液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定人血漿中氯吡格雷及其3種代謝產(chǎn)物的濃度

劉職瑞 姚璞 楊波 王瑜 馮偉 孫鳳軍

中圖分類號 R969.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）21-2946-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.21.14

摘 要 目的：建立同時測定人血漿中氯吡格雷（CLP）及其中間代謝產(chǎn)物2-氧-氯吡格雷（2-O-CLP）、非活性代謝產(chǎn)物氯吡格雷羧酸代謝物（CLPCA）和活性代謝產(chǎn)物氯吡格雷硫醇代謝物（CLPTM）濃度的方法。 方法：選取陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診為腦卒中的90名患者，早晨空腹口服1片氯吡格雷片（75 mg/片），于服藥2 h后采集血樣，將CLPTM經(jīng)2-溴-3’-甲氧基苯乙酮衍生形成CLPTM-D后與其余3種待測物一起通過乙腈蛋白沉淀提取后，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）測定其濃度。色譜柱為Agilent poroshell 120 EC-C18，流動相為0.1%甲酸的乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液（90 ∶ 10，V/V），采用多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行正離子檢測，檢測離子對分別為CLPCA 質(zhì)荷比（m/z） 308.1→198.1、CLP m/z 322.3→212.0、2-O-CLP m/z 338.3→155.0、CLPTM-D m/z 504.4→354.1、內(nèi)標(biāo)噻氯吡啶m/z 264.0→154.1。結(jié)果：CLPCA、CLP、2-O-CLP、CLPTM-D和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為2.01、3.32、2.83、2.68、1.87 min，CLPCA、CLP、2-O-CLP、CLPTM-D檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為100～10 000、0.2～20、0.3～30、0.5～50 ng/mL（r均≥0.999 5），日內(nèi)、日間精密度試驗(yàn)的RSD均≤9.5%（n=5），準(zhǔn)確度為93.5%～98.9%（n=5），提取回收率為85.4%～95.9%（n=5），基質(zhì)效應(yīng)的CV為2.7%～6.2%（n=5）。穩(wěn)定性（-80 ℃放置3個月、3次冷凍-解凍循環(huán)、4 ℃放置8 h）試驗(yàn)中，CLPCA、CLP、2-O-CLP和CLPTM-D的RE均≤10.0%（n=5）。結(jié)論：建立的LC-MS/MS法特異性強(qiáng)，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于檢測人血漿中CLP及其3種代謝產(chǎn)物的濃度。

關(guān)鍵詞 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;氯吡格雷;代謝產(chǎn)物;血漿濃度

Determination of Clopidogrel and Its Three Metabolites Concentrations in Human Plasma by LC-MS/MS

LIU Zhirui，YAO Pu，YANG Bo，WANG Yu，F(xiàn)ENG Wei，SUN Fengjun（Dept. of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Army Medical University， Chongqing 400038， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of clopidogrel （CLP）， its intermediate metabolite （2-O-CLP）， inactive metabolite （CLPCA） and active metabolite （CLPTM） in human plasma. METHODS： Totally 90 patients diagnosed as stroke were selected from the First Affiliated Hospital of Army Medical University. They were given one CLP tablet （75 mg/tablet） orally on an empty stomach in the morning. Blood samples were collected 2 h after taking the tablet. CLPTM- D was formed by derivation of CLPTM with 2-bromo-3’-methoxyacetophenone and extracted by precipitation of acetonitrile protein together with the other three substances to be measured. LC-MS/MS method was adopted. The determination was performed on Agilent poroshell 120 EC-C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile （0.1% formic acid） and water （0.1% formic acid） （90 ∶ 10， V/V）. The quantitation analysis was performed using multiple reaction monitoring at the specific ion transitions of m/z 308.1→198.1 （CLPCA）， 322.3→212.0 （CLP）， 338.3→155.0 （2-O-CLP）， 504.4→354.1 （CLPTM-D） and 264.0→154.1 （ticlopidine， internal standard）， respectively. RESULTS： The retention time of CLPCA， CLP， 2-O-CLP， CLPTM-D and internal standard were 2.01， 3.32， 2.83， 2.68， 1.87 min， respectively. The linear range of CLPCA， CLP， 2-O-CLP and CLPTM-D were 100-10 000， 0.2-20， 0.3-30， 0.5-50 ng/mL （all r≥0.999 5）. The intra-day and inter-day RSD were all less than 9.5% （n=5）. Accuracy ranged from 93.5%-98.9% （n=5）， and extraction recovery was from 85.4% to 95.9% （n=5）. The matrix effect ranged from 2.7%-6.2% （n=5）. In stability tests （storing at -80 ℃ for 3 months， 3 freeze-thaw cycles， storing at 4 ℃ for 8 h）， RE of CLP， CLPCA and CLPTM-D were all lower than 10.0% （n=5）. CONCLUSIONS： Established LC-MS/MS method has the advantages of high specificity， accuracy and reliability， and can be used to detect the concentration of CLP and its three metabolites in human plasma.

