ZBP-89與缺氧信號(hào)因子HIF-1α在肝癌細(xì)胞中的相關(guān)性研究

李闖 葉勁松 劉昕

摘要：目的? 探討ZBP-89在肝癌組織中的表達(dá)與缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的相關(guān)性，為證實(shí)ZBP-89通過(guò)抑制HIF-1α/Notch1信號(hào)通路降低肝癌干細(xì)胞“干性”提供依據(jù)。方法? 選擇2016年8月～2018年8月深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院與深圳市人民醫(yī)院肝膽胰外科120例原發(fā)性肝癌患者作為研究對(duì)象，收集病理標(biāo)本，采用免疫組化染色方法來(lái)檢測(cè)肝癌細(xì)胞及癌旁組織中ZBP-89、HIF-1α的相關(guān)表達(dá)，分析二者之間的相關(guān)性。結(jié)果? ZBP-89在肝癌組織中呈現(xiàn)出低表達(dá)狀態(tài)，而在癌旁組織中卻呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)，分別為34.17%、62.50%;ZBP-89在癌旁組織中表達(dá)高于肝癌組織（P<0.05）。而在肝癌組織細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)ZBP-89的表達(dá)與缺氧信號(hào)因子HIF-1α的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論? ZBP-89很可能為肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中一個(gè)潛在的抑癌基因，通過(guò)抑制HIF-1α/Notch1通路進(jìn)而抑制肝癌干細(xì)胞增殖、增強(qiáng)肝癌干細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，可能是其發(fā)揮抑癌效應(yīng)的重要機(jī)制。

關(guān)鍵詞：肝癌;ZBP-89;HIF-1α;缺氧調(diào)控因子

中圖分類號(hào)：R735.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.15.023

文章編號(hào)：1006-1959（2019）15-0074-03

Abstract：Objective? To investigate the correlation between the expression of ZBP-89 in hepatocarcinoma and the hypoxia-inducible factor HIF-1α， and to provide evidence for ZBP-89 to reduce the "dryness" of liver cancer stem cells by inhibiting HIF-1α/Notch1 signaling pathway.Methods? From August 2016 to August 2018， 120 patients with primary liver cancer in the Department of Hepatobiliary Surgery of Shenzhen Longhua District People's Hospital and Shenzhen People's Hospital were selected as subjects. Pathological specimens were collected and immunohistochemical staining was used to detect liver cancer cells. The correlation expressions of ZBP-89 and HIF-1α in adjacent tissues were analyzed， and the correlation between them was analyzed. Results? ZBP-89 showed low expression status in liver cancer tissues， but high expression status （41/120， 75/120） in adjacent tissues 34.17%， 62.50%， respectively; ZBP-89 in adjacent tissues the expression was higher than that of liver cancer tissues （P<0.05）. The expression of ZBP-89 was negatively correlated with the expression of hypoxia signal factor HIF-1α in hepatocarcinoma cells （P<0.05）.Conclusion? ZBP-89 is likely to be a potential tumor suppressor gene in the development and progression of hepatocarcinoma. It can inhibit the proliferation of hepatocellular carcinoma stem cells and enhance the sensitivity of liver cancer stem cells to chemotherapeutic drugs by inhibiting HIF-1α/Notch1 pathway. An important mechanism of effect.

