青風(fēng)藤堿血藥濃度測(cè)定及其在家兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究

朱麗媛 彭朝蕊 趙遠(yuǎn)翠 劉云寬 馬云淑

中圖分類號(hào) R969.1;R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）20-2767-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.07

摘 要 目的：建立檢測(cè)家兔血漿中青風(fēng)藤堿濃度的方法，并進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究。方法：將家兔按性別分組，每組6只。所有家兔均于耳緣靜脈單次注射青風(fēng)藤堿藥液（5 mg/kg），分別于給藥前及給藥后5、10、15、30、45、60、90、120、180、240 min時(shí)于其耳緣靜脈取血1 mL，分離血漿，用乙酸乙酯萃取后，以青藤堿為內(nèi)標(biāo)，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定。色譜柱為Agilent Zorbax Extend-C18，流動(dòng)相為甲醇-2 mmol/L磷酸氫二鈉水溶液（含0.016%三乙胺，pH為9.8）（45 ∶ 55，V/V），流速為1 mL/min，檢測(cè)波長為262 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。采用DAS 3.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，采用t檢驗(yàn)考察兩組的差異。結(jié)果：青風(fēng)藤堿檢測(cè)血藥濃度的線性范圍為0.1～5.0 mg/L，定量下限為0.1 mg/L，最低檢測(cè)限為0.08 mg/L;日內(nèi)、日間RSD均小于10%，準(zhǔn)確度為（99.80±8.21）%～（103.61±8.55）%，提取方法不影響待測(cè)物的定量分析。家兔靜脈單次注射青風(fēng)藤堿的平均藥-時(shí)曲線符合二室模型，所有家兔的分布半衰期為（10.99±2.52）min，消除半衰期為（147.08±32.41）min，AUC0-t為（190.82±30.82）mg·min/L，AUC0-∞為（289.82±73.27）mg·min/L;雌、雄家兔主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：本研究建立的HPLC法操作簡便、專屬性強(qiáng)、靈敏度高，可用于青風(fēng)藤堿血藥濃度的測(cè)定及藥動(dòng)學(xué)的研究。該化合物在家兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過程符合二室模型，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無性別差異，且分布迅速、消除較快。

關(guān)鍵詞 青風(fēng)藤堿;藥動(dòng)學(xué);家兔;血藥濃度;高效液相色譜法

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for concentration determination of sinoacutine in rabbit plasma， and to conduct its pharmacokinetic study. METHODS： The rabbits were grouped according to gender， 6 rabbits in each group. Rabbits were injected with sinoacutine solution （5 mg/kg） via ear vein. Each blood sample 1 mL was collected before medication and 5， 10， 15， 30， 45， 60， 90， 120， 180， 240 min after medcation. After the plasma isolated and extracted with ethyl acetate， HPLC method was adopted by using sinomenine as internal standard. The determination was performed on Agilent Zorbax Extend-C18 column with mobile phase consisted of methanol-2 mmol/L disodium hydrogen phosphate aqueous solution （containing 0.016% triethylamine， pH 9.8） （45 ∶ 55， V/V） at the flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 262 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 20 μL. The pharmacokinetic parameters were calculated by using DAS 3.0 software. The difference of 2 groups were investigated by t-test. RESULTS： The linear range of sinoacutine were 0.1-5.0 mg/L; the limit of quantitation was 0.1 mg/L， and the lowest detection limit was 0.08 mg/L. RSDs of intra-day and inter-day were both less than 10%; the accuracy ranged from （99.80±8.21）%-（103.61±8.55）%. The extraction method did not affect the quantitative analysis of the substance to be measured. The average plasma-time curve of sinomenine with single intravenous injection in rabbits was in line with the two-compartment model. The distribution half-life of all rabbits was （10.99±2.52） min， and the elimination half-life was （147.08±32.41） min. AUC0-t was （190.82±30.82）mg·min/L， and AUC0-∞ was （289.82±73.27） mg·min/L. There was no statistical significance in pharmacokinetic parameters between female and male rabbits （P>0.05）. CONCLUSIONS： Established HPLC method is simple， specific and sensitive， and can be used for plasma content determination of sinoacutine. Pharmacokinetic study shows that the pharmacokinetic process of the compound is in line with two-compartment model in rabbits. The pharmacokinetic parameters of the compound have no sex difference， and the compound is distributed rapidly and eliminated fast.

