多指標(biāo)綜合評分法正交試驗優(yōu)選紅芽姜制半夏的炮制工藝

賴 昕，嚴國鴻，張 華，劉永靜，徐 偉，褚克丹，孫承韜

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建，福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建，福州 350004）

半夏（Pinelliae Rhizoma）為天南星科植物半夏（Pinellia ternata(Thunb.) Breit.）的干燥塊莖，性溫、味辛，具有燥濕化痰、降逆止嘔的功效，有微毒性，故臨床上多使用其炮制品。其中，姜半夏是半夏炮制品中最為常用的品種，生半夏炮制為姜半夏后，能緩和藥性，具有降低唇舌刺痛腫脹、咽喉腫痛、嘔吐或腹瀉等毒副作用[1]，同時增強降逆止嘔作用，故其臨床應(yīng)用廣泛。輔料姜為藥食同源物質(zhì)，是臨床常用中藥，也是中藥炮制的主要輔料。紅芽姜作為姜的主要來源之一，在福建栽培歷史悠久，品質(zhì)優(yōu)良，纖維少，它是制備姜汁的優(yōu)質(zhì)原料[2]。福建以紅芽姜為炮制輔料的姜半夏品質(zhì)優(yōu)，質(zhì)量穩(wěn)定，占廣藥供應(yīng)量的10%。其中，6-姜酚為生姜中含量最高的姜酚類化合物，具有抗炎、抗氧化等藥理作用，亦是起到止嘔功效的活性物質(zhì)[3-4]。同時，中國藥典將白礬限量作為姜半夏的檢查項目。

2015年版《中國藥典》中姜半夏的炮制方法無明確的工藝參數(shù)，缺乏客觀、量化的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究以6-姜酚含量、有機酸含量和白礬殘留量為考察指標(biāo)，通過正交試驗法考察紅芽姜的用量、白礬用量和煮制時間，結(jié)合多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)選紅芽姜制半夏的最佳炮制工藝，從而確定炮制工藝參數(shù)，為紅芽姜制半夏飲片的加工和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(美國Thermo Scientific公司，UltiMate3000型)；Milli-Q純水器(美國millipore公司)；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，CAP225D型）；精密酸度計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司，PHS-3C型）；箱式電阻爐（上海鉅晶精密儀器制造有限公司，SXL-1200C型）；數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，KQ-500DE型）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司，HH-Z型）；磁力攪拌器（常州市金壇區(qū)環(huán)宇科學(xué)儀器廠，79-1型）；電熱套（天津泰斯特儀器有限公司，98-I-B型）。

1.2 藥材

生半夏和紅芽姜均來自福建承天藥業(yè)有限公司，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院褚克丹教授鑒定為天南星科植物半夏（Pinellia ternata(Thunb.) Breit.）的干燥塊莖和姜科植物紅芽姜（Zingiber officinaleRosc.）的新鮮根莖。

1.3 試劑

6-姜酚（含量 ＞ 98%，批號：113429-201406，中國食品藥品檢定研究院）；琥珀酸對照品（批號：110896-201602，中國食品藥品檢定研究院）；含水硫酸鋁鉀[KAl(SO4)2·12H2O]（分析純，化學(xué)純度＞ 99.5%，上海麥克林生化科技有限公司）；乙腈為色譜純（德國 Merck公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 紅芽姜制半夏炮制工藝正交試驗設(shè)計及樣品制備

2.1.1 正交試驗因素水平

《中國藥典》2015年版中，姜半夏炮制輔料用量規(guī)定為：每100 kg凈半夏，用生姜25 kg、白礬12.5 kg。藥典未規(guī)定具體炮制時間，因此，本研究以姜半夏傳統(tǒng)炮制工藝為參考，根據(jù)現(xiàn)行方法結(jié)合前期試驗情況，對炮制過程中的紅芽姜用量（g）、白礬用量（g）及炮制時間（h）3個因素各選取 3個水平，依據(jù) L9(34)正交表進行正交試驗設(shè)計優(yōu)選紅芽姜制半夏的炮制工藝，各因素水平見表 1，炮制輔料用量按每100 g半夏藥材計。

2.1.2 紅芽姜制半夏炮制樣品制備

自制紅芽姜半夏依據(jù)《中國藥典》2015年版姜半夏項下制法進行炮制：稱取凈半夏，大小分開，用水浸泡至內(nèi)無干心時，取出；另取紅芽姜切片適量煎湯，加白礬適量與半夏共煮透（炮制），取出，晾至半干，干燥。按上述方法制備得不同因素水平紅芽姜制半夏炮制樣品。

