UPLC-MS測定千金子提取物的活性成分及其抗氧化性研究

郭高平

摘 要：目的：鑒定千金子乙醇提取物化學(xué)組成，探究其抗氧化活性，篩選活性化合物。方法：基于超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-TOF-MS），數(shù)據(jù)庫檢索和文獻比對等手段對其活性成分進行分析;采用DPPH和ABTS自由基清除法、β-胡蘿卜素漂白法對提取物進行抗氧化活性評價。結(jié)果：共鑒定出17個化合物，包括青蒿亭、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷、蔓荊子黃酮4個黃酮類化合物，瑞香素和雙七葉內(nèi)酯2個香豆素類化合物;千金子乙醇提取物對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力遠大于BHT;對β-胡蘿卜素的漂白作用弱于BHT。結(jié)論：千金子乙醇提取物中含有較豐富的水溶性黃酮類化合物和香豆素類化合物，表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：千金子;超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜;活性成分;抗氧化活性

千金子（Euphorbia lathyris）為大戟科植物續(xù)隨子的干燥成熟種子[1]，廣泛分布于吉林、河南、浙江、四川等省[2]，其性溫，味辛，逐水消腫、破血消癥，用于治療水腫、痰飲、積滯脹滿、二便不通、血瘀經(jīng)閉，外治頑癬、疣贅[3]。目前對千金子的研究多限于其化學(xué)成分的分離與鑒定，發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分有二萜醇及其酯類、甾醇、香豆素類、黃酮類、揮發(fā)油、脂肪油及少量其他化合物[4-7]。自由基是機體氧化反應(yīng)產(chǎn)生的有害化合物，過量的自由基對機體有損傷效應(yīng)，與炎癥、腫瘤等疾病密切相關(guān)。千金子含有二萜醇、甾醇、香豆素類和黃酮類化合物，也應(yīng)表現(xiàn)出較強的抗氧化活性[8-10]，但未見對其抗氧化活性的報道。基于此，本文利用高分辨質(zhì)譜鑒定千金子中化學(xué)成分，采用DPPH[11-12]和ABTS自由基清除法[13]，以及β-胡蘿卜素漂白法[14-15]對千金子乙醇提取物抗氧化活性進行測定，再篩選出抗氧化活性化合物，為千金子資源的綜合利用、深度開發(fā)提供一定的理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 試驗材料 千金子（河南禹州，中國）;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）、β-胡蘿卜素（上海阿拉丁試劑公司，中國）;2-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）（上海阿拉丁試劑公司，中國）;亞油酸（上海阿拉丁試劑公司，中國）;維生素C（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，中國）;過硫酸鉀（K2S2O8）（成都市新都區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開發(fā)區(qū)，中國）;其余試劑均為分析純。

1.1.2 試驗儀器 超高效液相色譜儀（ACQUITY UPLC I-Class）、四級桿飛行時間質(zhì)譜（Xevo G2-S QTof Mass Spectrometer，Waters公司）、UV-1800PC型紫外可見分光光度計（上海翱藝儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥材處理 600g干燥的千金子藥材粉碎，加入乙醇冷浸提取，浸泡12h后超聲30min，循環(huán)此操作3d，取上清液。重復(fù)5次合并上清液，減壓濃縮，得千金子粗提物總浸膏50g，放置于4℃的冰箱待用。

1.2.2 UPLC-MS條件

（1）色譜條件：色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1mm×50mm，1.7μm）;流動相：A，甲醇;B，0.1%（V/V）甲酸水溶液;梯度洗脫：0～3min，20%～80% A;4～11min，80%～90% A;12～15min，90%～40% A;15～17min，40%～20% A;進樣量：3μL;流速：0.3mL/min;柱溫：45℃。

（2）質(zhì)譜條件：電噴霧電離源（ESI），正離子分辨率模式;毛細管電壓：2.5kV;樣品錐孔電壓：40V;萃取錐孔電壓：50V;溫源：100℃;脫溶劑溫度：800℃;錐孔氣：50L/h;脫溶劑氣流速：800L/h。

1.3 千金子乙醇提取物的抗氧化活性研究

1.3.1 DPPH和ABTS自由基清除法

（1）參照Larrauri等[16]的方法，以BHT作為陽性對照。配置質(zhì)量濃度分別為0.004、0.006、0.008、0.010、0.015、0.020、0.040、0.060、0.080mg/mL的千金子提取物乙醇溶液。各取2mL于10mL EP管，加入2mL濃度6.086×10-5mmol/L DPPH乙醇溶液為樣品組。對照組為2mL BHT溶液和2mL DPPH的混合溶液;各組溶液混合均勻后，避光反應(yīng)30min，無水乙醇調(diào)零，于517nm下測定對照組和樣品組的吸光度。自由基清除率計算公式為式（1）：