Key words：Liver cancer;ZBP-89;HIF-1α;Hypoxia regulator

ZBP-89（zinc-finger binding protein-89）是1996年由Merchant等首先發(fā)現(xiàn)，是Krüppel-type（Cys2-His2-type）鋅指蛋白家族成員之一。因其N端含有四個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域和分子量大小為89 kD，所以命名為ZBP-89[1]。ZBP-89是一個(gè)具有雙向調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)結(jié)合富含GC的DNA序列激活或抑制基因表達(dá)[2]。目前發(fā)現(xiàn)受其上調(diào)的靶基因有p21、Bak、MMP3、pdcd4、IAP、stromelysin、GHR等，受其下調(diào)的靶基因有g(shù)astrin、ENA-78、SOX18、Pax7等[3]。ZBP-89可以通過(guò)直接結(jié)合來(lái)穩(wěn)定p53的表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)p53在核內(nèi)的滯留而提高其轉(zhuǎn)錄活性，引起細(xì)胞周期阻滯和凋亡[4]。目前關(guān)于ZBP-89的表達(dá)調(diào)控的研究顯示HIF-1a在細(xì)胞水平上可以上調(diào)ZBP-89的表達(dá)，并且ZBP-89啟動(dòng)子上有潛在的HIF-1a僅結(jié)合位點(diǎn)，但兩者在肝癌組織中的相關(guān)性未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)論證ZBP-89在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)陽(yáng)性率，分析轉(zhuǎn)錄蛋白ZBP-89與肝癌組織細(xì)胞的相關(guān)性及肝癌組織中ZBP-89對(duì)于肝癌細(xì)胞增殖凋亡的影響，通過(guò)實(shí)驗(yàn)鏡下觀察收集數(shù)據(jù)說(shuō)明ZBP-89與缺氧信號(hào)調(diào)控因子HIF-1α蛋白的相關(guān)性，進(jìn)一步論證ZBP-89通過(guò)抑制缺氧信號(hào)因子HIF-1α的轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料和方法

1.1材料? 本階段實(shí)驗(yàn)研究總共收集深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院普通外科和深圳市人民醫(yī)院肝膽胰外科2016年8月～2018年8月原發(fā)性肝癌手術(shù)后石蠟固定病理標(biāo)本共120組，其中男性91例，女性29例，所有肝癌患者均未接受過(guò)術(shù)前新輔助放化療及生物治療。每組包括：①腫瘤組織：在肝癌手術(shù)標(biāo)本中心留取肝癌組織;②癌旁組織：均取自距離腫瘤邊緣2 cm以上正常肝組織。

1.2試劑與儀器? 選用兔抗人ZBP-89多克隆抗體和鼠抗人HIF-1α單克隆抗體均由Santa Cruz公司提供，免疫試劑盒SP-9001由北京中衫金橋技術(shù)公司生產(chǎn)提供;Nikon TE2000-U顯微鏡。

1.3方法? 免疫組化染色：先行將2種石蠟病理標(biāo)本切片脫蠟，用磷酸鹽緩沖液沖洗15 min，反復(fù)沖洗3次。然后將切片放于pH 9.0的緩沖液中修復(fù)，在微波中修復(fù)20 min（95℃），冷卻30 min后，再次緩沖液沖洗3次，再加入山羊血清進(jìn)行封閉，至于溫箱（37℃）放置1 h，然后滴加一抗（1∶200稀釋兔抗ZBP-89多克隆抗體），放入冰箱靜置12 h，復(fù)溫后用緩沖液沖洗3次，滴加生物素二抗（1∶100稀釋鼠抗人HIF-1α單克隆抗體），置于37℃溫箱15 min，再次用緩沖液沖洗3次;然后滴加DA染色液顯色，用水中止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染、脫水、封片，鏡下觀察結(jié)果。

1.4觀察指標(biāo)? 免疫組化染色后，鏡下觀察120組病理標(biāo)本中肝癌組織及癌旁組織中轉(zhuǎn)錄蛋白ZBP-89的表達(dá)陽(yáng)性結(jié)果、肝癌組織細(xì)胞中ZBP-89與HIF-1α的表達(dá)陽(yáng)性結(jié)果。ZBP-89和HIF-1α的表達(dá)陽(yáng)性評(píng)分標(biāo)記參考已發(fā)表的文獻(xiàn)[5，6]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 使用SPSS 15.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料均以？字2檢驗(yàn)表示，使用Pearson相關(guān)系數(shù)判斷相關(guān)性;實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)非正態(tài)分布資料使用Mann-Whitney檢驗(yàn)，判斷相關(guān)性用Spesarn等級(jí)相關(guān)及Spesan秩相關(guān)檢驗(yàn)，使用Spearman等級(jí)相關(guān)及秩相關(guān)檢驗(yàn)判斷相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 ZBP-89在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)? ZBP-89在肝癌組織中呈現(xiàn)出低表達(dá)狀態(tài)，陽(yáng)性表達(dá)主要位于肝癌細(xì)胞細(xì)胞核及胞漿;而在癌旁組織中卻呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)，分別為34.17%（41/120）、62.50%（75/120）; ZBP-89在癌旁組織中表達(dá)高于肝癌組織（P<0.05）（圖1）。HIF-1α在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)（P<0.05）（圖2）。