KEYWORDS ? LC-MS/MS; Clopidogrel; Metabolites; Plasma concentration

氯吡格雷（Clopidogrel，CLP）是臨床廣泛使用的血小板受體抑制劑，主要用于腦卒中、急性冠狀動脈綜合征等循環(huán)障礙疾病的治療。CLP為前體藥物，本身不具活性，需經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化為活性形式才能發(fā)揮抗血小板作用。CLP經(jīng)口服吸收后在肝臟內(nèi)迅速代謝，其中約85%通過羧酸酯酶（主要受CES1基因調(diào)控）水解為不具抗血小板活性的代謝產(chǎn)物——氯吡格雷羧酸代謝物（Clopidogrel carboxylic acid，CLPCA），余下約15%在細(xì)胞色素P450酶的作用下依次生成中間代謝產(chǎn)物——2-氧-氯吡格雷（2-oxo-clopidogrel，2-O-CLP）和活性代謝產(chǎn)物——氯吡格雷硫醇代謝物（Clopidogrel thiol metabolite，CLPTM），CLPTM可選擇性地與血小板膜表面腺苷二磷酸受體P2Y12結(jié)合從而抑制血小板的聚集[1]。

藥物體內(nèi)代謝過程可能直接影響藥物療效的發(fā)揮[2]?；钚源x產(chǎn)物CLPTM由于含有巰基極易被氧化，直接測定存在較大難度。Takahashi M等[3]利用衍生化試劑2-溴-3’-甲氧基苯乙酮（2-bromo-3’-methoxyacetophenone，BMP）將CLPTM轉(zhuǎn)化為相對穩(wěn)定的硫醇代謝物衍生物（Derivatized clopidogrel thiol metabolite，CLPTM-D）后再測定其濃度，本研究也將采用此方法測定CLPTM的濃度。

目前國內(nèi)外學(xué)者建立了多種CLP血藥濃度檢測方法，如文獻(xiàn)[4-5]檢測了CLP，文獻(xiàn)[6-7]檢測了2-O-CLP，文獻(xiàn)[8-9]檢測了CLPTM，文獻(xiàn)[10-13]檢測CLP及其1～2種代謝產(chǎn)物。但是這些研究均沒有一并檢測CLP及代謝產(chǎn)物CLPCA、2-O-CLP、CLPTM的濃度，以至于難以完全闡明CLP的體內(nèi)代謝過程。因此，本研究將建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）測定人血漿中CLP及代謝產(chǎn)物CLPCA、2-O-CLP、CLPTM的濃度，以期為CLP臨床給藥方案調(diào)整提供精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)支撐。CLP的體內(nèi)代謝途徑及CLPTM的衍生化過程見圖1。

1 材料

1.1 儀器

LC-30 AD超高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）;AB SCIEX Qtrap 5500三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（包括電噴霧離子源）和Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)分析軟件（美國AB Sciex公司）;Legend Micro 17R冷凍離心機(jī)（美國Thermo公司）;Vortex-Genie 2渦旋振蕩器（美國Scienti- fic公司）;Milli-Q Advantage A10超純水機(jī)（美國Millipore公司）;CPA225D電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

CLP對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100819-201605，純度：99%）;2-O-CLP對照品（批號：2-GAB-58-1，純度：98%）、CLPCA對照品（批號：3-YHU-79-2，純度：98%）和CLPTM對照品（批號：2-RIT-52-1，純度：95%）均購于加拿大TRC公司;噻氯吡啶對照品（批號：BCBK5476V，純度：99%）和衍生化試劑BMP（批號：STBF4711V，純度：98%）均購自美國Sigma公司;氯吡格雷片（深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司，批號：B190001，規(guī)格：75 mg）;水為超純水，乙腈和甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 受試者來源

本研究經(jīng)陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)，所有受試者均自愿參加并簽署了知情同意書。經(jīng)過嚴(yán)格篩選，選取90名確診為腦卒中的患者參加試驗(yàn)，受試者年齡為42～75歲，半年內(nèi)無內(nèi)臟出血性疾病史，無嚴(yán)重肝、腎、心或其他疾病。

