GC-MS/MS法同時測定白芍、黃芪、貓爪草和山茱萸中69種農(nóng)藥的殘留量

王倩 朱艷春 李婷婷 樊磊磊 李振國 王雪芹

中圖分類號 R282.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）20-2829-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.18

摘 要 目的：建立同時測定白芍、黃芪、貓爪草和山茱萸中69種農(nóng)藥殘留量的方法。方法：采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。色譜柱為HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度為240 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，不分流進(jìn)樣，載氣為高純氦氣，進(jìn)樣口模式為恒壓模式，柱前壓力為146 kPa，程序升溫;質(zhì)譜儀為三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，離子源為電子轟擊源，離子源溫度為230 ℃，離子化能量為70 eV，碰撞氣為氮?dú)?，質(zhì)譜傳輸接口溫度為280 ℃，四級桿溫度為150 ℃，監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），溶劑延遲時間為5 min。結(jié)果：69種農(nóng)藥殘留的檢測質(zhì)量濃度線性范圍為4.82～399.6 ng/mL（r均大于0.990）;定量限為0.001 7～0.013 3 mg/kg，檢出限為0.000 5～0.004 mg/kg;精密度、穩(wěn)定性試驗的RSD均小于10%（n=6），重復(fù)性試驗的RSD均小于5%（n=6;僅檢出殺蟲脒、氯菊酯）;加樣回收率為62.9%～123.5%（RSD均小于10%，n=6）。12批樣品中，山茱萸中檢出敵敵畏、二苯胺，黃芪中檢出殺蟲脒、氯菊酯，白芍中檢出二苯胺、殺蟲脒，貓爪草中檢出二苯胺、乙烯菌核利，其他成分均未檢出。結(jié)論：該方法操作簡便、重復(fù)性好，可用于同時測定白芍、黃芪、貓爪草和山茱萸中69種農(nóng)藥的殘留量。

關(guān)鍵詞 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;白芍;黃芪;貓爪草;山茱萸;農(nóng)藥殘留量

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of 69 kinds of pesticide residues in Paeonia tactilora， Astragalus membranaceus， Ranunculus ternatus and Cornus officinalis. METHODS： GC-MS/MS method was adopted. The determination was performed on HP-5MS fused silica capillary column with splitless injecting samples. The injector temperature was set at 240 ℃， and sample size was 1 μL. The carrier gas was high-purity helium， the inlet mode was constant pressure， the pre-column pressure was 146 kPa， and the temperature was programmed. Triple four-pole tandem mass spectrometry was used for the detection， and electron impact ion source was used as ion source. The temperature of the ion source was 230 ℃， ionization energy was 70 eV， and the collision gas was nitrogen. The inlet temperature was 280 ℃ and four-pole temperature was 150 ℃， mass spectrometry monitoring mode was multi-reaction monitoring （MRM）， and solvent delay time was 5 min. RESULTS： The linear range of 69 kinds of pesticide residue was 4.82-399.6 ng/mL （all r>0.990）. LODs were all in the range of 0.001 7-0.013 3 mg/kg， and LOQs were all in the range of 0.000 5-0.004 mg/kg. RSDs of precision and stability tests were less than 10% （n=6）. RSD of reproducibility test was lower than 5% （n=6， only pesticide amidine and permethrin were detected）. The recoveries were in the range of 62.9%-123.5% （all RSD<10%， n=6）. Among 12 batches of samples， dichlorvos and diphenylamine were detected in C. officinalis; chlordimeform and permethrin were detected in? A. membranaceus; diphenylamine and chlordimeform were detected in P. tactilora; diphenylamine and vinclozolin were detected in R. ternatus. CONCLUSIONS： The method is simple in operation and reproducible for simultaneous determination of 69 kinds of pesticide residue in? ?P. tactilora， A. membranaceus， R. ternatus and C. officinalis.