KEYWORDS? ?Sinoacutine; Pharmacokinetics; Rabbit; Plasma concentration; HPLC

青風(fēng)藤堿（Sinoacutine，結(jié)構(gòu)式見圖1A）為異喹啉類生物堿，是從防己科千金藤屬云南地不容（Stephania yunnanensis Lo）等多種植物中提取分離而得[1]。研究發(fā)現(xiàn)，青風(fēng)藤堿具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗心律失常等活性，例如青風(fēng)藤堿能明顯提高小鼠熱板痛閾和足趾電刺激痛閾，減少醋酸所致的小鼠扭體次數(shù);與戊巴比妥鈉聯(lián)用后，可增強(qiáng)后者的鎮(zhèn)靜催眠作用[2];此外，青風(fēng)藤堿還具有抗Ⅱ型膠原蛋白致大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用，并可明顯降低氯仿致小鼠室顫的發(fā)生率[3-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，青風(fēng)藤堿能明顯縮短氯化鋇致心律失常模型大鼠恢復(fù)竇性心律所需的時(shí)間。青風(fēng)藤堿的結(jié)構(gòu)與青藤堿（Sinomenine，結(jié)構(gòu)式見圖1B）極其相似，后者具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、保護(hù)受損器官及鎮(zhèn)痛等廣泛的藥理活性[5-7]。目前已有多種青藤堿制劑上市，如正清風(fēng)痛寧片/緩釋片、鹽酸青藤堿注射液等，被廣泛應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心率失常等癥的臨床治療，效果較好[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在同等劑量下，青風(fēng)藤堿對(duì)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)和c-Jun氨基末端激酶（JNK）磷酸化水平的抑制作用均強(qiáng)于青藤堿，極具開發(fā)價(jià)值;此外，有關(guān)青藤堿及其制劑的藥動(dòng)學(xué)研究報(bào)道較多[9-12]，而青風(fēng)藤堿藥動(dòng)學(xué)的相關(guān)研究則較少。鑒于此，本研究通過建立檢測(cè)家兔血漿樣品中青風(fēng)藤堿質(zhì)量濃度的高效液相色譜法（HPLC），對(duì)該化合物的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為進(jìn)行初步探討，旨在了解其體內(nèi)代謝特征，為青風(fēng)藤堿后續(xù)制劑的開發(fā)及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀（美國Agilent公司）;HSC-12A型氮吹儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）;TGL-16G型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）;XK96-A型快速混勻器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）;BT25S型分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司];SK3300型超聲機(jī)（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）;BE-1100型四維旋轉(zhuǎn)混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 藥品與試劑

青風(fēng)藤堿原料藥（純度：98%）、青風(fēng)藤堿對(duì)照品（純度：98%）均為本實(shí)驗(yàn)室自制;青藤堿對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110774- 201808，純度：供鑒別和含量測(cè)定用）;甲醇為色譜純，乙酸乙酯、乙胺等其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)健康家兔12只，雌雄各半，10～12周齡，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，購自昆明楚商科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滇）K2018-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇-2 mmol/L磷酸氫二鈉水溶液（含0.016%三乙胺，pH為9.8）（45 ∶ 55，V/V）;流速：1 mL/min;檢測(cè)波長：262 nm;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 青風(fēng)藤堿標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱取青風(fēng)藤堿對(duì)照品10 mg于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的對(duì)照品貯備液。取上述對(duì)照品貯備液適量，用甲醇進(jìn)一步稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、10.0、15.0、25.0、40.0、50.0 mg/L的青風(fēng)藤堿系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20 ℃下密封保存，備用。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取青藤堿對(duì)照品10 mg于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液。取上述內(nèi)標(biāo)貯備液適量，用甲醇進(jìn)一步稀釋，制成質(zhì)量濃度為100.0 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液，于-20 ℃下密封保存，備用。

2.2.3 青風(fēng)藤堿藥液 精密稱取青風(fēng)藤堿原料藥250 mg于50 mL量瓶中，加入10%檸檬酸溶液1 mL，超聲（功率：400 W，頻率：40 kHz）溶解，加生理鹽水定容，制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的青風(fēng)藤堿藥液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

