有氧游泳運動對衰老大鼠海馬中酸敏感離子通道表達的影響

羅婕　王京瓊　謝麗娜　周壽紅

[摘要] 目的 觀察有氧游泳運動對衰老大鼠海馬中酸敏感離子通道（ASIC）表達的影響。 方法 選取雄性無特定病原體級SD大鼠36只，通過隨機數字表法將其分為對照組、衰老模型組和衰老訓練組，每組12只。衰老模型組大鼠腹腔注射D-半乳糖[150 mg/（kg·d）]，衰老訓練組大鼠腹腔注射D-半乳糖[150 mg/（kg·d）]同時每天有氧游泳訓練60 min，共12周，對照組大鼠給予等量的生理鹽水腹腔注射。Morris水迷宮實驗檢測大鼠的空間學習和記憶能力。Western blot檢測大鼠海馬中ASICs的表達。 結果 與對照組比較，衰老模型組大鼠逃避潛伏期的時間和到達平臺游過的距離均顯著延長，而大鼠穿越平臺區(qū)域次數和時間明顯減少，海馬中ASIC1a和ASIC1b的表達顯著增加，ASIC4的表達顯著降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。與衰老模型組比較，衰老訓練組大鼠逃避潛伏期的時間和到達平臺游過的距離均顯著減小，大鼠穿越平臺區(qū)域次數和時間明顯增加，海馬中ASIC1a和ASIC1b表達顯著降低，ASIC4的表達顯著增加，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 有氧游泳運動改善了衰老大鼠的學習和記憶能力，其機制可能與降低海馬中ASIC1a和ASIC1b表達而增加ASIC4的表達有關。

[關鍵詞] 有氧運動;游泳;衰老;學習記憶;海馬;酸敏感離子通道

[中圖分類號] R749;G804.55 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）06（c）-0012-05

Effects of aerobic swimming on the expression of acid-sensing ion channel of hippocampus in aging rats

LUO Jie1 ? WANG Jingqiong1 ? XIE Li′na2 ? ZHOU Shouhong3

1.College of Physical Education， Hu′nan First Normal University， Hu′nan Province， Changsha ? 410205， China; 2.College of Physical Education， Hu′nan International Economics University， Hu′nan Province， Changsha ? 410205， China; 3.Department of Physiology， School of Medicine， University of South China， Hu′nan Province， Hengyang ? 421001， China

[Abstract] Objective To observe the effects of aerobic swimming exercise on the expression of acid-sensing ion channel （ASIC） in aging rats. Methods Thirty-six male specific pathogen free （SPF） Sprague-Dawley （S-D） rats were divided into control group （C group）， aging model group （AM group） and aging swimming training group （AST group） by random number table method， with 12 rats in each group. The rats in AM group were administrated with D-galactose [150 mg/（kg·d）] by intraperitoneal injection for 12 weeks. After treatment with D-galactose [150 mg/（kg·d）] by intraperitoneal injection， the rats in AST group were taken 60 minutes of aerobic swimming exercise every day for 12 weeks. The rats in C group were administrated the same amount of saline by intraperitoneal injection. The spatial learning and memory ability of rats were tested by Morris water maze test. Expression of ASIC1a， ASIC1b， ASIC2a， ASIC2b， ASIC3 and ASIC4 in hippocampus of rats were measured by Western blot. Results Compared with C group， the time of escape latency and the distance of reaching the platform were significantly increased， the number and time to across platform were significantly decreased， expression of ASIC1a and ASIC1b in hippocampus was significantly up-regulated and expression of ASIC4 was significantly down-regulated in AM group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared with the AM group， the time of escape latency and the distance to reach the platform were significantly decreased， the number and time to across platform were significantly increased， expression of ASIC1a and ASIC1b in hippocampus was significantly down-regulated and expression of ASIC4 was significantly up-regulated in AST group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The aerobic swimming exercise improves the learning and memory in aging rats， of which， the mechanism may be related with decrease of expression of ASIC1a and ASIC1b and increase of expression of ASIC4 in hippocampus.

