基于功能化的納米銳鈦礦TiO2膜修飾電極的烏藥醚內(nèi)酯電化學(xué)傳感器及其應(yīng)用研究

余麗雙，孫照霞，陳 莉，林 曉，賴 昕

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建，福州 350122）

烏藥為樟科植物烏藥Lindera aggregata(Sims)Kosterm的干燥塊根。烏藥根主要由異喹啉類生物堿及呋喃倍半萜成分組成，其中最為主要活性成分的烏藥醚內(nèi)酯就屬于呋喃倍半萜類?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，烏藥具有廣泛的藥理活性[1-2]，主要有順氣止痛、溫腎散寒等功效。

目前，對于烏藥中烏藥醚內(nèi)酯的含量測定及成分鑒定方法主要是高效液相色譜法和近紅外光譜法等[3-7]，例如余翠琴等[3]采用反相高效液相色譜法測定天臺烏藥中的烏藥醚內(nèi)酯；鄧桂明等[6]運(yùn)用超高效液相色譜-電離子噴霧-質(zhì)譜/質(zhì)譜法研究烏藥化學(xué)成分；杜偉鋒等[7]利用近紅外光譜法快速測定烏藥中烏藥醚內(nèi)酯的含量。但上述方法無法實(shí)現(xiàn)在線快速地檢測及鑒定，因此建立一種快速、在線、高靈敏的分析方法將具有很大的應(yīng)用價(jià)值。

電化學(xué)分析法具有檢測時(shí)間短、操作簡便、成本低、便于微型化等諸多優(yōu)勢，有望在快速、在線、高靈敏準(zhǔn)確監(jiān)測食品和藥品安全上獲得突破[8-10]。但烏藥醚內(nèi)酯本身沒有電活性，無法直接利用電化學(xué)方法進(jìn)行測定。筆者查閱相關(guān)文獻(xiàn)未見采用電化學(xué)分析法測定烏藥醚內(nèi)酯的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將功能化的納米銳鈦礦TiO2（介籠結(jié)構(gòu)）修飾電極作為烏藥醚內(nèi)酯電化學(xué)傳感器的氧化還原探針，構(gòu)建烏藥醚內(nèi)酯電化學(xué)傳感器用于檢測烏藥中烏藥醚內(nèi)酯的含量并快速鑒別烏藥與其偽品荊三棱藥材。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

CHI660C型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；舒美KQ116超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；雷磁PHS-3C型精密酸度計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；XS105電子分析天平（Mettler Toledo）； CJJ79-1磁力加熱攪拌器（金壇市白塔新寶儀器廠）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；TGL-16G臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；TECNAI G2F20 場發(fā)射透射電子顯微鏡（美國FEI公司）。

三電極體系：功能化的納米二氧化鈦膜修飾金電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極。

1.1.2 試劑

烏藥醚內(nèi)酯（中國藥品生物制品有限公司）；烏藥藥材（河南省懷化市）；荊三棱藥材（江西青春康源中藥飲片有限公司）；MPS（阿拉丁公司）；TiO2由福建師范大學(xué)洪振生副教授提供[11]；不同pH值不同濃度的磷酸鹽緩沖液、甲醇、乙酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

實(shí)驗(yàn)中所用水均為二次蒸餾水，經(jīng) Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）處理。

1.2 電極修飾液的制備

功能化納米TiO2的制備方法在文獻(xiàn)[12]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改動，具體方法如下，在1.0 mL 1.0 mo1/L HAc溶液中(含94%甲醇、5%二次水、1%MPS)加入 1.0 mL TiO2（0.5%）溶液，應(yīng)用磁力攪拌器攪拌2 h，離心收集TiO2并用無水甲醇洗3次，再分散到2 mL的蒸餾水中待用。

1.3 烏藥醚內(nèi)酯電化學(xué)傳感器的制備

金電極在修飾前，依次用1.0，0.3，0.05 μm的α-Al2O3粉末在專業(yè)拋光布上拋光成鏡面，每次打磨后置蒸餾水中超聲清洗。將處理好的電極置于含5 Mm K3Fe(CN)6鐵氰化鉀的0.5 M KCl溶液中，采用三電極系統(tǒng)（金電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲為輔助電極），在掃描電壓-1 ～+0.8 V用循環(huán)伏安法（CV）進(jìn)行掃描，根據(jù)氧化還原峰電位差判斷電極拋光程度，若符合要求則進(jìn)行活化?；罨?.5 mol/L的硫酸溶液，在掃描電壓0 ～+1.7 V用循環(huán)伏安法（CV）進(jìn)行掃描，直到峰電流不再增加。

用微量進(jìn)樣器取12 μL修飾液滴涂于預(yù)處理好的金電極表面，室溫下自然晾干即制得功能化的二氧化鈦膜修飾金電極即烏藥醚內(nèi)酯電化學(xué)傳感器。