2 方法與結(jié)果

2.1 CLPTM-D的制備

2.1.1 衍生方法 在Takahashi M等[3]研究的基礎(chǔ)上，對CLPTM的衍生化方法進(jìn)行微調(diào)。用乙腈配制得到質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的CLPTM對照品溶液，取0.5 mL置于25 mL量瓶內(nèi)，加入4 mL氯化銨溶液（100 mmol/L）和0.5 mL BMP乙腈溶液（100 mmol/L），室溫下放置10 min后，用乙腈定容后得到CLPTM-D溶液，測得其質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

2.1.2 CLPTM-D的鑒定與純度測定 將“2.1.1”項(xiàng)下衍生成的CLPTM-D溶液用乙腈稀釋至100 ng/mL后進(jìn)行LC-MS/MS分析，采用峰面積歸一法計算，得到衍生物CLPTM-D的純度為96.8%，滿足定量分析要求。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的制備 取CLP、CLPCA和2-O- CLP對照品和CLPTM-D溶液適量，用乙腈溶解后得到4種待測物的貯備液。分別取貯備液適量，用空白血漿稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線所需濃度，其中CLPCA的質(zhì)量濃度分別為100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000 ng/mL，CLP的質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、10、20 ng/mL，2-O-CLP的質(zhì)量濃度分別為0.3、0.6、1.5、3.0、6.0、15、30 ng/mL，CLPTM-D的質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.5、5.0、10、25、50 ng/mL。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 取噻氯吡啶對照品適量，用乙腈配制得到質(zhì)量濃度為2 mg/mL的噻氯吡啶貯備液，并將其稀釋至200 ng/mL作為內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.3 血漿樣品溶液的制備 ①衍生化反應(yīng)：取人全血4 mL至EDTA抗凝管中，迅速加入125 μL BMP乙腈溶液（100 mmol/L），4 ℃下3 000 r/min離心5 min后分離血漿。②血漿樣品處理：取血漿樣品100 μL至1.5 mL EP管內(nèi)，加入內(nèi)標(biāo)溶液20 μL和乙腈1 000 μL，渦旋30 s混勻，4 ℃下13 000 r/min離心5 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2.3 色譜條件與質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent poroshell 120 EC-C18 （150 mm×3.0 mm，2.7 μm）;流動相：含0.1%甲酸的乙腈溶液-含0.1%甲酸水溶液（90 ∶ 10，V/V）;柱溫：25 ℃;進(jìn)樣器溫度：4 ℃;流速：0.35 mL/min;進(jìn)樣量： ? ?2 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子化源（ESI），多反應(yīng)正離子檢測模式進(jìn)行定量檢測;定量分析的檢測離子對CLPCA質(zhì)荷比（m/z）為308.1→ 198.1，CLP m/z為322.3→212.0，2-O-CLP m/z為338.3→155.0，CLPTM-D m/z為504.4→354.1，噻氯吡啶（內(nèi)標(biāo)） m/z為264.0→ 154.1;CLPCA、CLP、2-O-CLP、CLPTM-D和內(nèi)標(biāo)的去簇電壓（DP）分別為44.5、116.6、116.7、32.1、58.0 V;碰撞能量（CE）分別為23.9、22.0、34.2、24.1、25.1 eV。離子源參數(shù)設(shè)定如下，氣簾氣：25 psi;霧化氣：40 psi;輔助加熱氣：60 psi;離子源溫度：550 ℃;離子源電壓：4 000 V;碰撞活化解離設(shè)置為“Medium”。

2.4 專屬性考察

取6名受試者的空白血漿，以及空白血漿加入CLPCA、CLP、2-O-CLP、CLPTM-D和受試者服藥2 h后的血漿樣品，除空白血漿不加內(nèi)標(biāo)外其余均按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)行LC-MS/MS分析。結(jié)果顯示，CLPCA、CLP、2-O-CLP、CLPTM-D和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為2.01、3.32、2.83、2.68、1.87 min，且色譜峰峰形良好，基線平穩(wěn)，血漿內(nèi)源性物質(zhì)及其他雜質(zhì)不干擾內(nèi)標(biāo)和待測成分的測定，表明方法專屬性良好。LC-MS/MS法的色譜圖見圖2。

2.5 線性關(guān)系與定量下限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的CLPCA、CLP、2-O-CLP、CLPTM-D標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理后，分別進(jìn)行LC-MS/MS分析。以血漿中待測物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（y），用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得回歸方程。線性關(guān)系與定量下限結(jié)果見表1。

