時間校準，做定量分析。

1.4.2 差異蛋白的篩選

通過LOG2（Fold Change）與－LOG10（Pvalue）值繪制火山圖，應(yīng)用Marker View軟件，以Pvalue＜0.05、差異倍數(shù)（Fold Change）＞2或＜0.5作為閾值，選取雞腿肉和雞胸肉的差異蛋白。

1.4.3 基因本體論（gene ontology，GO）富集分析

GO富集分析使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8軟件的功能注釋一欄對篩選出的差異蛋白按照細胞學組分、分子功能及生物學過程進行分類，使用默認設(shè)置進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞胸肉與雞腿肉總蛋白的提取

采用BCA（Bioteke）試劑盒對總蛋白質(zhì)量濃度進行測定，得到的總蛋白質(zhì)量濃度標準曲線方程為y=0.012 5x+0.092 4（R2=0.991 3），說明標準曲線比較理想，可以用于樣品蛋白質(zhì)量濃度的計算。根據(jù)蛋白在595 nm波長處的吸光度（A595nm）及標準曲線方程，計算不同部位肌肉樣品的蛋白質(zhì)量濃度，結(jié)果如表1所示。

表1 不同部位肌肉的蛋白質(zhì)量濃度Table 1 Protein concentration of different carcass parts

取蛋白含量30 μg的樣品進行蛋白均一化，并進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）檢測。由圖1可知，蛋白質(zhì)提取效果較好，條帶均一，說明蛋白質(zhì)量濃度測定準確，可用于后期實驗。

2.2 雞胸肉與雞腿肉總蛋白的鑒定

以UniProt/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫為背景，對雞腿肉和雞胸肉蛋白質(zhì)進行鑒定，初步建立雞腿肉和雞胸肉的蛋白質(zhì)表達譜。由圖2可知，1%假陽性（false discovery rate，F(xiàn)DR）條件下檢測到875 個蛋白質(zhì)及16 855 條肽段。

對總蛋白進行GO組分富集分析，由圖3可知，在生物學進程中參與生物學轉(zhuǎn)化過程的蛋白質(zhì)最多，其次為蛋白質(zhì)穩(wěn)定化功能；在細胞組分中，富集于胞外外泌體中的蛋白質(zhì)最多，其次富集于細胞質(zhì)內(nèi)；在分子功能中，參與分子功能的多聚核糖核酸結(jié)合功能的蛋白質(zhì)最多，其次為ATP結(jié)合功能。

2.3 雞胸肉與雞腿肉的主成分分析

主成分分析是基于原有變量建立兩兩不相關(guān)的反應(yīng)差異蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)原有信息的新變量信息[11]。通過主成分分析構(gòu)建反映雞胸肉與雞腿肉差異蛋白質(zhì)組信息的分析圖，直觀顯示雞腿肉和雞胸肉的蛋白質(zhì)組成差異。

由圖4可知，技術(shù)重復性均較好，表明儀器狀態(tài)良好，數(shù)據(jù)可信，并且2 組分布在不同區(qū)間，說明雞腿肉與雞胸肉的蛋白質(zhì)組有較大差異。

2.4 雞胸肉與雞腿肉差異蛋白的篩選與鑒定

由圖5可知，以P value＜0.05、Fold Change＞2或＜0.5作為閾值，篩選出雞腿肉和雞胸肉的差異蛋白98 個。其中雞腿肉中上調(diào)蛋白71 個，雞腿肉中下調(diào)蛋白，即雞胸肉中上調(diào)蛋白27 個。

對雞腿肉中的上調(diào)蛋白進行GO組分富集分析，由圖6可知，這些蛋白參與?；o酶A脫氫酶催化的脂肪酸β-氧化、三羧酸循環(huán)及脂質(zhì)體內(nèi)平衡等生物學過程；在細胞組分中，主要富集于線粒體；在分子功能中，參與氧化還原酶活性功能、脂肪?；o酶A結(jié)合功能、NAD結(jié)合功能、肌動活動功能、電子載體活性、黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合功能及催化活性等。

對雞胸肉中的上調(diào)蛋白進行GO組分富集分析，由圖7可知，在生物學進程中，骨骼肌收縮與心肌收縮過程中富集的蛋白質(zhì)最多；在細胞組分中富集于胞外外泌體中的蛋白質(zhì)最多，且沒有蛋白質(zhì)富集于分子功能中。