1.4 烏藥醚內(nèi)酯對照品溶液的制備

精密稱取烏藥醚內(nèi)酯對照品適量，用甲醇溶解并制成濃度為1.0 mg/mL的對照品儲備液，檢測時(shí)用支持電解質(zhì)稀釋到一定的濃度。

1.5 烏藥及荊三棱藥材藥品處理

平行稱取6份烏藥藥材粉末和一份荊三棱藥材粉末（過80目篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，浸泡30 min，100 Hz超聲提取30 m，搖勻，濾過。將濾液蒸干，殘?jiān)眉状紡?fù)溶并定容于5 mL容量瓶中，然后過0.22 μm微孔濾膜，備用。

1.6 電化學(xué)方法

以pH為8.0的0.1 M磷酸二氫鈉-0.1 M磷酸氫二鈉緩沖溶液為支持電解質(zhì)，采用三電極系統(tǒng)，用差分脈沖伏安法對烏藥醚內(nèi)酯在修飾電極上的電化學(xué)行為進(jìn)行研究并對其進(jìn)行定量測定。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 納米二氧化鈦的表征

納米二氧化鈦透射電鏡（TE M）表征結(jié)果如圖1所示，所合成的納米二氧化鈦為介籠結(jié)構(gòu)，有很好的微孔結(jié)構(gòu)和大的比表面積[11]。

圖1 納米TiO2的TEM圖Fig.1 TEM of nano TiO2

2.2 電極的電化學(xué)特性

分別以裸金電極和功能化的納米 TiO2修飾金電極作為工作電極，在不同緩沖體系下，并于-0.4 ～+0.6 V電位區(qū)間內(nèi)進(jìn)行CV掃描。圖2中a是功能化的納米 TiO2修飾金電極在 0.1 M PBS（pH=8.0）緩沖溶液中的CV圖，曲線b和c分別是功能化的納米 TiO2修飾金電極和裸金電極在含12 μg/mL的烏藥醚內(nèi)酯的0.1 M PBS（pH=8.0）緩沖溶液中的CV圖。從圖可以看出，烏藥醚內(nèi)酯在裸金電極上無氧化還原峰（曲線 c）；功能化的納米 TiO2修飾金電極在空白溶液中出現(xiàn)一對較好的氧化還原峰（曲線a），這說明功能化的納米TiO2具有較好的電化學(xué)活性；當(dāng)加入烏藥醚內(nèi)酯對照品后，修飾電極的電流響應(yīng)變低（曲線 b），這可能是由于功能化的納米 TiO2對烏藥醚內(nèi)酯具有較強(qiáng)的吸附作用，但由于在該緩沖體系下，烏藥醚內(nèi)酯無電化學(xué)活性，其吸附于電極上阻礙了電子的傳輸從而使得峰電流值明顯減小。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，修飾電極的峰電流隨著烏藥醚內(nèi)酯濃度的增大而逐漸減小，且峰電流差值（與修飾金電極在空白溶液中的峰電流對比）與烏藥醚內(nèi)酯濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，因此可實(shí)現(xiàn)烏藥醚內(nèi)酯的測定。另外多次循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)修飾電極的氧化峰的峰電流值更加穩(wěn)定，峰型更加理想，故而選擇氧化峰的峰電流值進(jìn)行烏藥醚內(nèi)酯的定量測定。且每次測量后，需將三電極系統(tǒng)取出并沖洗，然后在-0.4 ～+0.6 V電位區(qū)間內(nèi)于空白溶液中進(jìn)行CV掃描，循環(huán)10周即可恢復(fù)使用。

圖2 功能化的納米TiO2膜修飾金電極與裸金電極在不同緩沖體系下的CV圖Fig.2 CV of functionalized nano-TiO2 modified electrode and bare gold electrode in different buffer systems

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1 電極修飾液用量的優(yōu)化

通過對功能化的納米二氧化鈦電極修飾液的用量進(jìn)行了優(yōu)化選擇，考察了不同修飾液用量(6～20 μL)對測定的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，峰電流值開始隨修飾液用量增多而增大，當(dāng)修飾液用量為12 μL時(shí)峰電流值最大，而超過12 μL時(shí)，修飾液增多峰電流值反而減小，故選擇最優(yōu)修飾用量為12 μL。

2.3.2 支持電解質(zhì)的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了烏藥醚內(nèi)酯在不同pH的B-R緩沖，磷酸鹽緩沖，硼砂-硼酸緩沖，乙酸-乙酸鈉緩沖，檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖等緩沖溶液中的 DPV行為，結(jié)果表明在固定其他測定條件的情況下，磷酸鹽緩沖作為支持電解質(zhì)所得到的峰電流值最大且峰型理想，所以選擇磷酸鹽緩沖液作為支持電解質(zhì)。

2.3.3 磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖pH的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了烏藥醚內(nèi)酯在 0.1 M 磷酸二氫鈉-0.1 M 磷酸氫二鈉的不同pH（6.5～9.0）的緩沖溶液中的DPV行為，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)pH在6.5～8.0之間，電極氧化峰電流值隨pH值的增大而增大，當(dāng)pH為8.0時(shí)，峰電流值最大，當(dāng)pH大于8.0時(shí)，峰電流值變小，因而選擇pH=8.0為最佳酸度。