表1 正交設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design

2.2 紅芽姜制半夏中6-姜酚含量的測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液（45:55）；檢測波長：282 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流速：0.8 mL·min-1；理論板數(shù)不低于 5000。在上述色譜條件下，6-姜酚成分峰能夠與其他雜質(zhì)成分完全分離，結(jié)果見圖1。

圖1 6-姜酚對照品（A）及紅芽姜制半夏炮制品（B）液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of 6-gingerol and processed products of Pinellia

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取6-姜酚對照品適量，加入甲醇制備成質(zhì)量濃度為0.53 mg·mL-1的對照品儲備液，精密移取對照品儲備液1.0 mL至25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，即得含有6-姜酚21.2 μg·mL-1的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

稱取干燥后的紅芽姜制半夏各炮制品粉末（過65目篩）5.0 g，置具塞錐形瓶中，加入10倍量甲醇超聲提取2次（功率500 W，頻率40 kHz），每次30 min，合并上清液，水浴濃縮后定容至50 mL，搖勻后0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液進行測定。

2.2.4 線性關(guān)系考察

取“2.2.2”項下對照品溶液分別按2、5、10、15、20 μL進樣測定峰面積，以對照品進樣量（μg）為橫坐標(biāo)X，色譜峰面積為縱坐標(biāo)Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程為：

結(jié)果表明6-姜酚在0.0424～0.4240 μg范圍內(nèi)，進樣量（μg）與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度考察

取“2.2.2”項下對照品溶液連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算 6-姜酚色譜峰面積的 RSD值為0.74%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性考察

取同一紅芽姜制半夏炮制品 6份，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液進樣分析，記錄6-姜酚色譜峰面積，計算 6-姜酚平均含量為0.0191%（0.191 mg·g-1），RSD 值為 1.54%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性考察

取同一紅芽姜制半夏炮制品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后的0、1、2、4、8、12、24 h進樣，計算6-姜酚色譜峰面積的RSD值為1.49%（n=7），表明所制備供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率考察

稱取已知6-姜酚含量（0.19 mg·g-1）的紅芽姜制半夏樣品3.0 g共6份，置于錐形瓶中，分別精密移取質(zhì)量濃度為0.53 mg·mL-1的6-姜酚對照品溶液1.0 mL，照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣分析，計算 6-姜酚的平均回收率為 98.15%，RSD值為1.88%（n=6）。

2.2.9 樣品含量測定

依據(jù)L9(34)正交表因素水平，取照“2.1”項下方法炮制的紅芽姜制半夏樣品，照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣，測算色譜峰面積，計算6-姜酚含量。

2.3 有機酸含量測定

本研究根據(jù)《中國藥典》中半夏項下的有機酸含量測定方法[5]，以琥珀酸作為對照品，對紅芽姜制半夏中的有機酸含量進行測定。

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)滴定液的配制

參照2015年版《中國藥典》（四部）所規(guī)定的配制方法[6]，分別配制氫氧化鈉滴定液（0.1 mol·L-1）和鹽酸滴定液（0.1 mol·L-1），備用。

2.3.2 對照品溶液的配制

取琥珀酸對照品102 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加入95%乙醇溶解后定容至刻度線，即得每1.0 mL含有1.02 mg的琥珀酸對照品溶液，備用。

2.3.3 供試品溶液的配制

稱取紅芽姜制半夏粉末（過65目篩）5.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入50 mL的乙醇回流提取3次，每次 1 h，放冷濾過，合并濾液，蒸干，殘留物精密加入氫氧化鈉滴定液（0.1mol·L-1）10 mL溶解，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min后轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加入新煮沸的冷水定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3.4 測定方法

按照2015年版《中國藥典》（四部）通則0701電位滴定法[6]測定，精密量取“2.3.3”項下供試品溶液25 mL，用鹽酸滴定液（0.1 mol·L-1）滴定。以鹽酸滴定液消耗的體積（V）為橫坐標(biāo)，以ΔE/ΔV（即相鄰 2次的電位差與加入滴定液的體積差之比）為縱坐標(biāo)，繪制滴定曲線。ΔE/ΔV的極大值對應(yīng)的體積即為滴定終點，滴定結(jié)果用空白試驗校正。計算得每1.0 mL氫氧化鈉滴定液（0.1mol·L-1）相當(dāng)于5.904 mg的琥珀酸（C4H6O4）。