3 討 論

蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，利用蛋白質(zhì)組學方法可以從全新的角度來分析與肉質(zhì)相關(guān)的問題，有望運用蛋白質(zhì)組學技術(shù)對肌肉品質(zhì)進行有效控制[18-20]。研究表明，蛋白質(zhì)組成的變化可能引起與肌肉嫩度相關(guān)的變化[21]。目前，蛋白質(zhì)組學多用于篩選多組樣品之間關(guān)鍵的有意義差異蛋白[22-23]。本研究利用DIA技術(shù)鑒定雞胸肉與雞腿肉的總蛋白，再利用SWATH技術(shù)對雞胸肉與雞腿肉進行定量分析，篩選差異蛋白，并通過GO富集分析差異蛋白肉的功能特性，為不同類型雞肉形成的分子機制研究提供參考。

對雞肉進行分類發(fā)現(xiàn)，雞腿肉是紅肌肌肉，而雞胸肉是白肌肌肉，紅肌肌肉和白肌肌肉在化學組成和執(zhí)行功能上存在一定差異[24]。Lesiow等[25]研究發(fā)現(xiàn)，雞腿肉蛋白形成的凝膠比雞胸肉蛋白凝膠硬度小。Fretheim等[26]研究表明，雞胸肉蛋白的保水性顯著大于雞腿肉蛋白。廖國周等[27]運用雙向電泳技術(shù)篩選云南騰沖雪雞腿肌與胸肌的差異蛋白，結(jié)果表明，腿肌含有高表達蛋白點56 個，經(jīng)鑒定，對應(yīng)9 種蛋白質(zhì)；胸肌中含有高表達蛋白點54 個，對應(yīng)10 種蛋白質(zhì)。本研究篩選出雞腿肉中的高表達蛋白71 個，雞胸肉中27 個，鑒定數(shù)量較多。雞腿肉中的上調(diào)蛋白主要參與?；o酶A脫氫酶催化的脂肪酸β-氧化、三羧酸循環(huán)等生物學過程；在分子功能中，其主要參與氧化還原酶活性、脂肪酰基輔酶A結(jié)合等功能；并且主要富集于細胞組分線粒體內(nèi)。三羧酸循環(huán)是化學合成和能量代謝的核心，氧化還原酶可以催化底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)，而線粒體則是進行氧化代謝的重要細胞器[28-29]。由GO富集分析可知，雞腿肉中的高表達蛋白均富集于運動相關(guān)功能中，可能與腿肌具有負重與行走等功能、需參與有氧與無氧運動有關(guān)。對韓國土雞腿肉運用雙向電泳分析蛋白差異發(fā)現(xiàn)，高表達的蛋白質(zhì)主要為磷酸葡萄糖變位酶1、肌鈣蛋白、熱休克蛋白B1、細胞色素C還原酶、乙醛酸酶1和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b，其中磷酸葡萄糖變位酶1、肌鈣蛋白和乙醛酸酶1等均與腿肌運動相關(guān)，此結(jié)果與本研究對雞腿肉的功能推測相符[30]。對雞胸肉中的上調(diào)蛋白進行GO組分富集分析，結(jié)果表明，在生物學過程中，在骨骼肌收縮與心肌收縮過程富集的蛋白質(zhì)較多，在細胞組分中富集于胞外外泌體中的蛋白質(zhì)最多，且沒有蛋白質(zhì)富集于分子功能中。雞胸部肌肉的主要功能有使肱骨內(nèi)收、協(xié)助肱骨內(nèi)旋、輔助深呼吸肌及上提肋骨等，因此可能導致雞胸肉中富集于肌肉收縮功能的上調(diào)蛋白較多。Cai等[31]研究木質(zhì)雞胸肉和普通雞胸肉，運用雙向電泳技術(shù)篩選出8 個差異蛋白點，分別為與肌肉收縮、蛋白銜接、血漿中蛋白、糖酵解、ATP再生功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，而肌肉收縮、ATP再生功能與本研究雞胸肉所參與的功能基本相符。2 組數(shù)據(jù)的GO富集分析結(jié)果表明，雞腿肉和雞胸肉中的高表達蛋白均富集于完全不同的功能中，這與雞腿肉與雞胸肉的肉質(zhì)差異有關(guān)。

4 結(jié) 論

雞腿肉和雞胸肉中共有875 個蛋白質(zhì)與16 855 條肽段，共篩選出98 個差異蛋白，其中包括雞腿肉中的上調(diào)差異蛋白71 個。GO功能分析結(jié)果表明，雞腿肉中的高表達蛋白均富集于運動相關(guān)功能中，而雞胸肉中的上調(diào)蛋白多富集于肌肉收縮功能。