[Key words] Aerobic exercise; Swim; Aging; Learning and memory; Hippocampus; Acid-sensing ion channel

隨著我國人口老齡化程度的加劇，人口老齡化給社會帶來的不利影響日益凸出。生物體發(fā)生衰老是一種無法避免的自然現象，衰老發(fā)生時機體各器官的功能進行性下降。腦衰老是機體衰老的重要部分，學習和記憶能力的降低是腦衰老的主要表現[1]。衰老的發(fā)生機制十分復雜，至今尚未闡明清楚，包括自由基學說、代謝紊亂學說、端粒異常學說、衰老遺傳程序學說等[2-3]。如何提高老年人的學習和記憶能力，延緩衰老的進程是重要的研究課題。研究顯示適當的運動可促進細胞的新陳代謝，提高免疫力，增強學習和記憶能力，延緩衰老，但是其機制尚不清楚[4-6]。酸敏感離子通道（acid-sensing ion channel，ASIC）在神經細胞上廣泛表達，研究表明ASIC參與了學習和記憶過程，急性應激通過激活ASIC增強大鼠的學習記憶[7]。長時程抑制（long-term potentiation，LTP）是一種突觸可塑性的重要表現形式，與學習記憶關系密切，研究發(fā)現ASIC1a是海馬中產生代謝型谷氨酸受體依賴的LTP所必需的[8]。但是關于ASIC與學習記憶的關系也存在矛盾的結果，研究發(fā)現ASIC1a不是與學習記憶關系密切的LTP和空間記憶所必需的[9]。那么ASIC與學習記憶的關系到底是怎樣的？有氧游泳運動改善學習和記憶的機制是否與ASIC有關？這些問題目前還不明確。因此本研究通過D-半乳糖誘導大鼠的衰老性學習和記憶損傷，通過有氧游泳運動訓練，觀察其對衰老大鼠學習和記憶能力及海馬ASIC表達的影響，從ASIC的角度探討有氧游泳運動改善衰老大鼠學習和記憶能力的可能機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Morris水迷宮設施由成都泰盟科技有限公司提供。BCA蛋白定量試劑盒購自美國Invitrogen公司。兔抗大鼠ASIC1a（貨號：09-195）、ASIC1b（貨號：07-673）、ASIC2a（貨號：07-864）、ASIC2b（貨號：05-174-S）、ASIC3（貨號：6361-H）、ASIC4（貨號：34372-2）、β-actin（貨號：08-512-B）及抗辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Millipore公司。

1.2 動物

無特定病原體級的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠36只（實驗動物合格證號：4300470038756），2月齡，體重（200±30）g，由中南大學實驗動物學部[實驗動物生產許可號：SYXK（湘）2015-0017]提供。大鼠分籠飼養(yǎng)（每籠5只），按照嚙齒類動物喂養(yǎng)的標準飼養(yǎng)，在通風良好、自然光照、溫度保持在22℃左右、相對濕度為55%的動物房中飼養(yǎng)，自由進食水。動物實驗方案得到了南華大學醫(yī)學倫理委員會批準。

1.3 實驗分組和衰老大鼠模型建立

大鼠購買后適應性喂養(yǎng)1周，通過Morris水迷宮實驗檢測大鼠的空間記憶能力。具有基本一致的記憶能力的大鼠被選用，通過隨機數字表法將大鼠分為對照組、衰老模型組和衰老訓練組，每組12只。衰老模型組大鼠腹腔注射D-半乳糖[150 mg/（kg·d）]，共12周。衰老訓練組大鼠腹腔注射D-半乳糖[150 mg/（kg·d）]，同時每天進行有氧游泳訓練60 min，共12周。D-半乳糖用生理鹽水溶解，注射體積為0.5 mL/100 g體重，對照組大鼠給予等量的生理鹽水每天腹腔注射。12周有氧游泳運動訓練結束后，再通過隨機數字表法將每組大鼠分為2個小組，其中一組的大鼠進行Morris水迷宮實驗，實驗時間為6 d;而另一組大鼠進行自然喂養(yǎng)6 d，用于Western blot檢測（n = 6）。

1.4 有氧游泳運動訓練

衰老訓練組大鼠在3 d的適應性游泳運動后進行游泳訓練。游泳訓練的圓形水池規(guī)格為150 cm×70 cm，水深50 cm，水溫維持在35℃左右。大鼠每天游泳訓練的時間為60 min，共12周。每個游泳池同時5只大鼠進行訓練。

