基于自然群體隨機(jī)交配的單個印跡QTL定位的初步研究

鄭珂暉 黎哲鎮(zhèn) 葉景山 周富杰 溫永仙

摘要：[目的]探索基于自然群體隨機(jī)交配的單個印跡QTL的定位方法，分析影響定位準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素。[方法]若印跡QTL決定的某一性狀為數(shù)量性狀，假設(shè)該性狀與標(biāo)記之間的關(guān)系存在線性關(guān)系，可以采用最小二乘法進(jìn)行印跡QTL定位和遺傳參數(shù)的估計(jì)。利用計(jì)算機(jī)模擬單點(diǎn)模擬標(biāo)記、水稻真實(shí)自然群體標(biāo)記進(jìn)行印跡QTL定位，比較在不同最小等位基因頻率（Minor allele frequency，MAF）、不同遺傳率、不同隨機(jī)交配輪數(shù)下的統(tǒng)計(jì)功效與參數(shù)估計(jì)精度，印跡QTL的顯著性采用F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。[結(jié)果]通過模擬研究，證明該試驗(yàn)設(shè)計(jì)對于檢測單個印跡QTL是有效的，在MAF大于5%時，印跡遺傳率大于10%時，定位與遺傳參數(shù)估計(jì)趨于無偏。[結(jié)論]采用自然群體隨機(jī)交配產(chǎn)生作圖群體，可以用來進(jìn)行單個印跡QTL的定位，定位的結(jié)果較好，是一種有效的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，為下一步進(jìn)行多個印跡QTL奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：自然群體;關(guān)聯(lián)分析;F檢驗(yàn);印跡QTL;隨機(jī)交配

中圖分類號：Q348文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）12136407

0 引言

[研究意義]自然群體往往不是嚴(yán)格的遺傳群體，如：種質(zhì)資源、野生種等，它一般不用通過先構(gòu)建親本再進(jìn)行交配產(chǎn)生F2代以后再用自交、回交等方法來產(chǎn)生。相對于結(jié)構(gòu)群體，它的遺傳背景一般并不清晰，往往采用關(guān)聯(lián)分析來進(jìn)行QTL定位。全基因組關(guān)聯(lián)分析”’主要基于基因的連鎖不平衡，用以判斷表型性狀與遺傳標(biāo)記之間的關(guān)聯(lián)性。在全基因組上對逐點(diǎn)掃描遺傳標(biāo)記，依次判斷每個標(biāo)記與相關(guān)表型性狀的關(guān)聯(lián)水平。關(guān)聯(lián)分析方法出現(xiàn)以后，有力地推動了數(shù)量遺傳學(xué)的發(fā)展，對于水稻、玉米等作物以及豬、牛等家畜的育種改良起了重要的推動作用。印跡效應(yīng)是一種表觀遺傳效應(yīng)，指的是由于親本產(chǎn)生的配子根據(jù)其來源父本或母本，使得配子中某些基因呈現(xiàn)特異的表達(dá)或沉默，造成子代體細(xì)胞中某些等位基因表達(dá)活性不同的現(xiàn)象。印跡在某些植物的胚乳形成、哺乳動物的胚胎發(fā)育、人類的一些罕見疾病的形成中起著重要的作用。[前人研究進(jìn)展]由于全基因組數(shù)據(jù)往往十分龐大，關(guān)聯(lián)分析對計(jì)算的要求較高。為了簡化計(jì)算，早期研究人員進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析時往往將只考慮加性效應(yīng)，而忽略顯性與印跡等效應(yīng)。近些年來，有部分研究人員將印跡效應(yīng)引入到全基因組關(guān)聯(lián)分析中。Marcos等采用SNP作為遺傳標(biāo)記，采用回歸方法來定位與豬背膘、日增重等性狀相關(guān)聯(lián)的SNP，并估計(jì)加性、顯性和印跡3種遺傳效應(yīng)值。Hu等采用GWAS技術(shù)分析了印跡基因組對小鼠BMI指數(shù)的影響，研究表明印跡可以世代傳播，對小鼠的BMI指數(shù)具有一定的影響。Steven等通過研究發(fā)現(xiàn)：基因組印跡對在小鼠對于錐蟲的抗性具有重要的作用，并在小鼠染色體上定位到了與錐蟲抗性相關(guān)的3個印跡QTL。Wen等利用永久F2群體來進(jìn)行印跡QTL定位，可以無偏估計(jì)印跡QTL位置和加性、顯性和印跡3種遺傳效應(yīng)。[本研究切入點(diǎn)]自然群體的構(gòu)建需要花費(fèi)大量的人力與物力，若將自然群體隨機(jī)交配產(chǎn)生后代，則相對可以用較低廉的價格獲得遺傳信息豐富的群體。目前，基于自然群體隨機(jī)交配的方法來定位印跡QTL目前尚未見到報(bào)道。由于基因組印跡具有親本特異的特點(diǎn)，所以，在進(jìn)行印跡QTL定位時，需要知道某個株系的父本或母本。直接采用自然群體不能夠直接進(jìn)行印跡QTL的定位，但可以將自然群體作為初始群體，進(jìn)行隨機(jī)交配，產(chǎn)生F2群體，可以用較小的初始群體來獲得一個大的F2群體，該群體包含的遺傳重組事件較為豐富，可以用作印跡QTL定位。[擬解決的關(guān)鍵問題]建立性狀與加性、顯性、印跡關(guān)系的遺傳模型、給出單個印跡QTL定位與印跡QTL顯著性檢驗(yàn)的方法。

