Hi-C：高通量染色體構(gòu)象分析技術(shù)

郭曉強(qiáng)

Hi-C是一種分析染色體空間構(gòu)象的高通量測(cè)序技水，它有助于研究者理解染色體三維空間結(jié)構(gòu)、染色體之間相互作用以及基因表達(dá)的空間調(diào)控機(jī)制，相關(guān)結(jié)果深化了對(duì)組織發(fā)育和瘩癥發(fā)生等過程的認(rèn)識(shí)，而這種技術(shù)的誕生，緣起千科學(xué)家對(duì)染色體及其結(jié)構(gòu)持續(xù)不斷之探素。

染色體是一種存在于真核細(xì)胞核內(nèi)的特殊結(jié)構(gòu)，通過影響遺傳物質(zhì)DNA活性而對(duì)細(xì)胞行為的各方面發(fā)揮關(guān)鍵性影響。根據(jù)“結(jié)構(gòu)決定功能”原則，染色體二維（three-dimension，3D）結(jié)構(gòu)自然成為理解其生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，然而限于技術(shù)上的原因，對(duì)染色體3D結(jié)構(gòu)的解析，進(jìn)展一直較為緩慢。

染色體：遺傳的物質(zhì)和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

首先回顧一下染色體研究的歷程。

1879年，德國(guó)細(xì)胞生物學(xué)家弗萊明（W.Flemming）在研究細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核內(nèi)存在可被堿性染料高度著色的物質(zhì)，根據(jù)這一特性于次年將其命名為染色質(zhì)（chromatin）;1888年，另一位德國(guó)解剖學(xué)家馮.瓦爾代耶一哈茨（H.W： G.von Waldeyer-Hartz）創(chuàng)造出染色體（chromosome）一詞。染色質(zhì)和染色體兩個(gè)術(shù)語存在一定差異。首先所描繪的狀態(tài)不同：在細(xì)胞分裂間期，核內(nèi)結(jié)構(gòu)較為松散，無固定形態(tài)，一般稱為染色質(zhì);在細(xì)胞分裂期，結(jié)構(gòu)濃縮，產(chǎn)生可明顯辨識(shí)的形態(tài)，稱染色體。其次側(cè)重點(diǎn)不同：染色質(zhì)側(cè)重于物質(zhì)組成（類似“蛋白質(zhì)”命名），而染色體傾向于結(jié)構(gòu)（類似“線粒體”命名），因此提及二維結(jié)構(gòu)時(shí)更多使用染色體一詞。早在1869年，瑞士醫(yī)生米歇爾（F.Miescher）鑒定出染色質(zhì)的核心成分——核酸（主要是DNA）;而1884年，德國(guó)科學(xué)家科賽爾（A.Kossel）進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)的另一關(guān)鍵成分——組蛋白，從而明確了染色質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

19世紀(jì)末，德國(guó)科學(xué)家博韋里（T.H.Boveri）和美國(guó)遺傳學(xué)家薩頓（W.S.Sutton）基于細(xì)胞分裂過程中的染色體變化，提出“遺傳的染色體決定”學(xué)說。美國(guó)遺傳學(xué)家摩爾根（T.H.Morgan ）進(jìn)一步用果蠅實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一理論，從而肯定了染色體在遺傳學(xué)乃至生命科學(xué)研究中的核心地位。1944年，美國(guó)細(xì)菌學(xué)家艾弗里（O.T.Avery）等借助肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)，進(jìn)一步將染色體研究聚焦到了DNA。

1953年，沃森（J.D.Watson）和克里克（F.H.C.Crick）提出DNA雙螺旋模型，闡明了DNA二級(jí)結(jié)構(gòu);1977年桑格（F.Sanger）發(fā)明酶法測(cè)序技術(shù)，并測(cè)定出一種噬菌體DNA的堿基排列順序，從而弄清了DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)。2003年人類基因組計(jì)劃的完成，標(biāo)志著人類24條染色體（22條常染色體加X， Y兩條性染色體）中DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的全解析。