2.2 ZBP-89與缺氧信號(hào)調(diào)控因子HIF-1α的相關(guān)性分析? 在總肝癌病理標(biāo)本中ZBP-89與缺氧信號(hào)調(diào)控因子HIF-1α蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性（？字2=9.606， P=0.002），見(jiàn)表1。

3討論

實(shí)體瘤微環(huán)境通常存在缺氧，缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）居于核心調(diào)控位置[7]。HIF-1由α亞基和β亞基組成，其中α亞基受細(xì)胞內(nèi)氧氣濃度精密調(diào)控，對(duì)HIF-1功能的發(fā)揮起關(guān)鍵作用;在常氧條件下α亞基極易被脯氨酸羥化酶（PHD）羥基化，然后與pVHL 蛋白靶向結(jié)合，最后經(jīng)泛素化蛋白酶途徑而被降解;在正常氧狀態(tài)下，HIF-1α的半衰期<5 min。而缺氧條件時(shí)α亞基的羥基化作用被完全抑制，致使α亞基和β亞基發(fā)生異二聚化并轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，然后通過(guò)招募轉(zhuǎn)錄共激活因子p300/CBP，與靶基因的啟動(dòng)子上的缺氧反應(yīng)元件（hypoxia response elements，HREs）相結(jié)合，調(diào)控多種缺氧反應(yīng)基因[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，Notch1基因啟動(dòng)子上含有多個(gè)HRE，HIF-1α過(guò)表達(dá)可增加肝癌細(xì)胞Notch1、EpCAM、CD13蛋白的表達(dá)，提示Notch1可能為HIF-1α下游靶基因。因此，在缺氧微環(huán)境中HIF-1α/Notch1通路對(duì)肝癌干細(xì)胞“干性”的維持起重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)[9]，ZBP-89在腫瘤組織中普遍存在表達(dá)異常，但同腫瘤的關(guān)系尚不清楚，且主要集中在ZBP-89的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能上?；诒菊n題組前期研究結(jié)果，再結(jié)合ZBP-89可協(xié)同或促進(jìn)p53、p21、pdcd4蛋白引起腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)ZBP-89很可能為肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中一個(gè)潛在的抑癌基因。抑制HIF-1α/Notch1信號(hào)通路進(jìn)而抑制肝癌干細(xì)胞增殖、增強(qiáng)肝癌干細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，可能是其發(fā)揮抑癌效應(yīng)的重要機(jī)制。對(duì)HIF-1α的啟動(dòng)子的分析發(fā)現(xiàn)，HIF-1α的啟動(dòng)子上均存在多個(gè)Sp1的可能結(jié)合位點(diǎn)，文獻(xiàn)亦報(bào)道Sp1可同HIF-1α的啟動(dòng)子結(jié)合影響其表達(dá)。因ZBP-89?？筛?jìng)爭(zhēng)結(jié)合基因啟動(dòng)子上Sp1的結(jié)合位點(diǎn)，所以我們推測(cè)ZBP-89同HIF-1α啟動(dòng)子上的Sp1結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合進(jìn)而抑制HIF-1α的轉(zhuǎn)錄可能是其抑制HIF-1α表達(dá)的主要機(jī)制之一。