1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

假設(shè)有1個已知標(biāo)記基因型的自然群體，將自然群體植株間進(jìn)行隨機(jī)交配產(chǎn)生隨機(jī)交配群體，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，調(diào)查二倍體植株性狀表型值，生成隨機(jī)交配群體如圖1所示。

2 遺傳模型與定位方法

假設(shè)基因組上某個位置上存在與表型性狀關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，這個位點(diǎn)控制某個性狀，那么我們可以定義下列遺傳模型：

我們可以推導(dǎo)出，它的理論均值為：

等位基因替代效應(yīng)的平均效應(yīng)（the average effectof allele substitution）可以通過式4計(jì)算得到：

3 單標(biāo)記印跡QTL定位方法

假設(shè)有一個自然群體進(jìn)行隨機(jī)交配后，產(chǎn)生了個體數(shù)目為n的群體，為此我們建立了以下線性模型

為了簡單起見，本研究采取單標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析，采用最小二乘法回歸分析，對基因組上的標(biāo)記進(jìn)行逐點(diǎn)掃描，對于式9，我們提出假設(shè)H：a=d=h=0，其備擇假設(shè)H：a，d和h不全為零。若僅檢驗(yàn)印跡效應(yīng)，我們提出假設(shè)Ho：h=0，其備擇假設(shè)H：h≠0，我們采用F檢驗(yàn)來檢測標(biāo)記的顯著性，因?yàn)槭菃蝹€標(biāo)記的檢驗(yàn)，直接用0.05或0.01下的F臨界值進(jìn)行判斷。由于這里有3種遺傳效應(yīng)，那么顯然的，如果：

對于給點(diǎn)的顯著性水平，可以構(gòu)建統(tǒng)計(jì)量，該統(tǒng)計(jì)量服從F（P，n-p-1）的F分布，則有式10。

式中，RSS代表隨機(jī)殘差平方和，ESS為回歸平方和，n為樣本數(shù)，p為變量個數(shù)，此處取值為3。如果方程總體通過了顯著性檢驗(yàn)以后，再逐個對x、z、t做t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)各變量是否顯著。F統(tǒng)計(jì)量與t統(tǒng)計(jì)量計(jì)算簡單，使用計(jì)算機(jī)運(yùn)算速度較快，可以逐點(diǎn)計(jì)算全基因組上每個位點(diǎn)的F值，并對每個位點(diǎn)的3種效應(yīng)估計(jì)值進(jìn)行t檢驗(yàn)，將F最大（超過臨界值，且通過t檢驗(yàn)）的點(diǎn)作為可能的印跡QTL位點(diǎn)。

4 模擬研究

為了驗(yàn)證該方法的可行性，我們采用計(jì)算機(jī)來模擬驗(yàn)證，由于本文僅是基于自然群體隨機(jī)交配的進(jìn)行印跡QTL定位方法的初步研究，目的在探討其可行性，所以進(jìn)行2個模擬：第一是采用單點(diǎn)模擬，假設(shè)已知QTL位置，僅考察其參數(shù)估計(jì)的準(zhǔn)確度和精度，及其是否達(dá)到顯著性;第二是采用實(shí)際的水稻的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行模擬，驗(yàn)證其可行性。

4.1單點(diǎn)模擬研究

由于自然群體有別于結(jié)構(gòu)群體，自然群體的遺傳結(jié)構(gòu)是不清晰的，在群體中有大量的進(jìn)化事件摻雜其中，群體結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。在群體中，等位基因A，a的基因頻率往往不是1：1，甚至有可能是很極端的，如可能在0.05以下，就是罕見變異。那么自然群體中在不同基因頻率下，基于自然群體隨機(jī)交配產(chǎn)生的群體，我們所建立的遺傳模型和提出相應(yīng)地印跡QTL檢測方法與效應(yīng)估計(jì)方法是否還能有效，我們通過模擬來進(jìn)行檢驗(yàn)。在這里，僅考察所建立的遺傳模型在不同的MAF下相應(yīng)地參數(shù)估計(jì)和顯著檢驗(yàn)方法是否可行。

