沙門菌致病的奧秘

孫蘭清 左玲莉 楊斯迪 黃瑞 吳淑燕

沙門菌是一類常見的.以人和動物為宿主的腸道致病菌，在全球范圍內引起嚴重的公共衛(wèi)生問題。本文主要介紹沙門菌人浸宿主的過程和鼠傷寒沙門菌與巨噬細胞相互斗爭的結局，揭示沙門菌致病的奧秘。

沙門菌屬（Salmonella）是一類經糞口途徑感染人和動物的革蘭陰性兼性胞內菌。作為全球四大人類腹瀉病病因之一，沙門菌感染每年可引起約1.8億例腹瀉病，導致高達41%的腹瀉相關死亡病例[1]。沙門菌的發(fā)現(xiàn)可追溯至1885年，美國獸醫(yī)病理學家沙門（D.E.Salmon）的助手史密斯（T.Smith）在尋找引起豬霍亂的病因時，從患豬體內意外分離出一種新的細菌。沙門將該菌以自己的名字命名，盡管后來研究證實這并不是他們本要尋找的病原體，但菌屬的命名“Salmonella”仍沿用至今。

沙門菌屬包括腸道沙門菌（S.enterica）和邦戈沙門菌（S.bongori）兩個種，目前已發(fā)現(xiàn)2600種以上的血清型。腸道沙門菌又可分為6個亞種，其中與人類疾病密切相關的血清型主要是第一亞種，即腸道沙門菌腸道亞種（S.enterica subsp.enterica），約99%的臨床分離株屬于此亞種。根據宿主感染后的臨床表現(xiàn)，沙門菌血清型分為類傷寒沙門菌（typhoidal Salmonella，TS）和非傷寒沙門菌（non-typhoidal Salmonella，NTS）兩大類。前者主要包括傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌、肖氏沙門菌（原稱乙型副傷寒沙門菌）和希氏沙門菌（原稱丙型副傷寒沙門菌）等。人類作為TS感染的唯一宿主，在經歷7～14天左右的無癥狀潛伏期后，可出現(xiàn)高熱、肝脾腫大和玫瑰疹等全身癥狀，即腸熱癥（enteric fever）。除上述血清型外的沙門菌歸類為NTS。NTS宿主范圍廣，部分血清型是引起人畜共患病腹瀉的病原菌。在嬰幼兒、老人和免疫功能低[人群中，NTS還可導致嚴重全身感染。

鑒于沙門菌感染在全球引起嚴重的公共衛(wèi)生問題，本文主要就沙門菌的入侵過程和鼠傷寒沙門菌與巨噬細胞的相互關系做一詳細介紹，為深入探究沙門菌的致病機制和尋找新的治療手段提供依據。

沙門菌入侵宿主的過程

沙門菌經口進入消化道，首先面臨的是pH極低的胃酸，該菌可通過激發(fā)酸耐受反應（acid toleranceresponse，ATR）增強自身的存活能力。進入腸腔的沙門菌不僅能與腸道內正常菌群競爭營養(yǎng)，還可利用自身分泌的毒力蛋白獲得生長優(yōu)勢。例如，NTS中的鼠傷寒沙門菌（S.typhimurium）可利用腸道內正常菌群無法代謝的成分，一種活性氧（reactive oxygen species，ROS）和內源性含硫化合物硫代硫酸鹽的反應產物連四硫酸鹽（tetrathionate），從而通過調控呼吸作用與腸道共生菌競爭營養(yǎng)。腸腔內的沙門菌在黏附素和菌毛介導的黏附作用下，主要定植于人體回腸末端和近端結腸，并利用其致病性突破腸黏膜上皮屏障。

