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    LC-MS/MS法測(cè)定毛曼陀羅中莨菪堿、東莨菪堿和山莨菪堿的含量

    2019-09-09 05:33:16范惠珍
    關(guān)鍵詞:莨菪東莨菪堿曼陀羅

    陳 靜 ,張 鳳 ,張 銳 ,李 卿 ,范惠珍

    (1.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院,江西,宜春 336000; 2.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院藥材科,上海 20003)

    曼陀羅亦稱“風(fēng)茄兒”,為茄科曼陀羅屬,一年生草本植物。它是一種歷史悠久的藥用植物,分布廣泛,可用于治療關(guān)節(jié)痛、哮喘、咳嗽、胃腸痙攣、神經(jīng)性偏頭痛、止痛、痛風(fēng)、燙傷、潰瘍、狂躁、癲癇癥、抑郁癥、風(fēng)濕癥、抽搐、跌打損傷等癥。生物堿莨菪烷類是曼陀羅中的主要化學(xué)成分。也是其主要的毒性以及活性成分[1],并且活性比較高。其中莨菪堿、東莨菪堿、山莨菪堿等生物堿具有解痙陣痛、止咳平喘、麻醉鎮(zhèn)靜的功效[2],并可用于緩解內(nèi)臟絞痛[3],但對(duì)人有劇毒,中毒多見(jiàn)于兒童誤食曼陀羅、莨菪等植物的花果所致[4]。曼陀羅中毒的主要表現(xiàn)有口渴舌燥、發(fā)音嘶啞、顏面潮紅、頭暈惡心、嘔吐、煩躁不安、語(yǔ)無(wú)倫次、瞳孔散大、視物模糊、抽搐痙攣等[5]癥狀。

    曼陀羅具有多種生物活性,可廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)林業(yè)中。隨著對(duì)其藥理作用的不斷研究,發(fā)現(xiàn)其諸多的藥用價(jià)值,讓莨菪堿更廣泛地在臨床上與醫(yī)學(xué)上應(yīng)用,也讓其需求量迅速地增長(zhǎng)[2]。已經(jīng)有研究利用曼陀羅毛狀根部生產(chǎn)生物堿的報(bào)道[6],曼陀羅成分復(fù)雜繁多,使用傳統(tǒng)的方法 TLC、HPLC、GC-MS等把莨菪堿類完全分離是非常困難的。本研究建立LC-MS/MS方法對(duì)曼陀羅中的莨菪堿、東莨菪堿和山莨菪堿的含量進(jìn)行測(cè)定,研究結(jié)果顯示,該方法簡(jiǎn)便,靈敏度、重復(fù)性好,用時(shí)較短,可用于其含量的測(cè)定,值得進(jìn)一步推廣。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 儀器

    安捷倫1200液相色譜-G6410A三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent,美國(guó)),包含G1311A輸液泵,G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器,G1316A柱溫箱,DAD檢測(cè)器,G1314BVWD檢測(cè)器,MassHunter軟件控制系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理工作站(Agilent,美國(guó));labnet定時(shí)可調(diào)速旋渦混合器(labnet,美國(guó));超聲儀(SK7200H型,上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司);Eppendorf移液器(100、200、1000 μL,德國(guó));容量瓶。

    1.2 藥材及試劑

    標(biāo)準(zhǔn)品:莨菪堿、東莨菪堿、山莨菪堿、華法林(上海銳生物科技有限公司)純度98%)。

    待測(cè)物:曼陀羅的毛狀根部(12個(gè)不同批次)(上海長(zhǎng)征醫(yī)院藥材科李卿副教授提供),甲醇(Merck,德國(guó))、甲酸(Merck,德國(guó))、乙腈(Merck,德國(guó))、水(屈臣氏)、鹽酸(上海裕納有限公司)、濃氨水(分析純)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 質(zhì)譜條件

    電噴霧離子源(ESI):正離子;毛細(xì)管電壓:4000 V;截取錐電壓:60 V;氣體溫度 :350 ℃;氣體流速:10 L/min。待測(cè)物以及內(nèi)標(biāo)華法林的MRM模式參數(shù)如表1。