2.6 精密度與準(zhǔn)確度考察

按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備定量下限和低、中、高質(zhì)量濃度4個水平的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，作為質(zhì)控樣品，其中CLPCA的質(zhì)量濃度分別為100、300、5 000、8 000 ng/mL，CLP的質(zhì)量濃度分別為0.2、0.6、10、12 ng/mL，2-O-CLP的質(zhì)量濃度分別為0.3、0.9、15、24 ng/mL，CLPTM-D的質(zhì)量濃度分別為0.5、1.5、25、40 ng/mL。再按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)行LC-MS/MS分析。分別考察3個分析批，每批、每個濃度5個樣品。應(yīng)用當(dāng)日校正曲線計算各質(zhì)控樣品中CLPCA、CLP、2-O-CLP、CLPTM-D的濃度，考察批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，CLPCA、CLP、2-O-CLP、CLPTM-D在各質(zhì)量濃度水平的批內(nèi)RSD在2.9%～9.5%之間（n=5）、批間RSD在3.7%～ 8.9%之間（n=5）、準(zhǔn)確度在93.5%～98.9%之間（n=5），均符合有關(guān)生物樣品分析方法驗(yàn)證的要求。精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果見表2。

2.7 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)考察

2.7.1 提取回收率 按“2.6”項(xiàng)下方法制備低、中、高質(zhì)量濃度的CLPCA、CLP、2-O-CLP、CLPTM-D質(zhì)控樣品，每個濃度平行制備5份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)行LC-MS/MS分析，測得待測物峰面積A1;另取空白血漿，按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理后再加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的對照品溶液，進(jìn)行LC-MS/MS分析，測得待測物的峰面積A2，以A1/A2×100%計算提取回收率。結(jié)果顯示，CLPCA、CLP、2-O-CLP和CLPTM-D的提取回收率在85.4%～95.9%之間，CV均<8%（n=5），表明提取方法對結(jié)果的影響小。提取回收率結(jié)果見表3。

2.7.2 基質(zhì)效應(yīng) 分別取6名受試者的空白血漿100 ? ?μL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理，取上清液，即得空白基質(zhì)。向空白基質(zhì)中分別加入低、高質(zhì)量濃度的CLPCA、CLP、2-O-CLP、CLPTM-D的對照品溶液，使最終濃度與“2.6”項(xiàng)下低、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品對應(yīng)，每個濃度平行制備5份，進(jìn)行LC-MS/MS分析，測定待測物的峰面積A。另制備與上述對應(yīng)質(zhì)量濃度的CLPCA、CLP、2-O-CLP、CLPTM-D對照品溶液，每個濃度平行制備5份，進(jìn)行LC-MS/MS分析，測得待測物的峰面積A’，以A/A’×100%計算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，CLPCA、CLP、2-O-CLP和CLPTM-D的基質(zhì)效應(yīng)在90.3%～98.7%之間，CV均<7%（n=5），表明在本方法色譜條件與質(zhì)譜條件下可忽略基質(zhì)效應(yīng)的影響。基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見表3。

2.8 穩(wěn)定性考察

按“2.6”項(xiàng)下方法配制低、高質(zhì)量濃度的CLPCA、CLP、2-O-CLP、CLPTM-D質(zhì)控樣品，每個濃度平行制備5份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理后，考察室溫（25 ℃）放置4 h、-80 ℃凍存3個月、3次冷凍-解凍循環(huán)、4 ℃放置8 h的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性結(jié)果見表4。

由表4顯示，-80 ℃放置3個月、3次冷凍-解凍循環(huán)、4 ℃放置8 h條件下，CLPCA、CLP、2-O-CLP和CLPTM-D的RE均不大于10.0%（n=5），滿足生物樣品分析方法驗(yàn)證的要求。本研究選擇在冰浴條件下4 h內(nèi)完成血漿樣品的處理。

2.9 藥動學(xué)實(shí)驗(yàn)

90名受試者于給藥日早上空腹口服1片氯吡格雷片 （規(guī)格：75 mg），于服藥2 h后采集全血，按“2.2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)行LC-MS/MS分析。受試者血漿中4種待測物的測定結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 本研究的意義