沙門菌的致病性與染色體、染色體外的質粒、噬菌體基因組和可移動元件等密切相關。其中，毒力島是存在于細菌染色體上編碼毒力相關基因的特定區(qū)域。沙門菌毒力島1（Salmonella pathogenicity island 1，SPI-1）和沙門菌毒力島2（Salmonella pathogenicity island2，SPI-2）分別編碼兩種重要的Ⅲ型分泌系統(tǒng)（type Ⅲsecretion system 1和type Ⅲ secretion system 2，簡稱為T3SS-1和T3SS-2）。該系統(tǒng)的結構類似于“注射器”，能將沙門菌分泌的效應蛋白轉運至宿主細胞內，以促進細菌的定植、繁殖和擴散。除染色體外，沙門菌質粒攜帶的毒力基因亦是該菌致病的重要因素。如筆者實驗室長期研究的存在于大多數致病性沙門菌質粒的毒力基因spv（Salmonellaplasmid virulence gene），包括調控基因spvR和4個結構基因spvA、spvB、spvC及spvD共5個開放閱讀框，其編碼產物在促進沙門菌感染宿主過程中發(fā)揮重要作用。沙門菌在上述部分效應蛋白的協(xié)助下，主要通過以下3種方式突破腸黏膜上皮屏障致病。

腸黏膜上皮屏障包括腸黏膜表面黏膜層、腸上皮細胞、細胞間緊密連接和固有層。腸上皮細胞由不同類型的細胞組成，如腸上皮細胞、產生黏膜的杯狀細胞、分泌抗菌肽的潘氏細胞、位于隱窩的干細胞和轉運抗原的微褶皺細胞（microfold cell，M細胞）等。沙門菌突破腸黏膜上皮屏障最主要的一種方式是由M細胞介導的轉胞吞作用。M細胞與其他腸上皮細胞緊密連接，可將腸腔中的病原菌和抗原成分轉運至位于其下方的派爾集合淋巴結（Peyer's patch，PP），供巨噬細胞吞噬和清除。

沙門菌的第2種突破方式是利用自身的T3SS-1系統(tǒng)，誘導腸上皮細胞發(fā)揮胞吞作用。Hi1D是沙門菌入侵宿主的關鍵調節(jié)分子，由其感知腸腔內高滲低氧環(huán)境的信號啟動轉錄，調控T3SS-1系統(tǒng)的組件、相關效應蛋白及其他轉錄因子。隨后，沙門菌通過T3SS-1系統(tǒng)分泌SopE、SopE2和SopB等感染早期效應蛋白，激活細胞分裂周期蛋白42（cell divisioncycle protein 42，Cdc42）等Ras超家族三磷酸鳥昔結合蛋白Rho GTP酶的活性，從而誘導宿主細胞肌動蛋白骨架重排，促進細胞的胞吞作用，并觸發(fā)胞內膜性結構的形成。此外，SipA和SipC等效應蛋白可直接與T3SS-1在宿主細胞注射部位的肌動蛋白結合從而發(fā)揮上述細胞骨架重排等效應。一旦進入宿主細胞，沙門菌可分泌SptP和SspHl等效應蛋自，逆轉細胞骨架發(fā)生的改變，有利于維持宿主細胞的穩(wěn)定，從而保證自身存活。細胞內的膜性結構，經部分T3SS-2效應蛋白修飾后，將胞質內的沙門菌包裹形成含沙門菌的囊泡（Salmonella-containing vacuole，SCV）（以下簡稱“囊泡”）免受不利因素的影響。囊泡內環(huán)境酸化（pH5-5.5）、抗菌肽增加、鈣離子Cat'和鎂離子Mg‘等二價陽離子以及磷酸鹽濃度降低等累積效應，促進T3SS-2表達和SifA、SseG和SseF等效應蛋白的分泌，有利于沙門菌誘導的絲狀結構（Salmonella-induced filaments，Sifs）形成。在Sifs的牽引下，囊泡逐步遷移至靠近細胞核的高爾基體附近，以獲得更多能量和營養(yǎng)物質。盡管有研究發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌可以游離于胞漿大量繁殖，但囊泡仍被認為是沙門菌胞內繁殖的主要場所[2]。