KEYWORDS? ?GC-MS/MS; Paeonia tactilora; Astragalus membranaceus; Ranunculus ternatus; Cornus officinalis; Pesticide residues

中藥作為我國傳統(tǒng)藥物，在預(yù)防和治療疾病方面的作用是不可替代的，如白芍具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗類風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、保護(hù)神經(jīng)等作用[1-2];黃芪具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、強(qiáng)心、降壓、降血糖、利尿、抗衰老、抗腫瘤、抗疲勞、抗病毒等作用;是常用的補(bǔ)中益氣、藥食兩用的中藥材[3-4]，貓爪草具有抗結(jié)核、抗腫瘤、抗炎、治療瘧疾、增強(qiáng)免疫等作用[5-6];山茱萸具有抗炎、抑菌、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、降血糖、抗休克等作用，也是常用中成藥“六味地黃丸”和“桃豆地黃湯”等的原料[7-8]。隨著這幾種中藥需求量的增長[4，8-10]，其質(zhì)量問題也日益受到關(guān)注[11]。大部分的中藥材屬植物，而農(nóng)藥是中藥材最直接的污染物[12]，其主要來源于人工噴灑、環(huán)境殘留、存儲運(yùn)輸及生產(chǎn)制備等過程中[11，13]。若藥材被農(nóng)藥污染，會嚴(yán)重危害人體健康，如有機(jī)氯農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物具有神經(jīng)毒性和致癌、致畸作用，進(jìn)入人體后可誘發(fā)肝、腎疾病等[16-17] 。因此，檢測中藥材的農(nóng)藥殘留量具有重要意義。

目前，雖然已有相關(guān)文獻(xiàn)對中藥材的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行了檢測，例如沈旭等[17]采用基質(zhì)固相分散-氣相色譜法對黃芪中20種農(nóng)藥進(jìn)行了檢測;譚鵬等[18]采用三重四級桿氣相-質(zhì)譜聯(lián)用法同時測定知母中58種農(nóng)藥殘留;馬臨科等[19]采用高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法測定浙貝母中12種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留;李雯婷等[20]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定丹參中139種農(nóng)藥殘留;盧曉林等[21]采用氣相色譜法測定甘草中9種有機(jī)磷殘留的含量。但這些研究檢驗的藥材樣品種類均較單一。為提高檢測效率、節(jié)約檢測時間和成本，同時結(jié)合目前農(nóng)藥檢測的現(xiàn)狀，本研究選取了目前中藥市場上需求量較大的白芍、黃芪、貓爪草、山茱萸等4種中藥飲片，通過氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）同時測定上述飲片中69種農(nóng)藥的殘留量，旨在為快速、高效檢測中藥材中農(nóng)藥的殘留量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7890A-7000型GC-MS儀（包括7890A型GC儀、7000型MS儀、7693型自動進(jìn)樣器）、分散固相萃取凈化管購自美國Agilent公司;HGC-24A型氮吹儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）;3-30K型離心機(jī)（德國Sigma公司）;Multi-Tube Vortexer VX-Ⅱ型振蕩器（北京踏錦科技有限公司）;XPE205型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）;Milli-Q超純水機(jī)（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

敵敵畏、二苯胺、殺蟲脒、氟樂靈、氯硝胺、特丁硫磷、毒死蜱、甲基毒死蜱、乙烯菌核利、甲基對硫磷、皮蠅磷、八氯二丙醚、苯氟磺胺、氯酞酸二甲酯、三唑酮、三氯殺螨醇、仲丁靈、溴硫磷、二甲戊樂靈、氟蟲腈、腐霉利、三唑醇、哌草丹、乙基溴硫磷、氟節(jié)胺、溴蟲腈、除草醚、溴螨酯（農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品混合貯備液A，批號：06031627），α-硫丹、β-硫丹、硫丹硫酸鹽、o，p′-滴滴伊、o，p′-滴滴滴、o，p′-滴滴涕、p，p′-滴滴伊、p，p′-滴滴滴、p，p′-滴滴涕、四氯硝基苯、α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、六氯苯、五氯硝基苯、甲氧滴滴涕、滅蟻靈、七氯、艾氏劑、狄氏劑、異狄氏劑、順式環(huán)氧七氯、反式環(huán)氧七氯、氧化氯丹、順式氯丹混合溶液（農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品混合貯備液B，批號：06031628），五氯甲氧基苯、七氟菊酯、五氯苯胺、甲基五氯苯硫醚、殺螟硫磷、聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、苯醚菊酯、氟丙菊酯、氯氟氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯混合溶液（農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品混合貯備液C，批號：06031629）均由北京曼哈格生物科技有限公司提供，所含農(nóng)藥成分質(zhì)量濃度均為100 μg/mL;乙腈為色譜純，冰醋酸、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