2.3.4 儀器參數(shù)的優(yōu)化

DPV的儀器參數(shù)影響測試的靈敏度和分辨率，實(shí)驗(yàn)考察了不同 DPV儀器參數(shù)對烏藥醚內(nèi)酯測定的影響。綜合考慮峰電流的大小、峰的形狀和分析的速度，選擇的最佳儀器參數(shù)見下表 1。最優(yōu)條件下測定烏藥醚內(nèi)酯對照品的DPV圖如圖3所示。

表1 烏藥醚內(nèi)酯測定最佳DPV參數(shù)表Table 1 The optimum instrumental parameters for the determination of linderane by DPV

圖3 最優(yōu)條件下測定烏藥醚內(nèi)酯對照品的DPV圖Fig.3 DPV of linderane under optimal conditions

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 電極重現(xiàn)性

平行制備6根金電極，測定同份一樣品，測得RSD為0.79%，說明修飾膜在電極表面是比較均勻和穩(wěn)定的，表明電極重現(xiàn)性良好。

2.4.2 工作曲線與檢測限

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行測定分析，得到的工作曲線為：Ip(μA)=153.76-6.7952c(μg/mL)，相關(guān)系數(shù) r為 0.9996，檢測限為 0.058 μg/mL，定量限為 0.1 μg/mL。結(jié)果表明：烏藥醚內(nèi)酯在濃度為0.1 ～20 μg/mL的范圍內(nèi)，峰電流差值（與修飾金電極在空白溶液中的峰電流對比）與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.4.3 儀器精密度

按“1.4”項(xiàng)下方法制備含15 μg/mL的烏藥醚內(nèi)酯對照品溶液，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下重復(fù)測定6次，實(shí)驗(yàn)測得RSD為4.39%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.4 方法重復(fù)性

取烏藥藥材，按“1.5”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份進(jìn)行分析，測得RSD為2.08%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率

為了能夠更好地研究功能化的納米二氧化鈦膜修飾金電極對烏藥醚內(nèi)酯實(shí)際樣品的分析，我們對處理好的烏藥樣品進(jìn)行了加樣回收率的測定，加樣回收率平均值為98.33%，RSD為2.61%，測試結(jié)果如表2所示。

表2 加樣回收率測定結(jié)果Table 2 The results of spiked sample recovery rate

2.5 實(shí)際樣品測定

為了檢驗(yàn)功能化的納米二氧化鈦膜修飾金電極是否可以用于烏藥藥材中烏藥醚內(nèi)酯的含量測定，在最佳條件下，實(shí)驗(yàn)測定了平行6份樣品中烏藥醚內(nèi)酯的含量，求出平均值為0.303 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=2.53%（n=6），測試結(jié)果如表3所示。

表3 烏藥藥材中烏藥醚內(nèi)酯的含量測定結(jié)果Table 3 The results of the content of linderane in Scirpus maritimus L.

2.6 烏藥與其偽品荊三棱的快速鑒別

烏藥為常用中藥，有溫腎散寒、順氣、止痛的功效。今發(fā)現(xiàn)有以莎草科植物荊三棱根莖的切片充作烏藥使用的情況，現(xiàn)有文獻(xiàn)[13-15]有對荊三棱偽品進(jìn)行性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別的方法記載，未見應(yīng)用電化學(xué)方法進(jìn)行荊三棱偽品的鑒別，本研究采用電化學(xué)方法鑒別荊三棱偽品，操作簡便，檢測迅速，檢測結(jié)果如圖4所示。由圖可得，烏藥藥材在+0.24 V位置出峰，而烏藥偽品荊三棱藥材沒有出峰，由電化學(xué)檢測圖譜即可實(shí)現(xiàn)烏藥與其偽品荊三棱的快速鑒別。

圖4 烏藥與荊三棱藥材DPV圖Fig.4 DPV of Scirpus maritimus L.and its counterfeit Scirpus yagara Ohwi

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)將納米二氧化鈦進(jìn)行功能化，采用滴涂法制備功能化的納米二氧化鈦膜修飾金電極，將其應(yīng)用于烏藥醚內(nèi)酯的電化學(xué)測定，相對于裸金電極，修飾電極具有更好的電化學(xué)信號。將修飾電極用于烏藥藥材中烏藥醚內(nèi)酯的含量測定，加標(biāo)回收率為95.82%～101.1%，說明本方法準(zhǔn)確、可行。應(yīng)用電化學(xué)方法，根據(jù)電化學(xué)譜圖可以實(shí)現(xiàn)烏藥與其偽品荊三棱藥材的快速鑒別，檢測迅速，操作簡便。該修飾電極制作簡單、重復(fù)性好，具有廣闊的應(yīng)用前景。