    表1 質(zhì)譜條件Table 1 The conditions of mass spectrometry

    2.2 色譜條件

    色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm,3.5 μm),流動(dòng)相:乙腈-(0.05%甲酸)水溶液=68:32;柱溫:25 ℃;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣量:2 μL;單針時(shí)間:3 min

    2.3 供試品溶液的制備

    精密稱取50 mg用蒸餾水沖洗干凈并且用濾紙吸去多余水分,50℃烘至恒重的毛狀根樣品,研磨成干粉;加入10 mL鹽酸,超聲30 min,冷卻、過(guò)濾,再用10 mL鹽酸分三次洗滌濾渣;與上述過(guò)濾液合并,用濃氨水調(diào)節(jié)pH=9,超聲45 min;再加6 mL三氯甲烷,充分振蕩;冷凍干燥(20 ℃,2000 rmp)殘留物溶于2 mL三氯甲烷中(有黃色不容物,超聲3 min)12000 rpm離心5 min,吸取上清液20 μL用甲醇稀釋10倍,備用。

    2.4 對(duì)照品溶液的制備

    2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品母液的配制

    分別精密稱取莨菪堿 0.9 mg、東莨菪堿0.64 mg、山莨菪堿0.88 mg,用甲醇定容至2 mL,作為標(biāo)準(zhǔn)品母液,備用。

    2.4.2 線性溶液的配制

    將標(biāo)準(zhǔn)品莨菪堿、東莨菪堿、山莨菪堿母液用甲醇稀釋成濃度分別1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000的混標(biāo)溶液,備用。

    2.4.3 內(nèi)標(biāo)的配制

    精密取適量標(biāo)準(zhǔn)品華法林用甲醇溶解配制成10 ng/mL,備用。

    2.5 線性關(guān)系的建立

    按照上述2.1與2.2的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,對(duì) 2.4.2下的濃度梯度進(jìn)行測(cè)定,以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,莨菪堿、東莨菪堿、山莨菪堿的線性回歸方程分別是 Y=813.8904X+2165.3000(R2=0.9922)、Y=714.1221X+517.4311(R2=0.9892)、Y=872.9971X+1024.4247(R2=0.9952),分別在 1~200、1~1000、1~1000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    2.6 專屬性的實(shí)驗(yàn)

    取適量供試品、對(duì)照品、陰性對(duì)照溶液各1份,按上述2.1與2.2的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。在同一檢測(cè)條件下,陰性對(duì)照無(wú)明顯干擾,對(duì)照品與供試品在相同的出峰時(shí)間分別出現(xiàn)了莨菪堿、東莨菪堿、山莨菪堿色譜峰,出峰時(shí)間均在1 min左右,用時(shí)比較短,分離度高。各成分的色譜圖如圖1、圖2、圖3:

    圖1 樣本的色譜圖Fig.1 Chromatogram map of the sample

    圖2 混標(biāo)的色譜圖Fig.2 Chromatogram map of the scopolamine

    圖3 為陰性對(duì)照色譜圖Fig.3 Chromatogram map of blank

    2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

    精密稱取6份相同量的供試品,分別加入相同量的對(duì)照品,按上述2.3的方法制備供試品,按照2.1與2.2的測(cè)定條件下進(jìn)行測(cè)定,記錄各待測(cè)成分的峰面積。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,6份供試品中莨菪堿、東莨菪堿、山莨菪堿的平均加樣回收率分別為:97.17%;97.20%;92.68%;RSD 分別為 1.02%、1.31%、1.41%。RSD≤2,說(shuō)明樣本的處理過(guò)程影響小,測(cè)定方法的準(zhǔn)確度高,結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 三種成分加樣回收率的測(cè)定結(jié)果Table 2 The results 0f 3 samples recovery test