2.3.5 精密度考察

精密量取“2.3.2”項下對照品溶液20 mL，加入氫氧化鈉滴定液（0.1 mol·L-1）10 mL，搖勻后用鹽酸滴定液（0.1 mol·L-1）滴定，記錄滴定終點所消耗鹽酸滴定液體積，滴定結(jié)果用空白試驗校正。平行5次試驗，計算RSD值為0.85 %（n=5），表明本方法精密度良好，符合要求。

2.3.6 重復(fù)性考察

取同一紅芽姜制半夏炮制品5.0 g，按“2.3.3”項下方法制備5份供試品溶液，照“2.3.4”項下方法測定，計算有機酸的平均含量為 0.8093%（8.093 mg·g-1），RSD 值為 0.74 %（n=5）,表明本方法重復(fù)性良好，符合測定要求。

2.3.7 穩(wěn)定性考察

取同一紅芽姜制半夏炮制品5.0 g，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，分別在制備后每隔 2 h測定1次，共測6次，計算RSD值為1.29 %（n=6），表明供試品溶液在制備后10 h內(nèi)穩(wěn)定，符合測定要求。

2.3.8 加樣回收率考察

稱取已知有機酸含量（8.09 mg·g-1）的紅芽姜制半夏樣品2.0 g共5份，置于錐形瓶中，分別精密移取質(zhì)量濃度為1.02 mg·mL-1的琥珀酸對照品溶液10 mL，之后按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，照“2.3.4”項下方法測定，計算有機酸的平均回收率為96.72 %，RSD值為1.69 %（n=5）。

2.3.9 樣品含量測定

依據(jù)L9(34)正交表因素水平，取照“2.1”項下方法炮制的紅芽姜制半夏樣品，照“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，照“2.3.4”項下方法測定并計算有機酸含量。

2.4 白礬含量測定

本研究根據(jù)《中國藥典》中清半夏項下的白礬限量測定方法[5]，以含水硫酸鋁鉀[KAl(SO4)2·12H2O]作為對照品，對紅芽姜制半夏中的白礬殘留量進行測定。

2.4.1 指示劑和滴定液的配制

參照2015年版《中國藥典》（四部）所規(guī)定的配制方法[6]，分別配制甲基紅、二甲酚橙指示液和鋅滴定液(0.05 mol·L-1) 、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA) 滴定液(0.05 mol·L-1)，備用。

2.4.2 供試品溶液的配制

稱取紅芽姜制半夏粉末（過65目篩）5.0 g，置坩堝中加熱至完全炭化后移入箱式電阻爐中450 ℃灰化4 h，取出待冷卻后在坩堝中加入稀鹽酸10 mL，用表面皿覆蓋坩堝水浴加熱 10 min后表面皿用5.0 mL熱水沖洗，洗液并入坩堝中，濾過，50 mL 水分次洗滌坩堝及殘渣，將洗液合并至濾液，加入0.025 %的甲基紅乙醇液1滴，滴加氨試液至溶液顯微黃色。加入醋酸-醋酸銨緩沖液（pH 6.0）20 mL，再精密加入 EDTA（0.0523 mol·L-1）25 mL，煮沸3～5 min，放冷，加二甲酚橙指示劑1.0 mL，即得供試品溶液。

2.4.3 測定方法

以鋅滴定液（0.0518 mol·L-1）滴定“2.4.2”項下供試品溶液自黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，滴定結(jié)果用空白試驗校正。計算得每 1.0 mL的乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）滴定液（0.05 mol·L-1）相當(dāng)于23.72 mg的含水硫酸鋁鉀（KAl（SO4）2·12H2O）。

2.4.4 精密度考察

精密稱定含水硫酸鋁鉀對照品 0.3 g，按“2.4.2”項下方法“加入稀鹽酸10 mL”起操作，記錄滴定終點所消耗鋅滴定液體積，滴定結(jié)果用空白試驗校正。平行5次試驗，計算RSD值為0.91 %（n=5），表明本方法精密度良好，符合要求。

2.4.5 重復(fù)性考察

取同一紅芽姜制半夏炮制品5.0 g，按“2.4.2”項下方法制備5份供試品溶液，照“2.4.3”項下方法測定，計算白礬的平均含量為7.951%（79.51 mg·g-1），RSD值為0.67 %（n=5），表明本方法重復(fù)性良好，符合測定要求。