（2）參照Tovar-Barrios[17]和李培源等[13]的方法，將等體積7.4mmol/L ABTS水溶液與2.6mmol/L K2S2O8水溶液混合，避光放置16h，得到ABTS+溶液。使用前將ABTS+溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋成工作液（在734nm下吸光度為0.70±002）。分別移取0.010、0.020、0.030、0.040mg/mL的千金子乙醇提取物溶液各1mL于EP管中，加入4mL ABTS+溶液。在1、3、5、10min時測定其吸光值。ABTS+清除率（S）計算公式為式（2）：

1.3.2 β-胡蘿卜素漂白試驗 參照陳小強[14]和詹濟華等[15]的方法，對千金子乙醇提取物對β-胡蘿卜素-亞油酸氧化體系的抑制效果進行測定。將2.5mg β-胡蘿卜素溶于5mL氯仿中，加入0.25g亞油酸及4.0g吐溫?；旌暇鶆蚝?0℃水浴除去氯仿;加入50mL熱蒸餾水，超聲震蕩配置成反應(yīng)介質(zhì)溶液。以不加β-胡蘿卜素溶液為空白調(diào)零。對照組以0.2mL乙醇和5mL反應(yīng)介質(zhì)溶液，樣品組為0.2mL樣品液和5mL反應(yīng)介質(zhì)溶液，陽性對照組為0.2mL BHT和5mL反應(yīng)介質(zhì)溶液。各組在50℃下孵育30min，于470nm處測定吸光度，每5min測定1次，直至對照組顏色完全消失?？寡趸钚杂嬎愎絒18]為式（3）：

2 結(jié)果與分析

2.1 千金子提取物液質(zhì)聯(lián)用分析條件選擇

分別采用正、負離子模式對千金子提取物進行分析，經(jīng)過流動相、色譜條件的優(yōu)化得到最佳條件，在該條件下千金子提取物中的特征峰得到了良好分離，峰型較好（圖1）。

x2.2 化合物鑒定

經(jīng)UPLC-MS分析，共檢測到39個色譜峰，依據(jù)各色譜峰的分子離子峰及主要碎片峰的解析，通過數(shù)據(jù)庫搜索、文獻對照，確定了千金子乙醇提取物中的17個化合物。從表1可以看出，千金子中含青蒿亭、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷和蔓荊子黃酮4個黃酮類化合物，瑞香素和七葉內(nèi)酯2個香豆素類化合物。上述物質(zhì)具有一定的抗氧化活性[19-20]。

2.3 DPPH和ABTS清除自由基試驗

如圖2a所示，隨著千金子乙醇提取物濃度的增加，DPPH清除率逐漸升高，當濃度大于0.020mg/mL時，清除率可達90%以上。通過描點法測得千金子乙醇提取物半數(shù)清除率IC50為0.012mg/mL，BHT的半數(shù)清除率為0.016mg/mL。表明千金子乙醇總提取物的活性優(yōu)于BHT。當千金子提取物濃度從0.01mg/mL增加至0.04mg/mL時，ABTS自由基清除率從32%增加至95%以上（圖2b），而BHT對ABTS自由基的清除率從5%增加至42%（圖2c）。上述結(jié)果說明在相同濃度下千金子提取物抗氧化能力遠優(yōu)于BHT。

圖2 a DPPH反應(yīng)體系中千金子提取物變化曲線;b DPPH反應(yīng)體系中BHT的標準曲線;c ABTS反應(yīng)體系中千金子提取物;d BHT抗氧化性比較

2.4 β-胡蘿卜素漂白試驗

如圖3所示，無論加入千金子乙醇提取物，還是BHT，隨著反應(yīng)的進行，溶液吸光度逐漸減小，直至消失。2.0mg/mL的千金子乙醇提取物和BHT的抗氧化活性分別為5.15%和12.22%，這說明千金子乙醇提取物的抗氧化活性要弱于BHT。結(jié)合清除自由基試驗結(jié)果，說明千金子乙醇提取物中具有抗氧化活性的組分多為水溶性化合物[21]。

3 結(jié)論

本文對千金子乙醇提取物采用UPLC-TOF-MS，共鑒定包括4個黃酮類化合物（青蒿亭、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷、蔓荊子黃酮）和2個香豆素類化合物（瑞香素和雙七葉內(nèi)酯）在內(nèi)的17個化合物?？寡趸钚栽囼灲Y(jié)果表明，千金子乙醇提取物對DPPH和ABTS自由基的清除率優(yōu)于BHT，對β-胡蘿卜素的漂白能力次于BHT。這與千金子中含有較多水溶性的黃酮類和香豆素類化合物直接相關(guān)。UPLC-TOF-MS鑒定結(jié)果也驗證了該結(jié)論的可靠性。本研究可為千金子中天然抗氧化劑的開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)?！?/p>

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