白芍飲片（批號：20160605、20160606）、黃芪飲片（批號：20151009、20151021、20151027、20151112、20151122、20151125）、貓爪草飲片（批號：20160203、20160215）、山茱萸飲片（批號：20151103、20151124）均由河南省食品藥品檢驗所提供，經(jīng)河南省食品藥品檢驗所雷留成主任藥師鑒定分別為毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根、豆科植物蒙古黃芪[Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus（Bge.）Hsiao]的干燥根、毛茛科植物小毛茛（Ranunculus ternatus Thunb.）的干燥塊根、山茱萸科植物山茱萸（Cornus officinalis Sieb. et Zucc.）的干燥成熟果肉。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱（60 m×0.32 mm，0.25 μm）;進(jìn)樣口溫度：240 ℃;進(jìn)樣量：1 μL，不分流進(jìn)樣;載氣：高純氦氣;進(jìn)樣口模式：恒壓模式;柱前壓力：146 kPa;程序升溫：初始溫度70 ℃，保持2 min，以15 ℃/min升溫到150 ℃，再以2 ℃/min升溫到200 ℃，最后以5 ℃/min升溫到280 ℃，保持10 min。

2.1.2 質(zhì)譜條件 以三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。離子源：電子轟擊源（EI）;離子源溫度：230 ℃;離子化能量：70 eV;碰撞氣：氮?dú)?質(zhì)譜傳輸接口溫度：280 ℃;四級桿溫度：150 ℃;質(zhì)譜監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）;溶劑延遲時間：5 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 系列混合對照品溶液 分別精密量取農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品混合貯備液A、B、C各1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加含有0.05%醋酸的乙腈溶液定容，制成各農(nóng)藥成分質(zhì)量濃度均為10 μg/mL的混合對照品貯備液。取上述混合對照品貯備液適量，加含有0.05%醋酸的乙腈溶液稀釋制得各農(nóng)藥成分質(zhì)量濃度均分別為5、10、50、100、200、400 ng/mL的混合溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得系列混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 分別取4種藥材樣品各適量，粉碎，過3號篩，取粉末約3 g，精密稱定，置于50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加1%冰醋酸溶液15 mL，渦旋使粉末充分浸潤;放置30 min后，精密加入乙腈15 mL，渦旋使混勻，置于振蕩器中劇烈振蕩（500次/min）5 min，然后加入無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末（4 ∶ 1，m/m）7.5 g，立即搖散，再置于振蕩器中劇烈振蕩（500次/min）3 min;冷卻至室溫，以4 000 r/min離心5 min，取上清液9 mL，加入裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管（含無水硫酸鎂900 mg、N-丙基乙二胺300 mg、十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg、硅膠300 mg、石墨化炭黑90 mg）中，渦旋混勻，置于振蕩器中劇烈振蕩（500次/min）5 min使凈化完全;以4 000 r/min離心5 min，精密吸取上清液5 mL，置于氮吹儀中在40 ℃條件下濃縮至0.4 mL;加入乙腈定容至1 mL，渦旋混勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 69種農(nóng)藥的總離子流圖和檢測參數(shù)

取“2.2.1”項下混合對照品溶液（各成分質(zhì)量濃度均為100 ng/mL）適量，按“2.1”項下試驗條件進(jìn)行分析。結(jié)果，69種農(nóng)藥均能良好地分離。69種農(nóng)藥的總離子流圖見圖1，其檢測參數(shù)見表1。