2.3 血漿樣品的處理

精密吸取血漿樣品0.5 mL，加入100.0 mg/L內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，渦旋3 min，加入乙酸乙酯3 mL，渦旋3 min，使用四維旋轉(zhuǎn)混合儀萃取20 min后，以6 000 r/min離心10 min;精密吸取上清液2.4 mL，于50 ℃水浴中以氮?dú)饬鞔蹈?殘?jiān)尤爰状?50 μL復(fù)溶，渦旋3 min后，以4 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液20 μL，進(jìn)樣分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 取空白血漿、空白血漿+內(nèi)標(biāo)（100.0 mg/L）+青風(fēng)藤堿（50.0 mg/L）、雌性家兔給藥后5 min的血漿樣品各適量，按“2.3”項(xiàng)下方法處理（其中，空白血漿不加內(nèi)標(biāo)溶液）后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，各待測(cè)物的理論板數(shù)均大于4 000;內(nèi)標(biāo)與青風(fēng)藤堿的保留時(shí)間分別約為20.8、24.3 min，呈基線分離，分離度大于1.5，且血漿內(nèi)源性物質(zhì)無干擾，詳見圖2。

2.4.2 線性關(guān)系、定量下限及最低檢測(cè)限考察 精密量取家兔空白血漿450 μL，分別加入“2.2.1”項(xiàng)下青風(fēng)藤堿系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各50 μL，得質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、1.5、2.5、4.0、5.0 mg/L的青風(fēng)藤堿系列血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以待測(cè)物質(zhì)量濃度（x，mg/L）為橫坐標(biāo)、待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=0.504 5x-0.072 9（r=0.999 5）。結(jié)果，青風(fēng)藤堿檢測(cè)血藥濃度的線性范圍為0.1～5.0 mg/L，定量下限為0.1 mg/L（信噪比為10 ∶ 1）;以信噪比3 ∶ 1測(cè)得最低檢測(cè)限為0.08 mg/L。

2.4.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn) 分別按“2.4.2”項(xiàng)下方法配制定量下限質(zhì)量濃度（0.1 mg/L）血漿樣品以及低、中、高質(zhì)量濃度（0.2、2.5、4.0 mg/L，下同）的質(zhì)控樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，考察日內(nèi)精密度;連續(xù)測(cè)定3 d，考察日間精密度。同時(shí)，以實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度進(jìn)行比較，考察準(zhǔn)確度，結(jié)果見表1。

2.4.4 提取回收率試驗(yàn) 按“2.4.2”項(xiàng)下方法配制低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄青風(fēng)藤堿與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（R1）;精密量取空白血漿適量，共5份，按“2.3”項(xiàng)下“精密吸取血漿樣品0.5 mL……精密吸取上清液2.4 mL”方法處理后，加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的青風(fēng)藤堿標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，使最終質(zhì)量濃度與上述質(zhì)控樣品對(duì)應(yīng)，以氮?dú)饬鞔蹈桑瑲堅(jiān)眉状?50 μL復(fù)溶，渦旋3 min后，以4 000 r/min離心10 min，取上清液濾過后，進(jìn)樣分析，記錄青風(fēng)藤堿與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（R2）。提取回收率=（R1/R2）×100%，結(jié)果見表2。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.4.2”項(xiàng)下方法配制低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品各5份，分別于室溫放置24 h、反復(fù)凍融（-20 ℃～室溫）3次、-80 ℃放置2周后，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，以實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度的比值（即回收率）考察上述樣品的穩(wěn)定性，結(jié)果見表3。

2.5 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

將家兔按性別分組，每組6只。禁食、不禁水12 h后，于家兔耳緣靜脈單次注射“2.2.3”項(xiàng)下青風(fēng)藤堿藥液5 mg/kg[參照本課題組前期所得小鼠靜脈注射的半數(shù)致死劑量（54.319 mg/kg）并按體表面積折算法換算而得]。分別于給藥前及給藥后5、10、15、30、45、60、90、120、180、240 min時(shí)于家兔耳緣靜脈取血1 mL，置于含肝素鈉的抗凝管中，以10 000 r/min離心10 min后，分離上層血漿，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。采用內(nèi)標(biāo)法，按隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算家兔血漿中青風(fēng)藤堿的血藥濃度，并采用DAS 3.0軟件繪制平均藥-時(shí)曲線，并對(duì)上述平均藥-時(shí)曲線數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，擬合房室模型，同時(shí)計(jì)算相關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù);采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見圖3、表4。

由圖3、表4可知，家兔靜脈注射青風(fēng)藤堿后的藥-時(shí)曲線符合二室模型，不同性別家兔藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。所有家兔測(cè)得數(shù)據(jù)經(jīng)處理，t1/2α為（10.99±2.52）min，t1/2β為（147.08±32.41）min，表明青風(fēng)藤堿在家兔體內(nèi)分布迅速、消除較快（t1/2β<3 h）。