一個(gè)人體細(xì)胞含有23對(duì)染色體，如果將所含的DNA拉直，并首尾相連，總長(zhǎng)度可達(dá)2米，而細(xì)胞核的直徑只有6微米?？梢韵胂笠幌拢瑢⒁粭l馬拉松長(zhǎng)度（10公里）的細(xì)線，有序地放人一只乒乓球（直徑4厘米）內(nèi)，難度該有多大！特別是，細(xì)胞核內(nèi)除DNA外，還包含多種其他成分、空間更顯狹窄，因此DNA必然需要經(jīng)過折疊、彎曲等一系列變化，從而使原本空間距離漫長(zhǎng)的一條染色體的各局部或者不同的染色體之間互相靠近?，F(xiàn)在的問題是，如何獲悉細(xì)胞核內(nèi)染色體（重點(diǎn)是DNA）的3D結(jié)構(gòu)。

染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)：3C時(shí)代的到來

盡管染色體3D結(jié)構(gòu)十分重要，但由于維系這種結(jié)構(gòu)的力很弱，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于維系一級(jí)結(jié)構(gòu)的磷酸二酯鍵和維系二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵（還包括堿基堆積力），因此研究起來困難重重。傳統(tǒng)的方法主要借助電子顯微鏡技術(shù)，受分辨率所限，無法獲得較清晰的圖像。2002年，哈佛大學(xué)德克爾（J.Dekker）小組首先發(fā)明染色體構(gòu)象捕獲（chromosome conformation capture）技術(shù)[1]，從而為解析染色體3D結(jié)構(gòu)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，由于該技術(shù)3個(gè)英文單詞的首字母均為C，故又稱3C技術(shù)。

歸納起來，3C技術(shù)主要包括6步[2]。第一步，固定。使用固定劑（常為甲醛）將靠近染色體的2個(gè)區(qū)域相連，固定劑在這里發(fā)揮了“雙面膠”的雙向抓牢作用，使原本結(jié)構(gòu)可變的染色體“靜止”，以利于后續(xù)操作。如果一條染色體內(nèi)部被固定，常形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。第二步，酶切。對(duì)固定后的染色體使用限制性內(nèi)切酶處理。一般使用識(shí)別6堿基的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行操作，理論上每4096（4₆）個(gè)堿基就存在一個(gè)酶切位點(diǎn)。通過酶切，可將環(huán)內(nèi)部剪切為多個(gè)片段。第三步，連接。使用DNA連接酶使切斷的DNA片段重新連接，形成一個(gè)DNA環(huán)。第四步，解環(huán)。被固定的DNA解除交聯(lián)，使環(huán)狀DNA線性化。第五步，擴(kuò)增。例如，原來線性DNA存在A-E共5個(gè)片段，推測(cè)形成空間結(jié)構(gòu)后，A和E可能靠近，因此在A片段和E片段靠近限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)之處，設(shè)計(jì)引物，并以線性DNA為模板，進(jìn)行半定量或定量的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增。第六步，判定。根據(jù)不同引物組合的擴(kuò)增效率，確定2個(gè)片段空間靠近的概率。3C技術(shù)主要確定“一對(duì)一”關(guān)系，就是線性距離較遠(yuǎn)的2個(gè)DNA片段之空間關(guān)系。例如借助3C技術(shù)闡明了，在紅細(xì)胞內(nèi)階珠蛋白基因表達(dá)過程中，存在遠(yuǎn)距離調(diào)控的現(xiàn)象。

3C技術(shù)的發(fā)明在染色體DNA空間結(jié)構(gòu)研究領(lǐng)域具有里程碑意義，該技術(shù)隨后被進(jìn)一步完善與發(fā)展，導(dǎo)致一系列衍生技術(shù)的問世。