我們假定僅有單點(diǎn)標(biāo)記，在遺傳模型中

y=u+ax+dz+ht+ε i=1，2，…，n （11）

進(jìn)行參數(shù)估計(jì)，在此基礎(chǔ)上，首先我們對方程進(jìn)行F檢驗(yàn)，看其是否存在QTL（a，d和h不全為零），在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對印跡效應(yīng)做顯著性檢驗(yàn)（h≠0）。

根據(jù)式9可以計(jì)算出印跡效應(yīng)的大小如式12所示。

再計(jì)算環(huán)境方差，最終產(chǎn)生表型值，這樣就可以考慮遺傳率的不同，隨機(jī)交配次數(shù)不同的功效，參數(shù)估計(jì)等。

文獻(xiàn)[18]根據(jù)印跡與加性、顯性的關(guān)系將它們分成5種印跡類型，如表2所示。

對這5種類型的iQTL進(jìn)行模擬定位并對模擬結(jié)果進(jìn)行討論，由于在GWAS研究中，研究人員關(guān)心的往往是MAF大于0.05的這部分標(biāo)記，所以，將MAF，即p設(shè)置0.05、0.1兩種情況，設(shè)q=1-p，常數(shù)C取4、10兩種情況，iQTL的遺傳率設(shè)置為5%、10%、15%三個水平，印跡效應(yīng)根據(jù)式12進(jìn)行推算。根據(jù)表2中的5種印跡類型得出a、d的值。假設(shè)自然群體作為初始群體，包含100個株系，利用該自然群體進(jìn)行隨機(jī)交配6、20輪產(chǎn)生F2群體。每種情況重復(fù)100次，100次參數(shù)估計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)誤偏差提供了參數(shù)估計(jì)誤差標(biāo)準(zhǔn)，顯著性水平取為0.05，限于篇幅，此處僅列出C=10，交配20輪的結(jié)果，結(jié)果見表3。

結(jié)果表明：在MAF較小，為0.05時，即使iQTL的遺傳率達(dá)到15%，其檢測功效和參數(shù)估計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)誤都較高，當(dāng)MAF達(dá)到0.1以上時，其檢測功效就較高了;隨著MAF的增大，遺傳率的增加，其估計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)誤逐漸減小。在和遺傳率相同的條件下，隨著C值的增加，其參數(shù)估計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)誤也增加，其原因還有待于進(jìn)一步的研究。即使在MAF高于0.05時，當(dāng)遺傳率為5%時，效應(yīng)值估計(jì)有一定的誤差，檢測功效也較低，當(dāng)遺傳率在10%以上的時候，效應(yīng)估計(jì)就較為精準(zhǔn)。所以可以看出基因頻率和遺傳率是影響iQTL定位效果的因素。此外，隨著交配次數(shù)的增加，iQTL的檢測功效隨之增加，參數(shù)估計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)誤隨之減少，從5種iQTL來看，PEP、PEM、DIPOD、DIPUD在MAF、遺傳率、C值相同的情況下，其iQTL檢測效果相似，然而DIB的iQTL檢測效果略差些，這說明加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)影響了iQTL定位。

綜上所述，如果某個性狀的表型值由一個iQTL確定，那么不論它是上述五種類型中的哪種類型，只要在MAF大于0.1且遺傳率大于10%時，其檢測功效均較好，說明我們的提出的方法在自然群體隨機(jī)交配產(chǎn)生的F2群體上定位單個iQTL是有效的。

4.2 基于水稻基因型數(shù)據(jù)單個位點(diǎn)的模擬研究

為了驗(yàn)證該方法在實(shí)際中的實(shí)施情況，我們采用韓斌院士課題組發(fā)布的水稻自然群體的數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集收集了960多種水稻種質(zhì)資源。為了簡化研究的問題，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行了預(yù)處理，把其中粳稻的254個株系取出，并將MAF小于0.05的SNP位點(diǎn)去掉，并去除了所有的缺失位點(diǎn)，最終得到了一個包含16382個SNP，在本模擬中，假定這些SNP是等間距分布在一條染色體上，每個SNP間的距離為1kb，254個株系的數(shù)據(jù)集作為原始群體。原始群體采用隨機(jī)交配的方式生成隨機(jī)交配群體，在進(jìn)行模擬前，統(tǒng)計(jì)各個位點(diǎn)的SNP頻率。從圖2可知，在自然群體中，每個位置上的SNP的MAF并不是均衡的。

