馬海治癱膠囊的HPLC指紋圖譜及其5個(gè)成分含量測(cè)定研究

劉滿(mǎn)軍 崔小敏 石會(huì)麗 王曉萍 陳志永 牛安琦 高蓉 曹小平

中圖分類(lèi)號(hào) R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）21-2980-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.21.20

摘 要 目的：建立馬海治癱膠囊的指紋圖譜，并測(cè)定其中主要成分的含量，為其制劑工藝的穩(wěn)定性及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。方法：采用Inertsil ODS-3色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm（0～23 min和31～120 min）、230 nm（23～31 min），柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min。應(yīng)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件”（2012版）建立10批馬海治癱膠囊的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，分別以對(duì)照藥材、缺味藥材陰性樣品和對(duì)照品對(duì)色譜峰進(jìn)行歸屬和指認(rèn)，并對(duì)指認(rèn)出的主要成分進(jìn)行定量分析。結(jié)果：10批樣品的相似度均在0.99以上，共確定了20個(gè)共有峰，并指認(rèn)了其中10個(gè)色譜峰。其中，1、13、14、15、16、17、18、19、20號(hào)色譜峰來(lái)源于大黃，3、4、6、7號(hào)色譜峰來(lái)源于制馬錢(qián)子，8號(hào)色譜峰來(lái)源于當(dāng)歸，2、5、9、10、11、12號(hào)色譜峰未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的藥材來(lái)源;通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)了1、4、6、7、8、16、17、18、19、20號(hào)色譜峰分別為沒(méi)食子酸、馬錢(qián)苷酸、士的寧、馬錢(qián)子堿、阿魏酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚。在對(duì)指認(rèn)出的5個(gè)主要成分（馬錢(qián)苷酸、士的寧、馬錢(qián)子堿、大黃素和大黃酚）的含量測(cè)定中，方法學(xué)考察均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，10批樣品中馬錢(qián)苷酸、士的寧、馬錢(qián)子堿、大黃素和大黃酚含量分別為2.477 1～2.785 9、1.746 1～1.946 0、1.374 6～1.505 8、1.573 2～1.824 1和0.232 1～0.261 7 mg/g。結(jié)論：建立的方法可靠、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便，可作為馬海治癱膠囊的制劑工藝與質(zhì)量監(jiān)控依據(jù)。

關(guān)鍵詞 馬海治癱膠囊;指紋圖譜;含量測(cè)定;高效液相色譜法

Study on HPLC Fingerprint and Content Determination of 5 Components in Mahai Zhitan Capsule

LIU Manjun1，CUI Xiaomin2，SHI Huili1，WANG Xiaoping1，CHEN Zhiyong2，NIU Anqi1，GAO Rong1，CAO Xiaoping1（1.Dept. of Preparation， Shaanxi Provincial Hospital of TCM， Xi’an 710003， China;2.Shaanxi Provincial Academy of TCM， Xi’an 710068， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the fingerprint of Mahai zhitan capsule， to determine the contents of main components， and to provide scientific basis for the stability and quality control of the preparation technology. METHODS： The determination was performed on Inertsil ODS-3 column with acetonitrile-0.1% phosphoric acid as mobile phase （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 250 nm （0-23 min and 31-120 min） and 230 nm （23-31 min）. The column temperature was set at 30 ℃. HPLC fingerprint for 10 batches of Mahai zhitan capsule was established by using “similarity evaluation software for chromatographic fingerprint of traditional chinese medicine” （2012 edition） and the similarity was evaluated. The chromatographic peaks were assigned and identified with reference substance， negative samples without ingredient and substance control respectively， and the identified main components were quantitatively analyzed. RESULTS： The similarity of 10 batches of sample was more than 0.99; 20 common peaks were found， and 10 common peaks were identified. Among them， No. 1，13，14，15，16，17，18，19，20 chromatographic peaks originated from Rheum palmatum; No. 3，4，6，7 chromatographic peaks originated from processed Strychnos nuxvomica; No. 8 chromatographic peaks originated from Angelica sinensis; the corresponding source of medicinal materials was not found in No. 2，5，9，10，11，12 chromatographic peaks. By comparing the reference substances， No. 1，4，6，7，8，16，17，18，19 and 20 chromatographic peaks were identified as gallic acid， loganin acid， strychnine， brucine， ferulic acid， aloe-emodin， rhein， emodin， chrysophanol and emodin methyl ether， respectively. In the determination of identified five main components （loganin， strychnine， brucine， emodin and chrysophanol）， the methodological investigation met the relevant standards. In 10 batches of samples， the contents of loganin， strychnine， brucine， emodin and chrysophanol were 2.477 1-2.785 9， 1.746 1-1.946 0， 1.374 6-1.505 8， 1.573 2-1.824 1 and 0.232 1-0.261 7 mg/g， respectively. CONCLUSIONS： The established method is reliable， accurate， stable and simple， which could provide reference for the preparation technology and quality control of Mahai zhitan capsule.