除上述兩種途徑外，細胞旁路途經亦是沙門菌突破腸黏膜上皮屏障的重要方式。一方面，沙門菌可通過SopB，SopE，SopE2和SipA等效應蛋自破壞腸上皮細胞間緊密連接的結構和功能，有利于自身入侵;另一方面，CX3CR1+巨噬細胞和樹突狀細胞也可從細胞旁路直接伸出偽足，捕捉腸腔內的沙門菌，穿過腸勃膜上皮。沙門菌突破腸黏膜上皮屏障到達派爾集合淋巴結后，NTS感染往往局限于胃腸道，但嚴重時可同TS一樣播散至肝和脾等臟器，引發(fā)嚴重全身感染。

鼠傷寒沙門菌與巨噬細胞的相互作用

在NTS各血清型導致的全身感染中，鼠傷寒沙門菌是最常見的致病菌之一，約占65.2%"'。鼠傷寒沙門菌進人消化道后，除利用上述3種方式突破腸黏膜上皮屏障外，還誘導腸上皮細胞凋亡——一種受半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）家族成員調控的細胞程序性死亡方式，使細胞脫落，從而破壞上皮屏障。作為兼性胞內菌，鼠傷寒沙門菌到達固有層后，可被巨噬細胞主動吞噬或誘導巨噬細胞吞噬。

巨噬細胞由骨髓造血干細胞和定向祖細胞分化發(fā)育而來，廣泛分布于血液、骨髓、淋巴結、肝和脾等組織器官，其胞質中富含溶酶體顆粒，既可直接吞噬和殺傷病原菌，發(fā)揮非特異性免疫應答作用，又參與抗原的攝取、加工、處理和遞呈，啟動特異性免疫應答此外，巨噬細胞還可分泌細胞因子，募集活化更多的巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞等免疫細胞，在宿主抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。入侵的鼠傷寒沙門菌一方面遭遇巨噬細胞吞噬和殺傷，另一方面其以巨噬細胞為庇護場所，抵抗藥物、抗體及非特異性免疫分子，如補體、溶菌酶和防御素等的殺傷，并隨之播散到肝和脾等腸外組織產生新的病灶，導致全身感染。在感染的過程中，鼠傷寒沙門菌主要觸發(fā)巨噬細胞自噬（autophagy）、焦亡（pyroptosis）和程序性壞死（necroptosis）等細胞死亡方式。巨噬細胞利用這些機制釋放入侵的細菌，促進宿主將其清除。為了抵御宿主的抗感染免疫殺傷，實現(xiàn)自身生長、繁殖和擴散，鼠傷寒沙門菌系統(tǒng)地進化了利用細胞這些機制的能力。

細胞自噬是真核細胞進化的高度保守的防御機制。在饑餓或缺氧等應激狀態(tài)下，自噬相關基因調控內質網或高爾基體脫落脂質雙分子層形成吞噬泡，隨后通過伸展變形、包裹和閉合形成雙層膜結構的自噬體，再與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最終由溶菌酶、組織蛋白酶等將受損的細胞器、錯誤折疊的蛋白質或入侵的微生物消化降解。雖然細胞自噬在大多數情況下有利于細胞的存活，但也可引起細胞自噬性死亡。鼠傷寒沙門菌進入巨噬細胞后，利用囊泡逃避細胞自噬，但“注射器”T3SS可破壞囊泡的完整性，逸出的鼠傷寒沙門菌被胞質中的泛素迅速識別并泛素化修飾，發(fā)出“吃我”的信號以募集自噬受體蛋白，啟動細胞自噬。與此同時，暴露的半乳糖凝集素8募集自噬受體蛋白啟動細胞自噬，使躲藏在囊泡中的鼠傷寒沙門菌通過自噬途徑被降解。然而鼠傷寒沙門菌分泌的效應蛋白SifA能有效維持囊泡膜的完整性。鼠傷寒沙門菌還可分泌效應蛋白SseL，通過去泛素化作用抑制細胞自噬。沙門菌質粒毒力基因spvB編碼的效應蛋白SpvB具有ADP一核糖基轉移酶活性，可以共價修飾G一肌動蛋白（G-actin）單體，抑制其聚合形成F一肌動蛋白（F-actin），從而影響細胞骨架解聚。筆者實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，效應蛋自SpvB可通過抑制白噬體的形成抑制細胞自噬川。鼠傷寒沙門菌還可利用分子伴侶介導的細胞自噬，為其在胞內的存活和繁殖提供營養(yǎng)物質[5]另外，鼠傷寒沙門菌分泌的效應蛋白SipB進入巨噬細胞后，可通過心肌磷脂等脂質體定位于線粒體旁，在破壞線粒體的同時，將其限制在類似自噬體的多層膜結構中，誘導巨噬細胞自噬性死亡。