3 討論

3.1 內(nèi)標(biāo)化合物的選擇

本研究采用內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)了家兔血漿中青風(fēng)藤堿的質(zhì)量濃度。在前期內(nèi)標(biāo)化合物的篩選中，筆者以色譜峰峰形及提取回收率為指標(biāo)，對(duì)克班寧、異克利定、荷葉堿、光千金藤定堿、青藤堿等5種異喹啉類生物堿進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，上述化合物的提取回收率為67%～85%，RSD均小于15%，其中以青藤堿的提取回收率最為穩(wěn)定且相對(duì)較高;此外，青藤堿與青風(fēng)藤堿的保留時(shí)間雖較為接近，但峰形和分離度均較好，有利于縮短檢測(cè)所需時(shí)間，故最終選擇青藤堿作為內(nèi)標(biāo)。

3.2 色譜條件的優(yōu)化及血漿樣品處理方法的篩選

本研究在2015年版《中國藥典》（一部）青風(fēng)藤中青藤堿含量測(cè)定方法[13]的基礎(chǔ)上對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青風(fēng)藤堿和青藤堿對(duì)流動(dòng)相的比例和pH值非常敏感，最終本研究將色譜條件確定為甲醇-2 mmol/L磷酸氫二鈉水溶液（含0.016%三乙胺，pH為9.8）（45 ∶ 55，V/V）。在血漿樣品處理方法的篩選過程中，筆者分別嘗試了蛋白直接沉淀法和液-液萃取法，先后以甲醇、乙腈以及異丙醇、乙醚、氯仿、乙酸乙酯單獨(dú)或不同比例混合作為沉淀或萃取試劑[14-18]。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)乙酸乙酯萃取后，待測(cè)物的峰形較為理想且分離度良好，回收率相對(duì)較高且穩(wěn)定，故最終選擇乙酸乙酯作為萃取溶劑。方法學(xué)考察結(jié)果顯示，本研究所建HPLC法具有簡便、專屬性強(qiáng)和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，且提取方法不影響待測(cè)物的定量分析，符合生物樣品定量分析的相關(guān)要求[19]，可用于血漿樣品中青風(fēng)藤堿含量的測(cè)定。此外，本研究所建標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍雖然較窄（0.1～5.0 mg/L），但由于后續(xù)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)給藥劑量單一、家兔體內(nèi)血藥濃度變化亦不大，故實(shí)用性尚可。

3.3 藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果分析

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，青風(fēng)藤堿在大鼠體內(nèi)存在性別差異，故本研究比較了單次靜脈給藥后該化合物在雌、雄家兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)并無顯著差異。靜脈給藥后，青風(fēng)藤堿的平均藥-時(shí)曲線符合二室模型，t1/2α、t1/2β分別為（10.99±2.52）、（147.08±32.41）min，AUC0-t為（190.82±30.82）mg·min/L，AUC0-∞為（289.82±73.27）mg·min/L，提示青風(fēng)藤堿在家兔體內(nèi)分布迅速，且血藥濃度下降速度快。關(guān)昊等[20]以家兔為對(duì)象，考察了靜脈給予青藤堿（60 mg/kg）后的體內(nèi)代謝特征，結(jié)果顯示，青藤堿的平均藥-時(shí)曲線符合二室模型，t1/2β為55 min;李鑫等[21]按100 mg/kg的劑量對(duì)家兔灌胃青藤堿后，發(fā)現(xiàn)其平均藥-時(shí)曲線符合一室模型，tmax為（1.83±0.33）h，t1/2為（3.27±0.50）h，cmax為（2 867.5±246.76）ng/mL。上述研究提示，青藤堿在體內(nèi)的消除速度與給藥途徑、給藥劑量等密切相關(guān)。青風(fēng)藤堿與青藤堿結(jié)構(gòu)相近、理化性質(zhì)相似，適當(dāng)增加劑量、改變給藥途徑是否可延長t1/2、是否存在代謝飽和與非線性動(dòng)力學(xué)過程等，尚需后續(xù)研究深入探討。

綜上所述，本研究建立的HPLC法操作簡便、專屬性強(qiáng)、靈敏度高，可用于青風(fēng)藤堿血藥濃度測(cè)定和藥動(dòng)學(xué)研究。青風(fēng)藤堿在家兔體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過程符合二室模型，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無性別差異，具有分布迅速、消除較快的特點(diǎn)。但所建HPLC法存在分離時(shí)間較長、線性范圍較窄等不足，有待后續(xù)研究予以完善。

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（收稿日期：2019-01-21 修回日期：2019-07-14）

（編輯：張?jiān)拢?/p>