1.5 Morris水迷宮檢測

全部的游泳訓練結束后，所有大鼠的空間記憶能力均采用Morris水迷宮實驗檢測。大鼠依次進行定位航行實驗和空間探索實驗。每天上午進行定位航行實驗，實驗時間為5 d，將大鼠面向游泳池壁，每次都從事先標記的入水點將大鼠依次放入水中，然后記錄逃避潛伏期，即大鼠在2 min內尋找到實驗平臺并爬上平臺在平臺上停留10 s以上所需要的時間。同時記錄所有大鼠從被放入水中開始到爬上平臺的總游泳距離。定位航行實驗結束后的第2天上午開始空間探索實驗檢測，首先撤去游泳池中的實驗平臺，每次固定從第3象限將大鼠放入水中，然后記錄大鼠在2 min內穿越原實驗平臺區(qū)域的次數和穿越原實驗平臺區(qū)域的時間[10]。

1.6 Western blot

在Morris水迷宮檢測試驗結束完畢后，采用脫頸椎的方法將大鼠處死。將大鼠的顱骨打開，剝取整個腦組織，然后再將海馬組織小心地剝取出來，用磷酸鹽緩沖液將血液等清洗干凈。取適量海馬組織，提取組織總蛋白，按試劑盒說明進行操作。測定樣本總蛋白的濃度，取50 μg總蛋白樣本在上樣緩沖液中煮沸，使蛋白充分變性。取10 μL總蛋白樣品，通過SDS-聚丙酰胺凝膠電泳將蛋白分離開來。通過轉膜儀將蛋白質轉移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，4%脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h。加入兔抗大鼠ASIC1a（1∶150）、ASIC1b（1∶200）、ASIC2a（1∶200）、ASIC2b（1∶300）、ASIC3（1∶150）、ASIC4（1∶400）和β-actin（1∶1000）的一抗，4℃條件下孵育過夜。磷酸鹽緩沖液洗膜3次，再加入二抗，4℃條件下繼續(xù)孵育4 h。電化學發(fā)光（electro-chemi-luminescence，ECL）試劑顯影在膠片上，凝膠圖像分析系統對膠片掃描并記錄結果。采用Image J軟件進行結果分析，采用目的蛋白與內參β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.7 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件對實驗結果進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用重復測量資料方差分析處理Morris水迷宮測試中逃避潛伏期和到達平臺游過的距離，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗大鼠的一般情況

對照組大鼠反應機警，活動自如，神態(tài)安詳，進食和飲水均正常，體毛光亮;衰老模型組大鼠精神萎靡，活動遲緩，反應遲鈍，體毛稀疏、干枯、沒有光澤，但肢體活動正常;衰老訓練組大鼠精神狀況明顯好轉，活動較自如，反應稍微遲鈍。

2.2 有氧游泳運動對衰老大鼠的學習和記憶能力的影響

游泳訓練完畢后，通過Morris水迷宮測試檢測大鼠的學習和記憶能力。隨著水迷宮測試天數的增加，各組大鼠的逃避潛伏期和到達實驗平臺游過的總距離均顯著縮短（P < 0.05）。在定位航行實驗中，與對照組比較，在實驗的第2、3、4、5天，衰老模型組大鼠的逃避潛伏期和到達實驗平臺游過的總距離均顯著增加（P < 0.05）;而衰老訓練組大鼠的逃避潛伏期和到達實驗平臺游過的總距離均較衰老模型組顯著縮短（P < 0.05），見表1～2。在空間探索實驗中，衰老模型組大鼠穿越原實驗平臺區(qū)域的次數和穿越原實驗平臺區(qū)域的時間均較對照組顯著減少（P < 0.05）;衰老訓練組大鼠穿越原實驗平臺區(qū)域的次數和穿越原實驗平臺區(qū)域的時間均較衰老模型組顯著增加（P < 0.05），見表3。

2.3 有氧游泳運動對衰老大鼠的海馬組織中ASICs各亞型表達的影響

衰老模型組大鼠的海馬組織中ASIC1a和ASIC1b的蛋白表達與對照組比較均顯著增加（P < 0.05），而ASIC4的蛋白表達顯著降低（P < 0.05）;衰老訓練組大鼠的海馬組織中ASIC1a和ASIC1b蛋白表達與衰老模型組比較均顯著降低（P < 0.05），而ASIC4的蛋白表達顯著增加（P < 0.05）。各組間ASIC2a、ASIC2b和ASIC3的蛋白表達比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖1。