細胞焦亡是一種由消皮素D（gasdermin D，GSDMD）介導的細胞程序性死亡，最初因同樣受caspase家族成員的調控而歸類于細胞凋亡，表現(xiàn)為細胞不斷腫脹直至細胞膜破裂，細胞內容物的流出，進而激活強烈的炎癥反應。適度炎癥反應有利于病原菌的清除，不足則易造成病原菌播散和感染持續(xù)，但過度卻會加重組織損傷鼠傷寒沙門菌雖然由囊泡庇護，但是巨噬細胞可通過模式識別受體（pattern recognitionreceptors，PRRs）感知微環(huán)境中病原相關分子模式（pathogen一associated molecular patterns，PAMPs），從而激活炎癥反應對抗鼠傷寒沙門菌的入侵。炎癥反應途徑可分為依賴caspase 1的經典途徑和依賴caspase 4或caspase 5（小鼠體內為caspase 11）的非經典途徑。鼠傷寒沙門菌的鞭毛蛋自Flagellin、T3SS-1結構蛋白PrgJ和PrgI均可作為PAMPs被巨噬細胞的PRRs識別，激活炎性小體4（NLRC4），活化caspase 1前體，啟動經典途徑。鼠傷寒沙門菌的細胞壁脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以直接與胞質中的caspase 4、5或11前體結合活化，并啟動非經典途徑。Caspase 1、4、5和11均可作為分子剪刀，對底物GSDMD進行切割，使GSDMD的自身抑制結構域羧基端（GSDMD-CT）與活性結構域氨基端（GSDMD-NT）分離。GSDMD-NT通過保守序列與細胞膜內側的絲氨酸磷脂、磷脂酰肌醇和心肌磷脂等特定類型的磷脂結合、進而寡聚成外直徑約25納米，內直徑約10～15納米的16元聚合體孔道，即焦亡孔道?；罨腸aspase 1還可切割促炎細胞因子白細胞介素-1β（interleu kin-1β，IL-1β）和IL-18的前體使其成熟成熟的IL-1β和IL-18通過焦亡孔道釋放至胞外引發(fā)炎癥反應細胞外的水分子H₂O和鈉離子Na⁺等則由焦亡孔道進入，導致細胞腫脹破裂，胞漿及小分子物質流出加重炎癥反應。在感染與抗感染過程中，鼠傷寒沙門菌亦進化了其致病機制。例如，沙門菌質粒毒力基因spvC編碼的效應蛋白SpvC具有磷酸蘇氨酸裂解酶活性，可使絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號轉導通路中雙重磷酸化的細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellularregulated protein kinases，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）和p38不可逆的去磷酸化失活，通過抑制MAPK信號轉導通路，降低促炎細胞因子和趨化因子的水平抑制炎癥反應[6]沙門菌質粒毒力基因spuD編碼的效應蛋自SpvD則具有半胱氨酸水解酶活性，可通過干擾β核素輸出蛋白2（β-karyopherin exportin 2，Xpo2）阻斷細胞核內蛋自p65的異位，進而抑制核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）信號轉導通路而抑制炎癥反應[7]。另外，巨噬細胞還可通過細胞焦亡，將囊泡內的鼠傷寒沙門菌一起包裹在破損的細胞殘體中，形成孔誘導的胞內陷阱（pore-induced intracellular traps，PITS）使鼠傷寒沙門菌活動受限，在趨化因子的作用下募集中性粒細胞，吞噬清除PITS，從而限制鼠傷寒沙門菌播散[8]。