KEYWORDS Mahai zhitan capsule; Fingerprint; Content determination; HPLC

馬海治癱膠囊是本院（即陜西省中醫(yī)院）腦內(nèi)科前輩依據(jù)中醫(yī)陰陽(yáng)平衡理論創(chuàng)立的具有中醫(yī)藥特色的制劑方之一，由黃芪、大黃、制馬錢(qián)子、水蛭、當(dāng)歸、海風(fēng)藤、千年健等七味藥組成，具有益氣通絡(luò)、活血化瘀、醒腦開(kāi)竅和健肢回語(yǔ)的功效，其在臨床使用了四十余年，治療軟癱中風(fēng)病的總有效率達(dá)95%以上[1-2]。相關(guān)藥理研究也表明，馬海治癱膠囊不僅具有延長(zhǎng)小鼠缺氧存活時(shí)間、延長(zhǎng)凝血時(shí)間以及有效改善機(jī)體微循環(huán)的作用，并能顯著改善神經(jīng)功能癥狀和行為學(xué)障礙、減輕腦水腫程度、縮小腦梗死面積[3-4]。但目前，該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有大黃和黃芪的薄層鑒別[5]，無(wú)法全面控制藥品的質(zhì)量，更無(wú)法全面闡釋本制劑治療中風(fēng)疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)及其多靶點(diǎn)治療的整體性和復(fù)雜性?xún)?nèi)涵?；诖?，本研究采用高效液相色譜（HPLC）法建立馬海治癱膠囊的指紋圖譜，確認(rèn)指紋特征峰物質(zhì)，同時(shí)對(duì)方中二味君藥制馬錢(qián)子與大黃中含有的馬錢(qián)苷酸、士的寧、馬錢(qián)子堿、大黃素和大黃酚5個(gè)成分建立含量測(cè)定方法，為馬海治癱膠囊制劑工藝穩(wěn)定性考察和質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260 Infinity HPLC儀（美國(guó)Agilent公司）;KQ-100超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）;BT25S電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司，d=0.01 mg）。

1.2 藥品與試劑

10批馬海治癱膠囊均由本院制劑室制備（批號(hào)：2017060101、2017060102、2017060103、2017060104、2017060105、 2017060106、2017060107、2017060108、2017060109、2017060110，依次編號(hào)為S1～S10，規(guī)格：0.3 g/粒，每1 g中含生藥量2.91 g）;藥材黃芪、大黃、制馬錢(qián)子、水蛭、當(dāng)歸、海風(fēng)藤、千年健（陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20170101、20170203、20170206、20170210、20170311、20170306、20170216），經(jīng)陜西省中醫(yī)醫(yī)院石會(huì)麗研究員鑒定均符合藥典標(biāo)準(zhǔn);對(duì)照品馬錢(qián)苷酸（批號(hào)：MUST-18040209，純度：99.52%）、士的寧（批號(hào)：MUST-16053101，純度：99.51%）、馬錢(qián)子堿（批號(hào)：MUST-16041906，純度：99.31%）、蘆薈大黃素（批號(hào)：MUST-17030605，純度：98.65%）、大黃素（批號(hào)：MUST-16110712，純度：99.10%）、大黃素甲醚（批號(hào)：MUST-17030622，純度：99.21%）均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司;對(duì)照品阿魏酸（批號(hào)：0757-9804，純度：99.41%）、大黃酚（批號(hào)：0796-20006，純度：98.61%）、大黃酸（批號(hào)：0757-9804，純度：98.65%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;對(duì)照品沒(méi)食子酸為自制（批號(hào)：20180201，純度：99.1%）;乙腈（美國(guó)Honeywell公司，色譜純）;甲酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純）;甲醇（成都市科隆化學(xué)品有限公司，分析純）;磷酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限責(zé)任公司，分析純）;其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 馬海治癱膠囊指紋圖譜的研究