CLP為前藥，其體內(nèi)代謝過程會直接影響藥物療效的發(fā)揮[12]。有文獻(xiàn)報道介導(dǎo)CLP非活性代謝產(chǎn)物生成的羧酸酯酶活性改變會顯著影響CLP療效[14]，即除了活性代謝產(chǎn)物CLPTM，非活性代謝產(chǎn)物CLPCA的濃度也與藥物療效密切相關(guān)。因此，為了全面、系統(tǒng)地考察CLP的體內(nèi)代謝過程，本研究建立了測定人血漿中CLP及其3種代謝產(chǎn)物（包括活性代謝產(chǎn)物和非活性代謝產(chǎn)物）的LC-MS/MS方法?？紤]到血漿中CLPCA的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于另外3種待測物（濃度差異達(dá)到2～3個數(shù)量級），同時測定存在較大困難，本研究分別建立了CLPCA和CLP、2-O-CLP、CLPTM-D的檢測方法。此外，為了測定4種待測物的含量，本研究選擇患者服藥后2 h作為采血時間點(diǎn)，此時CLP尚未完全代謝。

3.2 前處理方法和色譜條件的優(yōu)化

在建立LC-MS/MS定量分析方法時，本研究對樣品處理方法、色譜柱、流動相、柱溫等條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。雖然液液萃取可有效去除磷脂等干擾組分，但該方法操作煩瑣、費(fèi)時，同時會消耗大量的有機(jī)試劑，故選擇了操作簡便、提取效率較為穩(wěn)定的蛋白沉淀法進(jìn)行樣品前處理。本研究前期考察了Inertsil ODS-3（100 mm×2.1 mm，5 μm）、Agilent SB-C18（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）、Agilent poroshell 120 EC-C18（150 mm×3.0 mm，2.7 μm）等色譜柱，結(jié)果顯示Agilent poroshell 120 EC-C18（150 mm×3.0 mm，2.7 μm）色譜柱可提供更好的分離效率和更對稱的色譜峰形。選擇流動相中有機(jī)相時，與甲醇相比，乙腈可顯著提高待測物的響應(yīng)并降低噪音，因此選用乙腈作為有機(jī)相?？疾彀l(fā)現(xiàn)流動相的酸度對待測物的分離和保留有顯著影響，本研究通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)流動相中加入0.1%甲酸可獲得對稱尖銳的峰形，故在有機(jī)相和水相中均添加0.1%甲酸。本研究還考察了不同柱溫（20、25、30、35 ℃）對色譜峰展寬和保留時間的影響，結(jié)果顯示篩選的柱溫對待測物的定量檢測影響較小，最終選用與實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度一致的25 ℃。

3.3 CLPTM-D穩(wěn)定性考察

在本研究關(guān)注的4種待測物中，CLPTM由于含有游離巰基，化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，易在生物基質(zhì)中發(fā)生氧化，自身或與內(nèi)源性巰基形成二硫鍵。Takahashi M等[3]利用衍生化試劑BMP將CLPTM轉(zhuǎn)化為相對穩(wěn)定的衍生物后再測定其濃度，該方法目前已得到學(xué)界的廣泛認(rèn)可，較多的文獻(xiàn)均采用了此方法，本研究也利用了此方法，穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示，CLPTM的衍生物CLPTM-D含量在多個考察項(xiàng)下均無明顯變化。

3.4 2-O-CLP穩(wěn)定性考察

本研究結(jié)果和文獻(xiàn)結(jié)果均表明2-O-CLP穩(wěn)定性也較差，例如文獻(xiàn)[15]證實(shí)2-O-CLP的硫代內(nèi)酯環(huán)在活性氧存在條件下極易發(fā)生開環(huán)反應(yīng);文獻(xiàn)[11]發(fā)現(xiàn)2-O-CLP降解速率與溫度和時間密切相關(guān)，在室溫放置60、150 min后分別降解32.3%和47.1%，冰浴下放置60、150 min后分別降解6.6%和11.4%。目前尚無公認(rèn)的將2-O-CLP轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定性物質(zhì)的方法。綜合考慮，根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局對生物樣品穩(wěn)定性的要求，本研究在冰浴下4 h內(nèi)完成血漿樣品的處理以保證測量結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

3.5 結(jié)語

綜上所述，本研究建立的LC-MS/MS法可用于人血漿中CLPCA、CLP、2-O-CLP和CLPTM-D濃度的測定，該方法不僅特異性強(qiáng)、分析時間短，還解決了CLPTM和2-O-CLP不穩(wěn)定的問題，為氯吡格雷體內(nèi)代謝過程研究提供了試驗(yàn)依據(jù)，并為CLP臨床給藥方案調(diào)整提供了精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)支撐。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-06-03 修回日期：2019-09-20）

（編輯：鄒麗娟）