4C（3C-on-chip或circular3C）是2006年在3C基礎(chǔ)上的一種改進(jìn)技術(shù)。接著3C技術(shù)的第四步，對(duì)解環(huán)后的DNA再進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理（此步驟一般用4堿基識(shí)別酶），然后連接環(huán)化產(chǎn)生一個(gè)新的DNA環(huán)，以此DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。在引物設(shè)計(jì)方面，都在A片段靠近酶切位點(diǎn)之處，從而擴(kuò)增到與A可能存在空間關(guān)系的片段，再借助基因芯片或者測(cè)序方法確定這些片段的位置。從原理上可以看出，4C解決的是DNA片段“一對(duì)多”的關(guān)系。

SC（3C carbon copy）技術(shù)是在2006年出現(xiàn)的另一版本的3C衍生技術(shù)。其原理在于，對(duì)3C第四步解環(huán)DNA兩端加上接頭（攜帶有通用性引物），然后在中間酶切位點(diǎn)處設(shè)計(jì)左向和右向引物，這些引物除與靶點(diǎn)配對(duì)外，還外加一段兼并序列，隨后進(jìn)行擴(kuò)增，用擴(kuò)增產(chǎn)物通過基因芯片或測(cè)序來確定具體位置。從實(shí)驗(yàn)過程可以得出，SC解決的是DNA片段“多對(duì)多”的關(guān)系。此外，3C還演變出ChIP-loop [chromatinimmunaprecipitation（染色質(zhì)免疫共沉淀）-loop]技術(shù)，它是在3C技術(shù)酶解和連接兩步之間補(bǔ)充一個(gè)染色質(zhì)免疫共沉淀過程，目的在于研究DNA成環(huán)過程中相關(guān)蛋白質(zhì)的作用。

盡管從3C演變到5C，極大地深化了對(duì)染色體片段間相互關(guān)系的理解，但仍無法從整體上認(rèn)識(shí)染色體的3D結(jié)構(gòu)。

Mi-C技術(shù)：3C到3D的轉(zhuǎn)變

2009年，德克爾與基因組測(cè)序?qū)＜姨m德爾（E.S，Lander）合作發(fā)明了高通量3C（high throughput 3C，Hi-C）技術(shù)[3]，再次實(shí)現(xiàn)技術(shù)的升級(jí)。Hi-C技術(shù)在3C技術(shù)第三步（連接）的地方進(jìn)行了修改，通過添加生物素標(biāo)記的核什酸，使后續(xù)連接而成的環(huán)中攜帶生物素解交聯(lián)產(chǎn)生的線性DNA，再借助機(jī)械力剪切，產(chǎn)生許多小片段DNA，利用親和素特異性結(jié)合生物素的原理，將攜帶生物素核背酸的DNA片段富集，并對(duì)這些DNA片段的兩端添加測(cè)序接頭，進(jìn)而采用二代測(cè)序和對(duì)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析：如果一個(gè)短片段DNA限制性酶切位點(diǎn)兩側(cè)的序列分別位于空間位置較遠(yuǎn)的兩段DNA內(nèi)部（既可為同一條染色體，也可為不同染色體），則初步判斷兩者可能存在空間作用，根據(jù)這種組合出現(xiàn)的頻率多少而得出DNA片段間的關(guān)聯(lián)性強(qiáng)弱，最終形成一個(gè)涵蓋所有DNA片段在內(nèi)的空間關(guān)聯(lián)圖，也即染色體3D結(jié)構(gòu)

與此幾乎同時(shí)，還誕生了ChIA-PET（chromatininteraction analysis by paired-end tag sequencing，染色質(zhì)相互作用的配對(duì)末端標(biāo)記測(cè)序分析）技術(shù)跟3C升級(jí)到Hi-C相類似，ChIA-PET可以看作ChIP-loop的提升版，從研究單環(huán)形成過程中的蛋自質(zhì)作用轉(zhuǎn)變?yōu)檠芯咳旧w3D結(jié)構(gòu)形成中的蛋自質(zhì)功能，從而為Hi-C提供重要的信息補(bǔ)充