    2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

    同一環(huán)境下,同一個(gè)操作人員,取6份供試品,分別加入相同量的對(duì)照品,按上述 2.1.1的方法制備供試品,在上述2.2與2.3的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,記錄各待測(cè)成分的峰面積。一份供試品連續(xù)進(jìn)樣6次,分別記錄供試品莨菪堿、東莨菪堿、山莨菪堿的峰面積。RSD分別為1.38%、1.31%、1.21%。說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性比較好。

    2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

    相同條件下,同一個(gè)操作人員,取同一份供試品,按上述2.1.1方法制備供試品溶液,在上述2.2與2.3的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣,記錄峰面積,結(jié)果表明供試品中的3種成分性質(zhì)在24 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定,RSD≤2,說(shuō)明該方法對(duì)24 h內(nèi)的供試品測(cè)定是穩(wěn)定的,結(jié)果如表3。

    表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(ng/mL)Table 3 The results of stability experiments

    2.10 樣本測(cè)定的結(jié)果

    采用上述建立的 LC-MS含量測(cè)定方法,測(cè)定12份不用批次的供試品毛曼陀羅中三種成份的含量,按照上述2.3方法進(jìn)行處理,在上述2.1與2.2的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,每份供試品重復(fù)進(jìn)樣3次,其平均值作為曼陀羅中莨菪堿、東莨菪堿、山莨菪堿的含量,結(jié)果見(jiàn)表4。

    表4 曼陀羅中3種成分的濃度分別為(ng/mL)Table 4 The contents of various compounds in 3 mandola

    3 討論

    曼陀羅中莨菪堿含量的測(cè)定方法目前有酸堿滴定法[8]、反相離子對(duì)液相色譜法(GC-MS)[9]、高效相色譜法(HPLC)[10]和氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[11]等。近年來(lái),醫(yī)療行業(yè)主要采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定曼陀中莨菪堿的含量,但是此方法的靈敏度比較差[7],對(duì)流動(dòng)相的要求比較繁瑣[12]。本研究建立 LC-MS/MS方法用于測(cè)定曼陀羅毛根部莨菪堿的含量,該方法不僅靈敏度好,流動(dòng)相僅是采用等度的乙腈-(0.05%甲酸)水溶液=68:32,出峰時(shí)間短,實(shí)驗(yàn)用時(shí)較少,操作簡(jiǎn)單,并且靈敏度高。

    莨菪堿類為典型的生物堿類,按傳統(tǒng)的生物堿的提取方法,色譜圖出現(xiàn)雜峰較多且分離度不好。本實(shí)驗(yàn)采用了酸提取,提取回收率比較高,由于酸提取后過(guò)濾困難,因此本實(shí)驗(yàn)又分別試了甲醇和三氯甲烷,再進(jìn)行提取過(guò)濾,結(jié)果三氯甲烷提取回收率高于甲醇,故選擇三氯甲烷作為再提取過(guò)濾的溶媒。本試驗(yàn)采用鹽酸、濃氨水、三氯甲烷的萃取方法進(jìn)行提取,不僅提取回收率高,色譜圖也比較簡(jiǎn)單,該方法適合用于曼陀羅中生物堿的提取與分離。

    本實(shí)驗(yàn)采用的是色譜柱 Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm,3.5 μm),對(duì)酸性、堿性化合物都表現(xiàn)出很好的分離性能,且分離度比較高。采用此色譜柱不僅出峰時(shí)間比較早且峰型好,沒(méi)有出現(xiàn)拖尾及裂峰等現(xiàn)象。由于上述樣本處理中采用了甲醇對(duì)樣本進(jìn)行稀釋,為了避免溶劑效應(yīng),標(biāo)準(zhǔn)品以及內(nèi)標(biāo)均采用甲醇進(jìn)行溶解。

    本研究建立的LC-MS/MS的方法能夠很好的將曼陀羅中的莨菪堿、東莨菪堿和山莨菪堿提取與分離,此方法操作簡(jiǎn)單且重復(fù)性好,回收率高,可以用于曼陀羅中莨菪堿、東莨菪堿和山莨菪堿含量的測(cè)定。

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