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項下系列混合對照品溶液各1.0 μL，按“2.1”項下試驗條件進(jìn)行分析，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，69種農(nóng)藥質(zhì)量濃度在4.82～399.6 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好（r均大于 0.990），詳見表2。

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液（各成分質(zhì)量濃度均為100 ng/mL）適量，加入未檢出農(nóng)藥殘留的陰性樣品（批號：20151122）倍比稀釋，按“2.1”項下試驗條件進(jìn)行分析，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計算定量限、檢測限。結(jié)果，69種農(nóng)藥的定量限為0.001 7～0.013 3 mg/kg，檢出限為0.000 5～0.004 mg/kg。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液（各成分質(zhì)量濃度均為100 ng/mL）適量，按“2.1”項下試驗條件連續(xù)測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，69種農(nóng)藥峰面積的RSD均小于10%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液（各成分質(zhì)量濃度均為100 ng/mL）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、6、8、12 h時，按“2.1”項下試驗條件進(jìn)行分析，記錄峰面積。結(jié)果，69種農(nóng)藥峰面積的RSD均小于10%（n=7），表明其在室溫下放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

取黃芪樣品（批號：20151009），粉碎，過3號篩，取3.0 g，共6份，精密稱定，按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進(jìn)行分析，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算含量。結(jié)果，69種農(nóng)藥中殺蟲脒的平均含量為0.017 1 mg/kg，氯菊酯的平均含量為0.117 4 mg/kg，RSD均小于5%（n=6），其他成分均未檢出，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取黃芪樣品（批號：20151009），粉碎，過3號篩，取3.0 g，共6份，精密稱定，加入“2.2.1”項下混合對照品溶液（各成分質(zhì)量濃度均為100 μg/mL）0.05 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進(jìn)行分析，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.10 樣品中農(nóng)藥殘留量測定

取12批藥材樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進(jìn)行分析，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算69種農(nóng)藥的殘留量，結(jié)果見表4（只檢出5種農(nóng)藥殘留，其他未檢出）。

3 討論

目前分析農(nóng)藥殘留量的常用提取溶劑有乙腈、丙酮、甲醇等，由于乙腈對油脂和色素提取較少，在有機(jī)磷、有機(jī)氯、氨基甲酸酯類農(nóng)藥的分析中常被采用，可同時提取多種農(nóng)藥殘留，操作簡單[19，22-23]。綜合考慮，選擇乙腈為提取溶劑。

由于待測成分為農(nóng)藥，為減少其對離子源和燈絲的污染，故本研究采用溶劑截留的方式截留溶劑峰。同時，本研究對質(zhì)量濃度適宜的混合對照品溶液采用全掃描模式進(jìn)行掃描，并通過檢索譜庫，確定了各待測成分的出峰時間、特征離子及溶劑峰的出峰時間。此外，還根據(jù)確定的各種參數(shù)，設(shè)定溶劑延遲時間為5 min，采用時間分段、MRM同步監(jiān)測，結(jié)果得到的色譜峰相應(yīng)信號和峰形均較好。

含量測定結(jié)果顯示，12批樣品中山茱萸中檢出敵敵畏、二苯胺，黃芪中檢出殺蟲脒、氯菊酯，白芍中檢出二苯胺、殺蟲脒，貓爪草中檢出二苯胺、乙烯菌核利，其他成分均未檢出。

農(nóng)藥殘留量是評價中藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)，目前我國對中藥材農(nóng)藥殘留的分析技術(shù)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)都相對落后，因此建立一種簡單、快速、高效的檢測方法是同時檢測多種中藥材中農(nóng)藥殘留的發(fā)展趨勢[18，24]。本研究建立的方法操作簡便，重復(fù)性較好，適用于同時測定多種中藥材、飲片及制劑中的農(nóng)藥殘留量，可為國家藥監(jiān)部門對農(nóng)藥殘留量的監(jiān)管工作提供技術(shù)和數(shù)據(jù)參考。

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（收稿日期：2019-06-18 修回日期：2019-08-20）

（編輯：陳 宏）