3C及其一系列衍生技術(shù)，特別是Hi-C，為染色質(zhì)3D結(jié)構(gòu)研究提供了強(qiáng)大的工具，從而可以更清晰地觀察染色體的空間構(gòu)象，達(dá)到對(duì)染色體功能和基因表達(dá)調(diào)節(jié)的新認(rèn)識(shí)，同時(shí)對(duì)染色體在細(xì)胞發(fā)育和疾病發(fā)生過程中的分子機(jī)制也能得到新的理解

H i-C的成就：更清晰的染色體結(jié)構(gòu)

3C系列技術(shù)的快速發(fā)展，極大地提升了對(duì)染色體3D結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)傳統(tǒng)認(rèn)知是從DNA雙螺旋（或超螺旋）直接到顯微鏡下可見的染色體形態(tài)。隨著分辨率的提升，又觀察到層次分明的一系列亞結(jié)構(gòu)lal

染色質(zhì)環(huán)（loop）是兩段直線距離較遠(yuǎn)的DNA片段（如調(diào)節(jié)性DNA和編碼基因啟動(dòng)子）由于空間靠近而形成的一種染色質(zhì)結(jié)構(gòu)借助Hi-C技術(shù)發(fā)現(xiàn)，人染色體含有10000個(gè)左右的這種結(jié)構(gòu).它們主要與基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。根據(jù)成環(huán)后效果的差異.主要可分為兩類：一類具有增強(qiáng)子（enhancer，一段增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄的DNA）效應(yīng)，成環(huán)有利于基因的表達(dá);另一類具有絕緣子（insulator一段表達(dá)抑制功能的DNA）效應(yīng)，成環(huán)使基因激活受阻活性染色質(zhì)中心（active chromatin hub，ACH）是用干描述基因轉(zhuǎn)錄激活形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)較為普遍，除紅細(xì)胞p一珠蛋自基因外，還包含。一珠蛋白基因H19-Igf2基因座等在哺乳動(dòng)物中，絕緣子與靶基因成環(huán)往往還需要CCCTC結(jié)合因子（CCCTC-binding factor，CTCF）輔助CTCF是一種抑制性轉(zhuǎn)錄因子，其介導(dǎo)的絕緣子與靶基因成環(huán)，通過占位效應(yīng)破壞增強(qiáng)子成環(huán)，從而產(chǎn)生抑制基因轉(zhuǎn)錄的效果[5]。

通過Hi-C技術(shù)所做出的一個(gè)重大發(fā)現(xiàn)是，從染色體中鑒定出大量的拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域（topologicallyassociated domain，TAD）[6]。TAD是指一個(gè)DNA區(qū)域，區(qū)域內(nèi)DNA片段更傾向于自我相互作用，而不與其他DNA片段接觸TAD結(jié)構(gòu)在果蠅和哺乳動(dòng)物中普遍存在，既被認(rèn)為是一種染色體亞結(jié)構(gòu)，又被看作一種功能單元TAD通常由多個(gè)染色體環(huán)組成，而且其結(jié)構(gòu)的形成和維持還要CTCF和黏連蛋白（cohesin）復(fù)合物等參與

借助Hi-C技術(shù)還發(fā)現(xiàn)，整個(gè)染色體可分為2類明顯的區(qū)室（compartment）結(jié)構(gòu)，分別稱為區(qū)室A和區(qū)室B。與TAD的性質(zhì)類似，區(qū)室結(jié)構(gòu)也具有空間自我相互作用（A更傾向于A，B更傾向于B）、區(qū)室A聚集了活性表達(dá)基因，結(jié)構(gòu)較為疏松，一般位于細(xì)胞核的中心區(qū);區(qū)室B則極少含有編碼基因，轉(zhuǎn)錄不活躍，結(jié)構(gòu)緊湊，主要占據(jù)細(xì)胞核的外周區(qū)。區(qū)室結(jié)構(gòu)的存在說明，染色體基因在空間上具有成簇性，從而有利于細(xì)胞核中心區(qū)的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物在發(fā)揮活性的時(shí)候提高效率。