3 討論

衰老是指人體在生長發(fā)育完全成熟后，隨著年齡逐漸增加，機體的生理功能逐漸減退，出現一系列全身性的、多方面的退行性變化，如皮膚松弛和骨質疏松等，與衰老關系密切的疾病如阿爾茨海默病、糖尿病、高血壓和動脈硬化等發(fā)病概率增加[11-12]。因此闡明引發(fā)衰老的原因和機制，以尋求延緩衰老的策略和途徑，對提高老年人的生命質量具有十分重要的現實意義。隨著機體的衰老，器官和組織的功能逐漸退化減弱，而學習和記憶能力的減退是衡量衰老發(fā)生的一個很重要的指標。大腦邊緣系統在信息處理方面發(fā)揮著十分重要的作用，海馬是邊緣系統的重要成員，是與學習和記憶關系最密切的腦區(qū)，又是最容易受衰老影響的腦區(qū)[13-15]。

D-半乳糖被細胞攝取后，在細胞內被醛糖還原酶催化而產生半乳糖醇，而半乳糖醇不能被細胞代謝降解而堆積在細胞中，增加細胞內的滲透壓，使細胞吸水腫脹，導致細胞功能障礙和細胞內代謝紊亂，誘發(fā)衰老的發(fā)生，因此D-半乳糖是誘導亞急性衰老動物模型的常用試劑[16-17]。本研究中給大鼠腹腔注射D-半乳糖12周后大鼠出現精神萎靡，活動遲緩，體重減輕，反應遲鈍，體毛稀疏、干枯、沒有光澤等衰老的表現。Morris水迷宮實驗結果顯示，在定位航行實驗的第2、3、4、5天，衰老大鼠的逃避潛伏期和到達實驗平臺游過的總距離較對照組均明顯增加。在空間探索實驗中，衰老大鼠穿越原實驗平臺區(qū)域的次數和穿越原實驗平臺區(qū)域的時間均明顯縮短。這些結果提示衰老大鼠的模型成功建立。

大量的研究表明合理運動可改善學習和記憶功能，延緩衰老的發(fā)展進程[18-20]。本研究結果顯示衰老訓練組大鼠精神狀況明顯好轉，活動自如，毛發(fā)光亮，空間學習和記憶能力也明顯改善，表現為在定位航行實驗的第2、3、4、5天，與衰老模型組比較，衰老訓練組大鼠的逃避潛伏期和到達平臺游過的距離均顯著減小。在空間探索實驗中，衰老訓練組大鼠穿越原實驗平臺區(qū)域的次數和穿越原實驗平臺區(qū)域的時間明顯增加。

ASICs在脊髓、丘腦、小腦、腦橋、前腦、中腦和腦干等部位均有廣泛表達，在中樞神經系統中主要表達在神經細胞上，在星型膠質細胞和小膠質細胞上也有表達，而其他神經膠質細胞如少突膠質細胞等目前還沒有發(fā)現有表達[21]。ASICs是屬于配體門控型離子通道，是退化蛋白/上皮鈉通道超家族成員。ASICs存在細胞膜上可直接感受機體內環(huán)境中pH值的變化，調控離子通道的開放與關閉，介導Na+和Ca2+的內流，使細胞膜產生去極化，引發(fā)興奮性效應。在中樞神經系統中主要有ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4這6種亞型的表達[22]。研究表明學習和記憶能力的改變與ASIC表達的變化有關，ASIC參與了學習和記憶的機制。王杰等[23]研究發(fā)現油脂可提高大鼠空間學習和記憶能力，其機制可能與影響大鼠海馬中ASIC1a、ASIC1b和ASIC4 mRNA的表達水平有關。因此本研究中采用Western blot檢測大鼠海馬中ASIC蛋白的水平，結果顯示衰老模型組大鼠海馬中ASIC1a和ASIC1b的蛋白表達均顯著增加，而ASIC4的蛋白表達顯著降低（P < 0.05）。衰老訓練組大鼠海馬組織ASIC1a和ASIC1b蛋白表達與衰老模型組比較均顯著降低，而ASIC4的蛋白表達顯著增加。這些結果提示有氧游泳運動可以逆轉衰老過程中ASIC蛋白表達的變化，這可能是有氧游泳運動能改善衰大鼠的空間學習和記憶能力降低的機制之一。

總之，本研究結果闡明有氧游泳運動可改善衰老大鼠的學習和記憶能力，而其機制可能與降低海馬組織中ASIC1a和ASIC1b表達而增加ASIC4的表達有關。

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