本研究通過(guò)免疫組化方法對(duì)ZBP-89在肝癌組織細(xì)胞中及癌旁細(xì)胞重的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ZBP-89在62.50%的肝癌旁組織細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，在34.16%的肝癌組織細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，由此可見(jiàn)ZBP-89在肝癌組織中的表達(dá)明顯低于其在癌旁組織中的表達(dá)。查閱相關(guān)文獻(xiàn)顯示[11]：肝癌組織中的ZBP-89的過(guò)度表達(dá)可能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。而相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在細(xì)胞水平上可以上調(diào)ZBP-89的表達(dá)。本研究在組織學(xué)上進(jìn)一步驗(yàn)證了HIF-1α和ZBP-89的關(guān)系，二者在肝癌組織細(xì)胞中呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。

由此可見(jiàn)，以HIF-1α/Notch1通路為腫瘤治療的靶點(diǎn)，可更有效地消除肝癌干細(xì)胞，提高肝癌的治療效果。ZBP-89表達(dá)上調(diào)后肝癌干細(xì)胞標(biāo)記物EpCAM、CD13的表達(dá)減少，HIF-1α和Notch1的表達(dá)也顯著降低，因此，我們推測(cè)ZBP-89很可能為肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中一個(gè)潛在的抑癌基因。通過(guò)抑制HIF-1α/Notch1通路進(jìn)而抑制肝癌干細(xì)胞增殖、增強(qiáng)肝癌干細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，可能是其發(fā)揮抑癌效應(yīng)的重要機(jī)制。該研究有利于進(jìn)一步揭示ZBP-89的生物學(xué)功能，增強(qiáng)其對(duì)肝癌預(yù)后判斷的準(zhǔn)確性，有望為肝癌治療提供新的思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]Su Y，Cheng R，Zhang J，et al.Interferon-α2b gene-modified human bone marrow mesenchymal stem cells inhibit hepatocellular carcinoma by reducing the Notch1 levels[J].Life Sci，2015， 15（143）：18-26.

[2]Xiao YF，Yong X，Tang B，et al.Notch and Wnt signaling pathway in cancer：Crucial role and potential therapeutic targets[J].Int J Oncol，2016，48（2）：437-449.

[3]Wang R，Sun Q，Wang P，et al.Notch and Wnt/β-catenin signaling pathway play important roles in activating liver cancer stem cells[J].Oncotarget，2015，7（5）：5754-5768.

[4]Mu X，Espanol-Suner R，Mederacke I，et al.Hepatocellular carcinoma originates from hepatocytes and not from the progenitor/biliary compartment[J].J Clin Invest，2015，125（10）：3891-3903.

[5]Yang SL，Liu LP，Niu L，et al.Downregulation and pro-apoptotic effect of hypoxia-inducible factor 1 alpha in hepatocellular carcinoma[J].Oncotarget，2016，7（23）：3457l-34581.

[6]Cai MY，Imo RZ，Li YH，et al.High-expression of ZBP-89 correlates with distal metastasis and poor prognosis of patients in clear cell renal cell carcinoma[J].Biochem Biophys Res commun，2012，426（4）：636-642.

[7]Thienpont B，Steinbacher J，Zhao H，et al.Tumour hypoxia causes DNA hypermethylation by reducing TET activity[J].Nature，2016，17，537（7618）：63-68.

[8]Yu Y，Wang YY，Wang YQ，et al.Antiangiogenic therapy using endostatin increases the number of ALDH+ lung cancer stem cells by generating intratumor hypoxia[J].Sci Rep，2016（6）：34239.

[9]Chen YL，Chen PM，Lin PY，et al.ABCG2 Overexpression Confers Poor Outcomes in Hepatocellular Carcinoma of Elderly Patients[J].Anticancer Res，2016，36（6）：2983-2988.

[10]Semenza GL.Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine[J].Cell，2012，148（3）：399-408.

收稿日期：2019-7-5;修回日期：2019-7-15

編輯/肖婷婷