假定一個位于470kb位置的這個SNP與某個表型性狀關(guān)聯(lián)，群體均值為u=10。模擬前，先計(jì)算該位點(diǎn)的SNP頻率p和g，印跡效應(yīng)根據(jù)公式12進(jìn)行推算（C值取2，4，6三種組合）。根據(jù)表2中的5種印跡類型得出a，d的值，根據(jù)前面的模擬結(jié)果，iQTL的遺傳力水平設(shè)置為10%和15%，利用自然群體進(jìn)行3、5、7次隨機(jī)交配，產(chǎn)生隨機(jī)交配群體。每種模擬情況重復(fù)100次，100次參數(shù)估計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)誤偏差提供了參數(shù)估計(jì)誤差標(biāo)準(zhǔn)，閾值可用Bonferroni校正，顯著性水平為0.05。此處，限于篇幅，僅列出C值取2、6，交配輪數(shù)為7次的結(jié)果，見表4，交配以后得到的隨機(jī)交配群體中470kb處的SNP的頻率p為0.54，則q為0.46，接近于1：1。由于在模擬時選擇的iQTL位置上的MAF接近于0.5，從真實(shí)數(shù)據(jù)的模擬結(jié)果來看：當(dāng)遺傳率為10%、15%時，5種類型的iQTL定位都具有較好的結(jié)果，iQTL所在位置的估計(jì)較為準(zhǔn)確，各參數(shù)估計(jì)的準(zhǔn)確度和精度達(dá)到較好的效果，而且檢測功效也較高，在15%時所有類型的iQTL檢測功效均為100%。結(jié)果表明，隨著交配次數(shù)的增加，參數(shù)估計(jì)的精度也得到提高，這符合我們的構(gòu)想，當(dāng)樣本量增加時，其估計(jì)的準(zhǔn)確度和精度得到提高;對于常數(shù)C值，從表可以看出，隨著C值的增加，其參數(shù)估計(jì)的精度逐漸下降，其原因還有待于進(jìn)一步研究;從5種類型的印跡QTL來看，在相同的條件下，DIB的檢測功效較差，而其余4種DIPOD，DIPUD，PEM，PEP檢測的功效相近，由此可見：加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)對iQTL的檢測具有一定的影響。

5 討論

我們提出了基于自然群體隨機(jī)交配產(chǎn)生的F2群體進(jìn)行iQTL定位的思想，構(gòu)建其初步的定位方法，通過單點(diǎn)模擬，全基因組的單點(diǎn)模擬說明基于自然群體隨機(jī)交配產(chǎn)生的群體進(jìn)行iQTL定位是可行的，當(dāng)然這里沒有考慮其他因素（如群體結(jié)構(gòu)等）的干擾。模擬表明，在不考慮其他因素的影響下，該iQTL定位方法的檢測功效，以及參數(shù)估計(jì)的準(zhǔn)確度和精度都較好。

雖然自然群體的群體遺傳結(jié)構(gòu)不清晰，但在GWAS時代，測序成本不斷降低，甚至可以直接對個體進(jìn)行測序。所以，基因型頻率可以看成已知的，基于自然群體隨機(jī)交配產(chǎn)生的群體，只要交配次數(shù)足夠，就可以產(chǎn)生較大的樣本;從初步研究模擬也可以看出，隨著交配次數(shù)的增加，其檢測功效，參數(shù)估計(jì)的精度也增加。

在全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）中，是以長期重組后保留下來的基因或位點(diǎn)間連鎖不平衡為基礎(chǔ)，在獲得群體表型數(shù)據(jù)和基因型數(shù)據(jù)后，采用統(tǒng)計(jì)方法檢測標(biāo)記與性狀之間關(guān)聯(lián)的分析方法，一般以自然群體或種質(zhì)資源為研究材料，遺傳結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。在進(jìn)行GWAS時，要求遺傳背景一致或者相似的群體，但在未知群體結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)分析研究中，由不同亞群引起的MAF的差異會造成假關(guān)聯(lián)。通常采用基因組控制、基于家系的關(guān)聯(lián)分析檢驗(yàn)和主成分分析等方法控制。一般而言：基于自然群體隨機(jī)交配產(chǎn)生的群體會產(chǎn)生結(jié)構(gòu)分層，所以在這種情況下，必須要控制因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)分層造成的假關(guān)聯(lián)，在后續(xù)的工作中，可以利用混合線性模型，傳遞不平衡分析等其他方法來進(jìn)行印跡QTL定位方法的研究。