2.1.1 色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱溫為30 ℃;流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%磷酸（B）溶液，梯度洗脫（0～10 min，5%A;10～70 min，5%→30%A;70～120 min，30%→100%A）;檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm（0～23 min和31～120 min）、230 nm（23～31 min）;流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.2 溶液的制備

（1）供試品溶液的制備。取馬海治癱膠囊內(nèi)容物1.0 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL具塞三角瓶中，加75%甲醇25 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（頻率：250 W、40 kHz）30 min，放至室溫;再次稱(chēng)定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

（2）單味藥材樣品溶液的制備。分別取7種單味藥材粉末0.5 g，精密稱(chēng)定，依照“2.1.2（1）”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，制得各單味藥材樣品溶液。

（3）對(duì)照品溶液的制備。精密稱(chēng)取各對(duì)照品適量，分別置于10 mL量瓶中，用75%甲醇溶解并定容至刻度，制成每1 mL分別含沒(méi)食子酸0.80 mg、馬錢(qián)苷酸0.456 mg、士的寧0.15 mg、馬錢(qián)子堿0.15 mg、阿魏酸0.21 mg、蘆薈大黃素0.203 mg、大黃酸0.091 mg、大黃素0.475 mg、大黃酚0.36 mg和大黃素甲醚0.11 mg的單一對(duì)照品溶液。

（4）缺味藥材陰性樣品溶液的制備 ?按處方比例分別稱(chēng)取其中6味藥材，照制劑工藝制得缺味藥材陰性樣品，再按“2.1.2（1）”項(xiàng)下方法分別制得各藥材的缺味藥材陰性樣品溶液。

2.1.3 指紋圖譜建立的方法學(xué)考察

（1）精密度試驗(yàn)。精密稱(chēng)取馬海治癱膠囊（批號(hào)：2017060104）內(nèi)容物1.0 g，采用“2.1.2（1）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰19為參照峰（峰面積居中、分離度良好），計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.02%（n=6）、 相對(duì)峰面積的RSD均小于2.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

（2）重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批馬海治癱膠囊（批號(hào)：2017060104）內(nèi)容物1.0 g，精密稱(chēng)定，平行6份，采用“2.1.2（1）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰19為參照峰計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.99%（n=6）、相對(duì)峰面積的RSD均小于3.01%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一供試品溶液（樣品批號(hào)：2017060104），分別在室溫放置0、2、4、8、12、24 h后，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰19為參照峰計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.83%（n=6）、相對(duì)峰面積的RSD均小于2.02%（n=6），表明樣品溶液在室溫放置24 h穩(wěn)定。

2.1.4 HPLC指紋圖譜的建立與分析

（1）馬海治癱膠囊HPLC指紋圖譜的生成。分別按“2.1.2（1）”項(xiàng)下方法制備10批馬海治癱膠囊的供試品溶液后，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄10批馬海治癱膠囊的色譜圖。將所得圖譜文件轉(zhuǎn)換成“AIA”格式，批量導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件”（2012版）中，以S9譜圖為參照?qǐng)D譜，將時(shí)間窗設(shè)為0.3 min，采用多點(diǎn)校正法進(jìn)行色譜峰匹配，選擇中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜。對(duì)照指紋圖譜和10批馬海治癱膠囊的HPLC指紋圖譜見(jiàn)圖1。

（2）相似度評(píng)價(jià)及共有指紋圖譜的標(biāo)定。因峰19（大黃素）峰面積居中、分離度良好，因此作為參照峰，標(biāo)定20個(gè)峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積大小，并采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件”（2012版），以對(duì)照指紋圖譜R為參照，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，10批馬海治癱膠囊的相似度均大于0.99，說(shuō)明不同批次間樣品的相似度較高，其生產(chǎn)工藝相對(duì)穩(wěn)定。10批馬海治癱膠囊共有峰的相對(duì)保留時(shí)間見(jiàn)表1，相對(duì)峰面積見(jiàn)表2，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表3。

（3）共有峰的歸屬。取各單味藥材溶液、缺味藥材陰性樣品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，通過(guò)色譜峰對(duì)比，對(duì)馬海治癱膠囊指紋圖譜中20個(gè)共有峰進(jìn)行歸屬。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，馬海治癱膠囊20個(gè)共有峰中的1、13、14、15、16、17、18、19、20號(hào)色譜峰來(lái)源于大黃;3、4、6、7號(hào)色譜峰來(lái)源于制馬錢(qián)子;8號(hào)色譜峰來(lái)源于當(dāng)歸;但2、5、9、10、11、12號(hào)色譜峰沒(méi)有找到相應(yīng)的藥材來(lái)源，可能是在制劑制備過(guò)程中新產(chǎn)生的成分。各單味藥材溶液與缺味藥材藥品溶液的色譜圖見(jiàn)圖2。

