產(chǎn)咖啡酸刺五加內(nèi)生細菌CX15的鑒定及活性研究

摘 要：研究內(nèi)生細菌CX15的活性作用及活性代謝物。采用HPLC法對CX15發(fā)酵液中活性代謝物進行分析;采用濾紙片法對內(nèi)生細菌CX15進行抑菌活性研究;結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及16S rDNA序列同源性分析對該菌株進行了鑒定。結(jié)果表明，內(nèi)生細菌CX15發(fā)酵液中含有咖啡酸;同時，該菌株具有較好的抑菌活性;經(jīng)鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），說明內(nèi)生細菌CX15為咖啡酸產(chǎn)生菌，該菌可能與宿主植物刺五加具有相同的代謝機制。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生細菌;抑菌活性;鑒定;咖啡酸

中圖分類號：R932; Q939.97

文獻標(biāo)識碼：A

刺五加（Acanthopanax sentcosus（Rupr.et Maxim.）Harms）為北方瀕危藥用植物[1]，具有抗腫瘤[2]，抗氧化、免疫調(diào)節(jié)[3]，抗抑郁[4]、降血糖[5]等作用，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于食品、藥品領(lǐng)域[6]，其主要活性成分為黃酮類、簡單苯丙素類、有機酸類、香豆素類、三萜皂苷類、氨基酸類以及其他類化合物[7]。

本文基于內(nèi)生菌與宿主植物在長期協(xié)同進化過程中形成了互惠共生關(guān)系理論，即：宿主植物為內(nèi)生菌生長發(fā)育提供必需的生態(tài)環(huán)境，避免外界生物或非生物的干擾等[8];同時，內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物能夠刺激植物生長發(fā)育，提供宿主植物對環(huán)境脅迫的抵抗能力[9]，刺激宿主產(chǎn)生各種次生代謝產(chǎn)物以維護機體的健康[10]。以刺五加內(nèi)生細菌CX15為研究對象，對其發(fā)酵液中次生代謝產(chǎn)物進行分析;同時也開展活性研究;并對其進行了菌種鑒定。為綜合利用該菌株，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)刺五加活性成分奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)

供試菌：刺五加內(nèi)生細菌CX15（黑龍江大學(xué)生物制藥專業(yè)實驗惠贈）。

NA培養(yǎng)基由牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉組成;PDA培養(yǎng)基由馬鈴薯、葡萄糖組成[11]。

16Sr DNA序列擴增引物（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2儀器與試劑

高效液相色譜儀（FL2 200型，浙江溫嶺）。

試劑：甲醇為色譜純級別，其他試劑均為分析純。

1.3內(nèi)生細菌CX15發(fā)酵液供試品的制備

取已活化的CX15菌株接種于NA液體培養(yǎng)基中，120r/min，37℃振蕩發(fā)酵培養(yǎng)5d，取出，于2000r/min離心10min，得發(fā)酵液，凍干，備用。

1.4內(nèi)生細菌CX15發(fā)酵液分析

采用HPLC法對CX15菌株發(fā)酵液中活性成分進行分析。取內(nèi)生細菌CX15發(fā)酵液分析供試品液，甲醇溶解，微孔濾膜過濾（ 0.45um），取濾液作為供試品溶液。分別精密吸取0.5mg/mL咖啡酸對照品液及供試品液各10uL注入色譜儀，色譜柱：Venusil XBP-C18柱;流動相：甲醇-水-磷酸（30：70： 0.2）;流速：1 mL/min;檢測波長：254nm。

1.5抑菌活性檢測

取內(nèi)生細菌CXl-5發(fā)酵液的供試品，以適量甲醇溶解成1mg/mL的供試品液，過濾（0.22um無菌濾器），采用濾紙片法[12]，進行抑菌活性測定。

1.6內(nèi)生細菌CX15菌株鑒定

1.6.1內(nèi)生細菌CX15形態(tài)學(xué)觀察及生理生化指標(biāo)測定

形態(tài)學(xué)鑒定主要觀察內(nèi)生細菌CXl5菌株的菌落、細胞形態(tài)，革蘭氏染色，有無鞭毛等;生理生化測定主要選取以下微生物常用的指標(biāo)進行鑒定：生長溫度的測定，需氧性的測定，耐鹽性的測定，耐酸堿度的測定，生長曲線的測定，淀粉水解反應(yīng)，明膠液化試驗，酶的測定，甲基紅試驗，運動性試驗等[13]。

1.6.2 16S rDNA序列擴增和序列分析

利用細菌16S rDNA基因的通用引物對內(nèi)生細菌CX15菌株進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行核苷酸序列測定。將獲得的序列與GenBank中相關(guān)菌株的16S rDNA序列進行同源性分析，并利用最大簡約法構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)進化樹[14]。

2結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細菌CX15發(fā)酵液分析結(jié)果

通過HPLC法，以咖啡酸為對照，對CX15發(fā)酵液中活性成分進行分析，在CX15發(fā)酵液中檢測到咖啡酸，而陰性對照（培養(yǎng)基）無干擾;同時CX15發(fā)酵液中色譜峰采用對照品加入法，得到了較好的確認，其結(jié)果如圖1及圖2所示;同時，在CX15發(fā)酵液中還存在與刺五加生藥相同的未知成分x，說明在CX15發(fā)酵液中含有大量的與宿主植物刺五加相同或相似的活性代謝物。

2.2抑菌活性檢測結(jié)果

刺五加內(nèi)生細菌CX15發(fā)酵液對11種致病菌均有不同程度的抑制作用，結(jié)果見表1。

2.3內(nèi)生細菌CX15菌株鑒定結(jié)果

2.3.1內(nèi)生細菌CX15菌株形態(tài)學(xué)觀察及生理生化指標(biāo)測定結(jié)果

CX15菌株形態(tài)學(xué)觀察及生理生化指標(biāo)測定結(jié)果見表2。

2.3.2 16S rDNA序列擴增和序列分析結(jié)果

CX15菌株P(guān)CR擴增后得到1條1603bp的特異性條帶，通過GENBANK比對，CX15（登錄號為：JQ756968）與枯草芽孢桿菌KT873853.1序列相似性達到92%，綜合生理生化和16S rDNA基因序列的分析結(jié)果，初步鑒定菌株CX15為枯草芽孢桿菌（Bacillus suhtilis）。菌株CX15系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

3結(jié)論

本研究對刺五加內(nèi)生細菌CX15發(fā)酵液進行初步分析，發(fā)現(xiàn)在刺五加內(nèi)生細菌CX15發(fā)酵液中存在與宿主植物刺五加相同的活性成分咖啡酸，說明內(nèi)生細菌CX15為咖啡酸產(chǎn)生菌;同時也說明刺五加內(nèi)生細菌CX15在次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生機制方面與宿主植物刺五加有著相似之處。為了深入開發(fā)應(yīng)用內(nèi)生細菌CX15，對其進行了抑菌活性研究，也同時對其進行了菌株鑒定。若開展系統(tǒng)提取分離法，對CX15發(fā)酵液中咖啡酸等活性代謝物進行分離、鑒定等研究將具有重要意義。以CX15為發(fā)酵菌株，開展微生物發(fā)酵法生產(chǎn)咖啡酸原料及CX15菌株的綜合利用研究工作還在繼續(xù)進行中。

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作者簡介 ：康勛 （ 1978- ），男，江省濱人，高級藝師，現(xiàn)從事業(yè)技術(shù)推廣與服務(wù)工作。