細胞程序性壞死同細胞焦亡一樣，也是一種細胞程序性死亡方式。與不受基因調控的被動壞死（necrosis）不同，細胞程序性壞死受腫瘤壞死因子受體（tumornecrosis factor receptor，TNFR）或PRRs調控。腫瘤壞死因子（TNF）與TNFR或PAMPs與PRRS特異性結合后，在細胞內募集一系列蛋白形成包含接頭互作蛋白激酶-1（receptor-interacting protein kinases-1，RIPK-I）的復合體Ⅰ和包含RIPK-3的復合體Ⅱ。復合體I的RIPK-1與復合體Ⅱ的RIPK-3相互磷酸化后組裝成壞死小體（necrosome），接著募集混合系列蛋自激酶結構域樣蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）使其磷酸化。磷酸化的MLKL同GSDMD-NT一樣，在細胞膜上寡聚形成壞死孔道，細胞外的H₂O和Na⁺等內流，細胞腫脹破裂死亡。鼠傷寒沙門菌感染巨噬細胞時，可下調細胞程序性壞死的經典抑制劑caspase 8的表達，同時誘導巨噬細胞自分泌I型干擾素（interferon，IFN），促進RIPK-1和RIPK-3組裝成壞死小體啟動細胞程序性壞死，釋放出大量的炎性物質加劇炎癥反應，加重組織損傷。

除巨噬細胞外，中性粒細胞作為血液中數量最多的白細胞，其胞質富含嗜天青顆粒和中性顆粒，可殺傷和消化入侵的病原菌，在抗鼠傷寒沙門菌感染中也發(fā)揮重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞除了通過脫顆粒作用（degranulation）和ROS等方式殺傷消化吞噬的鼠傷寒沙門菌，還通過非經典炎癥反應途徑及GSDMD-NT破壞細胞核膜、嗜天青顆粒膜、中性顆粒膜和細胞膜等，釋放染色質和顆粒蛋自等到細胞外，形成中性粒細胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETS）捕獲殺傷胞外游離鼠傷寒沙門菌[9]。NETs引起的中性粒細胞死亡（NETosis）又將胞內的鼠傷寒沙門菌釋放至胞外，促進宿主對其清除。感染的發(fā)生、發(fā)展與結局是沙門菌與宿主這對矛盾體博弈的結果，隨著雙方力量的消長而出現(xiàn)動態(tài)變化。沙門菌強，則感染持續(xù);宿主強，則感染治愈。

關于沙門菌的研究不僅局限于細菌致病機制，改造和利用沙門菌已成為近年來的研究熱點。除已有的通過純化沙門菌獲得的莢膜多糖制成疫苗預防傷寒之外，人們還利用沙門菌胞內寄生的生物學特性，借助基因工程技術獲得減毒株構建的新型疫苗應用于某些人畜共患病的防治;此外，還可以利用沙門菌減毒株作為基因傳遞載體，靶向聚集于乏氧的腫瘤組織，使外源基因得以表達，發(fā)揮抗腫瘤作用等[10]。綜上，進一步研究沙門菌與宿主的相互關系，不僅有助于沙門菌感染的防治，還可為其他感染性疾病和腫瘤等的新藥研發(fā)提供新思路。

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關鍵詞：沙門菌 致病性 入侵 巨噬細胞