（4）色譜峰的指認(rèn)。將對(duì)照品溶液按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，通過(guò)色譜峰對(duì)比，對(duì)馬海治癱膠囊中主要的共有峰進(jìn)行指認(rèn)。結(jié)果，指認(rèn)了1、4、6、7、8、16、17、18、19、20號(hào)色譜峰分別為沒(méi)食子酸、馬錢(qián)苷酸、士的寧、馬錢(qián)子堿、阿魏酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚，對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖3。

2.2 馬海治癱膠囊中5個(gè)成分的含量測(cè)定

2.2.1 溶液的制備

（1）混合對(duì)照品溶液的制備。分別取馬錢(qián)苷酸、士的寧、馬錢(qián)子堿、大黃素和大黃酚對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置于同一10 mL棕色量瓶中，用適量75%的甲醇溶解后定容至刻度，制成每1 mL含馬錢(qián)苷酸0.074 54 mg、士的寧0.120 35 mg、馬錢(qián)子堿0.106 36 mg、大黃素0.035 33 mg、大黃酚0.094 5 mg的混合對(duì)照品溶液。

（2）供試品溶液的制備。制備方法同“2.1.2（1）”項(xiàng)下。

2.2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。結(jié)果，各待測(cè)峰與相鄰峰間的分離度均大于1.5，理論板數(shù)以馬錢(qián)苷酸峰計(jì)為100 185，以士的寧峰計(jì)為56 395，以馬錢(qián)子堿峰計(jì)為111 486，以大黃素峰計(jì)為1 168 203，以大黃酚峰計(jì)為 ? 1 131 014，色譜圖見(jiàn)圖4。

2.2.3 含量測(cè)定方法學(xué)考察及結(jié)果

（1）線性關(guān)系考察。精密吸取“2.2.1（1）”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、4、8、12、16和20 μL，在“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄色譜圖并測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x， μg）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到馬錢(qián)苷酸的回歸方程為y=1 097.8x-4.714 5（r=0.999 8），士的寧的回歸方程為y=2 129.1x-35.112（r=0.999 6），馬錢(qián)子堿的回歸方程為y=1 152.5x+6.378 4（r=0.999 9），大黃素的回歸方程為y=13 070x+19.5（r=0.999 7），大黃酚的回歸方程為y=855.38x-3.030 4（r=0.999 6），表明馬錢(qián)苷酸、士的寧、馬錢(qián)子堿、大黃素和大黃酚分別在進(jìn)樣量為0.149 1～1.491、0.240 7～2.407、0.212 7～2.127、0.070 1～0.701、0.189～1.89 μg范圍內(nèi)與其各自峰面積線性關(guān)系良好。

（2）檢測(cè)限與定量限試驗(yàn)。取混合對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)謩e以信噪比（S/N）為3和10時(shí)的對(duì)照品質(zhì)量濃度為檢測(cè)限和定量限。結(jié)果，馬錢(qián)苷酸、士的寧、馬錢(qián)子堿、大黃素和大黃酚的檢測(cè)限分別為1.19×10-4、1.60×10-4、2.13×10-4、2.36×10-4、3.15×10-4 μg，定量限分別為3.58×10-4、4.81×10-4、6.38×10-4、7.07×10-4、9.45×10-4 μg。

（3）精密度試驗(yàn)。精密吸取同一混合對(duì)照品溶液10 μL，在“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得馬錢(qián)苷酸、士的寧、馬錢(qián)子堿、大黃素和大黃酚的峰面積RSD分別為1.15%、0.62%、0.89%、1.20%、1.19%（n=6），表明儀器精密度良好。

（4）重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱(chēng)取同一批馬海治癱膠囊粉末 （批號(hào)：2017060104）6份，按“2.2.1（2）”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算得馬錢(qián)苷酸、士的寧、馬錢(qián)子堿、大黃素和大黃酚的平均含量分別為2.436 2、1.925 7、1.413 2、1.667 5、0.236 5 mg/g，RSD分別為1.68%、1.35%、0.96%、1.64%、0.62%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

（5）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取“2.2.1（2）”項(xiàng)下同一供試品溶液（批號(hào)：2017060104），室溫放置0、2、4、6、8、12 h后，分別按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算得馬錢(qián)苷酸、士的寧、馬錢(qián)子堿、大黃素和大黃酚峰面積的RSD分別為0.50%、0.94%、1.81%、1.43%、0.52%（n=6），表明供試品溶液室溫放置12 h穩(wěn)定。