染色體域（chromosome territory）是指某條染色體傾向于占據(jù)細(xì)胞核內(nèi)特定的位置，如人19號(hào)染色體富含基因，它通常占據(jù)活躍轉(zhuǎn)錄的中心區(qū);而含基因較少的18號(hào)染色體，則更多地被排斥于外周區(qū)。染色體域的存在，說明單條染色體并非隨機(jī)排布，而是根據(jù)需要有序地排列二不同染色體的占位以及它們之間的相互作用，對(duì)于它們功能的發(fā)揮有重要影響。

借助Hi-C等技術(shù)，已經(jīng)揭示了真核生物染色體在細(xì)胞核內(nèi)可形成層次分明的各級(jí)結(jié)構(gòu)，從線性一級(jí)結(jié)構(gòu)、雙螺旋（超螺旋）、染色質(zhì)環(huán)、TAD、區(qū)室、染色體域，一直到完整的多染色體3D結(jié)構(gòu)。不同層次結(jié)構(gòu)的有序性，是細(xì)胞正常功能的基礎(chǔ)，而這些結(jié)構(gòu)的紊亂，是多種疾病發(fā)生的重要原因。

Hi-C的應(yīng)用：發(fā)育和疾病的新機(jī)制探索

借助Hi-C解析的高分辨率染色體3D結(jié)構(gòu)，加深了對(duì)細(xì)胞發(fā)育和疾病發(fā)生的理解。

對(duì)小鼠早期胚胎的研究發(fā)現(xiàn)，受精后染色質(zhì)呈現(xiàn)出一種明顯松散的狀態(tài)，DNA片段間相互作用較弱;8細(xì)胞期前，父本和母本染色體互相分離，占據(jù)自身的染色體域;胚胎植入前，逐漸形成高度有序的3D結(jié)構(gòu);3D結(jié)構(gòu)的形成與DNA復(fù)制、DNA甲基化、組蛋白修飾等密切相關(guān)。這些知識(shí)加深了對(duì)胚胎發(fā)育過程中染色體結(jié)構(gòu)變化的理解。

由于一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，因此DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的異常，往往帶來染色體3D結(jié)構(gòu)的變化，常見的異常包括單核昔酸變異（single-nucleotidevariant，SNV）、微插入/缺失（insertion/deletions，indels）等。此外，表觀修飾如DNA甲基化和組蛋白修飾等異常，也可破壞染色體3D結(jié)構(gòu)。目前，對(duì)染色體不同層次結(jié)構(gòu)中TAD異常與疾病發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)，研究得較為清晰。通常，TAD內(nèi)部或邊緣區(qū)序列或甲基化變異，可導(dǎo)致增強(qiáng)子和基因啟動(dòng)子之間異常結(jié)合，而造成基因異常激活，破壞基因表達(dá)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。越來越多的證據(jù)表明，非編碼DNA變異可通過破壞染色體局部或整體空間構(gòu)象，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

通過人為增加小鼠特定染色體位置的indels而改變肢體發(fā)育基因座周圍的TAD結(jié)構(gòu)，造成DNA片段間的相互作用異常，進(jìn)而破壞正?；虮磉_(dá)模式，使肢體發(fā)育異常而出現(xiàn)畸形。這一發(fā)現(xiàn)使人們對(duì)許多非編碼區(qū)基因突變或多態(tài)性的生物作用有了新的理解。

急性髓細(xì)胞白血病（AML）患者3號(hào)染色體內(nèi)部存在高頻倒位和易位，常常導(dǎo)致原癌基因EVI1異常激活。借助4C技術(shù)發(fā)現(xiàn)，這源于染色體倒位和易位造成原本無關(guān)的一段增強(qiáng)子與EVI1基因形成相互作用，而使基因“被動(dòng)”高表達(dá)。