（6）加樣回收試驗(yàn)。精密稱(chēng)取已知含量的馬海治癱膠囊粉末（批號(hào)：2017060104） 0.5 g，共稱(chēng)取6份，置于具塞三角瓶中，分別按待測(cè)成分質(zhì)量比為1 ∶ 1的比例加入相應(yīng)對(duì)照品溶液，按“2.2.1（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液后，按“2. 1.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析，測(cè)定其含量并計(jì)算其回收率。結(jié)果，5個(gè)成分的平均回收率為98.88%～100.31%，RSD為0.71%～1.31%（n=6）?；厥章蕼y(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

（7）樣品含量測(cè)定。取10批馬海治癱膠囊樣品粉末各1.0 g，精密稱(chēng)定，按“2.2.1（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液后，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算得馬錢(qián)苷酸、士的寧、馬錢(qián)子堿、大黃素和大黃酚的含量分別為2.477 1～2.785 9、1.746 1～1.946 0、1.374 6～1.505 8、1.573 2～1.824 1和0.232 1～0.261 7 mg/g，結(jié)果見(jiàn)表5。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)選

在前期研究中，筆者參考文獻(xiàn)報(bào)道[6-8]，分別對(duì)不同色譜柱[Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]和不同流動(dòng)相系統(tǒng)（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸、乙腈-磷酸）以及不同柱溫（25、30、35 ℃）進(jìn)行了考察，結(jié)果分別以Inertsil ODS-3為色譜柱、乙腈-磷酸為流動(dòng)相系統(tǒng)以及在柱溫為30 ℃時(shí)的分離效果最好。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)和溶劑的優(yōu)選

在單一檢測(cè)波長(zhǎng)下，很難反映一個(gè)復(fù)方中藥制劑所有成分的特征，因此在本研究中選擇 DAD檢測(cè)器在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在230 nm和250 nm波長(zhǎng)下指紋圖譜的色譜峰數(shù)量最多且峰形好、峰高度合適，呈現(xiàn)良好的色譜圖，再結(jié)合參考文獻(xiàn)[9-13]反復(fù)試驗(yàn)后，摸索得此復(fù)方樣品23～31 min時(shí)間段在波長(zhǎng)230 nm下色譜峰信號(hào)更強(qiáng)，故在本研究中采用切換波長(zhǎng)法，設(shè)置23～31 min時(shí)間段的檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，其余檢測(cè)時(shí)段的波長(zhǎng)均為250 nm。在前期研究中，筆者參考文獻(xiàn)[14-16]選擇以甲醇為溶劑制備對(duì)照品溶液，但在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，士的寧和馬錢(qián)子堿在設(shè)定色譜條件下峰形分叉。根據(jù)筆者以往經(jīng)驗(yàn)，分析這可能是由于對(duì)照品溶劑甲醇與起始流動(dòng)相極性相差太大所致，改為75%甲醇后峰形即對(duì)稱(chēng)、良好，故最終以75%甲醇作為制備對(duì)照品與供試品溶液的溶劑。

3.3 指紋圖譜及含量測(cè)定分析

本研究建立的馬海治癱膠囊HPLC指紋圖譜，共得到了20個(gè)共有峰，且共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，差異較小。通過(guò)與混合對(duì)照品溶液、組方單味藥材提取溶液及缺味藥材陰性藥品溶液色譜圖的對(duì)比，最終確定了14個(gè)特征峰的藥材來(lái)源歸屬和10個(gè)特征峰的化學(xué)成分歸屬。但是海風(fēng)藤、水蛭、黃芪、千年健這四味藥材在此檢測(cè)條件下信號(hào)較弱，未發(fā)現(xiàn)其對(duì)應(yīng)的特征峰，希望在后期的研究中對(duì)此有所突破。