膠質(zhì)瘤常存在高頻的異檸檬酸脫氫酶1/2（isocitrate dehydrogenase 1/2，IDH1/2）基因突變。染色體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)IDH1/2突變可引發(fā)DNA甲基化增強(qiáng)，這一異常變化破壞了CTCF介導(dǎo)的絕緣子與血小板衍生生長(zhǎng)因子A（platelet-derived growth factorreceptor A，PDGFRA）增強(qiáng)子之間形成染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)，從而造成原癌基因PDGFRA組成型激活并引發(fā)膠質(zhì)瘤。當(dāng)絕緣子功能恢復(fù)后，PDGFRA表達(dá)顯著下調(diào)。對(duì)于無IDH1/2突變的細(xì)胞，破壞其CTCF活性也可導(dǎo)致PDGFRA激活而增加致瘤性。這一發(fā)現(xiàn)揭示了膠質(zhì)瘤發(fā)生的新機(jī)制，為治療提供了新策略。

結(jié)腸癌中普遍存在胰島素樣生長(zhǎng)因子2（insulin-like growth factor 2，IGF2）基因表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象。染色體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，這源于一個(gè)TAD邊界處出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常（插入一段序列而引發(fā)串聯(lián)重復(fù)），造成IGF2啟動(dòng)子和一個(gè)原本無關(guān)的超級(jí)增強(qiáng)子“無意間”結(jié)合，產(chǎn)生新的染色質(zhì)環(huán)，進(jìn)而引發(fā)原癌基因IGF2超表達(dá)，一導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生。

Hi-C的前條：充滿挑戰(zhàn)

3C相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，革新了對(duì)染色體3D結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)：一是結(jié)構(gòu)層次性（見上）;二是相對(duì)穩(wěn)定性，每種細(xì)胞都有自身相對(duì)固定的染色體結(jié)構(gòu);三是動(dòng)態(tài)變化性，細(xì)胞周期不同階段的染色體結(jié)構(gòu)，存在一定程度的變化（而非恒定不變）;四是結(jié)構(gòu)可塑性，在細(xì)胞分化、重編程和組織發(fā)育等過程中都發(fā)生了染色體結(jié)構(gòu)的局部和整體層面的重排;五是結(jié)構(gòu)適應(yīng)性，外界刺激如激素處理、營(yíng)養(yǎng)脅迫、低氧環(huán)境和溫度變化等都可引發(fā)染色體3D結(jié)構(gòu)的重新組織，進(jìn)而改變基因表達(dá)模式，增加環(huán)境適應(yīng)性。

Hi-C技術(shù)為我們提供了令人著迷的染色體3D結(jié)構(gòu)，但所揭示的內(nèi)容僅是冰山一角，所提供的信息還較為有限。就目前的知識(shí)而言，DNA遺傳信息主要由一級(jí)結(jié)構(gòu)（核苷酸順序）決定，3D結(jié)構(gòu)也發(fā)揮了重要作用，但目前尚處于描述階段，由于被認(rèn)識(shí)和技術(shù)所限，還無法給出一個(gè)全面的理解與認(rèn)識(shí)。

Hi-C技術(shù)還面臨諸多挑戰(zhàn)。首先，技術(shù)本身有待完善和改進(jìn)，要一方面增加染色體3D結(jié)構(gòu)分辨率，另一方面更精準(zhǔn)全面地解析相關(guān)數(shù)據(jù)。其次，要探索更多發(fā)育過程中的染色體3D結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化。最后，要全面研究多種疾病發(fā)生過程中染色體3D結(jié)構(gòu)的變化，既有利于拓展對(duì)疾病機(jī)制的理解，又有望為疾病治療提供新思路。

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關(guān)鍵詞：染色體 三維結(jié)構(gòu) 3C技術(shù) Hi-C技術(shù) 癌癥