另外，方中馬錢(qián)子具有益氣強(qiáng)肌、扶助正氣、解毒散結(jié)、通絡(luò)化瘀的功效，主要有效成分為生物堿類(lèi)（如士的寧、馬錢(qián)子堿、馬錢(qián)苷酸等），含量為2%～5% ，其中士的寧和馬錢(qián)子堿占總生物堿的80%，既是馬錢(qián)子最主要的有效成分也是毒性成分[17]。藥理研究也顯示，馬錢(qián)子所含成分有改善微循環(huán)作用，體內(nèi)給藥后能抗血栓形成[5]。方中大黃有“滌實(shí)痰”作用，其活性成分為大黃素和大黃酚等。本研究建立了二味君藥中性質(zhì)穩(wěn)定、含量較高的馬錢(qián)苷酸、士的寧、馬錢(qián)子堿、大黃素、大黃酚的含量，經(jīng)過(guò)儀器精密度、方法重復(fù)性和穩(wěn)定性考察，表明本研究建立的馬海治癱膠囊指紋圖譜與含量測(cè)定方法重復(fù)性好，方法可靠，并可簡(jiǎn)便快速測(cè)定有效物質(zhì)的含量，可以為控制其工藝穩(wěn)定與評(píng)價(jià)質(zhì)量?jī)?yōu)劣提供有效的方法保證。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 曹胭莉，張曉樂(lè)，韓祖成，等.“剛?cè)嵯酀?jì)”聯(lián)合西醫(yī)藥綜合康復(fù)方案治療中風(fēng)病恢復(fù)期多中心隨機(jī)平行對(duì)照研究[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2015，29（10）：6-9.

[ 2 ] 李寶華，馬青云，李敬慈，等.剛?cè)嵯酀?jì)法治療中風(fēng)50例小結(jié)[J].陜西中醫(yī)，1985，6（2）：55-56.

[ 3 ] 蒙麥俠，袁秋貞，張小麗，等.馬海治癱膠囊對(duì)局灶性腦缺血大鼠的作用[J].陜西中醫(yī)，2015，36（6）：755-756.

[ 4 ] 蒙麥俠，陳志永，陳瑞明，等.馬海治癱膠囊治療腦中風(fēng)后遺癥的作用機(jī)理研究[J].四川中醫(yī)，2018，36（6）：82- 84.

[ 5 ] 蒙麥俠，陳瑞明，張紅.馬海治癱膠囊提取工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].陜西中醫(yī)，2013，34（6）：748-749.

[ 6 ] 關(guān)洪月，李林，劉曉，等.中藥指紋圖譜相似度計(jì)算方法探析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（18）：282-287.

[ 7 ] 黃杰英，郭元滿(mǎn)，高慧娟，等.愈傷靈膠囊高效液相色譜指紋圖譜研究[J].中南藥學(xué)，2018，16（7）：913-916.

[ 8 ] 唐清，朱曉梟，鄭玉瑩，等.補(bǔ)肺活血膠囊高效液相色譜指紋圖譜研究[J].中南藥學(xué)，2018，16（9）：1200-1204.

[ 9 ] 明凱利，向陽(yáng)，楊艷霞，等.小金膠囊的HPLC指紋圖譜建立及主成分分析[J].中國(guó)藥房，2019，30（2）：188-192.

[10] 曹瑞，竇志華，倪麗麗，等. HPLC指紋圖譜、Q-TOF/MS定性及多成分定量相結(jié)合的大黃飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[J].中草藥，2019，50（5）：1100-1110.

[11] 嚴(yán)維花，曹虹虹，郭爽，等.當(dāng)歸不同炮制品的UPLC指紋圖譜與多成分含量測(cè)定研究[J].中國(guó)中藥雜志，2019，44（12）：2499-2510.

[12] 溫學(xué)遜，牛研，王書(shū)芳.當(dāng)歸不同藥用部位活性成分含量的HPLC分析方法及特征圖譜研究[J].藥物分析雜志，2014，34（2）：317-324.

[13] 徐佳，楊瑤珺，劉曉帆，等.水蛭的高效液相指紋圖譜研究[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2013，6（8）：596-599.

[14] 王月輝，喬斌，蔣建蘭，等.馬錢(qián)子藥材HPLC指紋圖譜的研究[J].中草藥，2006，37（8）：1252-1255.

[15] 馬恩耀，高明，蔣麗蕓，等.嶺南特色飲片醋馬錢(qián)子炮制前后HPLC指紋圖譜研究[J].中藥材，2017，40（1）：77-80.

[16] 崔小敏，石會(huì)麗，雷琨.愈銀片的HPLC指紋圖譜研究[J].中國(guó)藥房，2017，28（3）：397-400.

[17] 況時(shí)祥，王強(qiáng)，劉琛.馬錢(qián)子治療重癥肌無(wú)力機(jī)制探討[J].上海中醫(yī)藥雜志，2015，49（5）：83-84.

（收稿日期：2019-03-21 修回日期：2019-08-12）

（編輯：林 靜）