2.4.6 穩(wěn)定性考察

取同一紅芽姜制半夏炮制品5.0 g，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，分別在制備后每隔 1 h測定1次，共測7次，計算RSD值為1.17 %（n=7），表明供試品溶液在制備后6 h內(nèi)穩(wěn)定，符合測定要求。

2.4.7 加樣回收率考察

稱取已知白礬含量（79.51 mg·g-1）的紅芽姜制半夏樣品2.0 g共5份，置于錐形瓶中，精密稱取含水硫酸鋁鉀對照品150 mg，之后按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.4.3”項下方法測定，計算白礬的平均回收率為97.53 %，RSD值為1.56 %（n=5）。

2.4.8 樣品含量測定

依據(jù)L9(34)正交表因素水平，取照“2.1”項下方法炮制的紅芽姜制半夏樣品，照“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.4.3”項下方法測定并計算白礬殘留量。

2.5 正交設(shè)計試驗和結(jié)果

按照“2.1”項下炮制方法，依據(jù)L9(34)正交表（表 1）的條件進行試驗，優(yōu)選紅芽姜制半夏的炮制工藝。選取紅芽姜用量（A）、白礬用量（B）及炮制時間（C）3個因素，以 6-姜酚、有機酸和白礬含量為指標(biāo)，采用多指標(biāo)綜合評分法對試驗結(jié)果進行分析，試驗采用“隸屬度”對指標(biāo)進行評價。對于以最大值為優(yōu)的指標(biāo)（如 6-姜酚含量），其指標(biāo)隸屬度為：（指標(biāo)值-指標(biāo)最小值）/（指標(biāo)最大值-指標(biāo)最小值）；對于以最小值為優(yōu)的指標(biāo)（白礬殘留量），其指標(biāo)隸屬度為：（指標(biāo)最大值-指標(biāo)值）/（指標(biāo)最大值-指標(biāo)最小值）

其中半夏所含的有機酸是產(chǎn)生其呼吸系統(tǒng)藥理作用（包括止咳、祛痰、平喘等）的主要有效成分[7]，6-姜酚則為炮制輔料紅芽姜中的主要有效成分，為含量最高的姜辣素類化合物，具有較高的生物活性[8]，均按40%的權(quán)重計分，白礬殘留量按20%的權(quán)重計分。因此，綜合分數(shù)=6-姜酚含量隸屬度×40%＋有機酸含量隸屬度×40%＋白礬殘留量隸屬度×20%，滿分為1。評分結(jié)果以綜合分數(shù)作為總指標(biāo)進行方差分析，正交試驗結(jié)果見表 2，各指標(biāo)方差分析見表3。

正交試驗和方差分析結(jié)果表明，各個因素對紅芽姜制半夏炮制工藝的影響順序是 A（紅芽姜用量）＞B（白礬用量）＞C（炮制時間）。其中，紅芽姜用量對試驗指標(biāo)的影響具有顯著性差異，白礬用量以及炮制時間均無顯著影響。L9(34)正交試驗的分析結(jié)果表明，綜合評分為0.6718的炮制工藝A3B3C2為最優(yōu)水平組合，但由表2可知，炮制時間（C列）的極差R值最小且其K1＞K2，綜合考慮實際生產(chǎn)省時方便，最終確定紅芽姜制半夏的炮制工藝為A3B3C1。即，優(yōu)選工藝為：每100 g凈半夏，加入紅芽姜30 g，白礬15 g，炮制時間為4 h。

表2 正交試驗結(jié)果表Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 各指標(biāo)方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.6 驗證試驗

取凈半夏，按正交試驗所優(yōu)選出的紅芽姜制半夏炮制工藝進行炮制，分別按上述方法測定有機酸含量、6-姜酚含量以及白礬殘留量，平行三次試驗，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示：經(jīng)過所優(yōu)選的炮制工藝（A3B3C1）炮制的紅芽姜制半夏中6-姜酚和有機酸含量高，白礬殘留量符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，各項指標(biāo)穩(wěn)定，達到預(yù)期結(jié)果，表明所優(yōu)選的工藝符合實際，可以作為紅芽姜制半夏的炮制方法

表4 工藝驗證試驗Table 4 Results of verification tests

3 討論

半夏為天南星科植物半夏（Pinellia ternata(Thunb.) Breit.）的干燥塊莖，臨床上多使用其炮制品，主要包括生半夏、清半夏、姜半夏和法半夏。其中，姜半夏是半夏炮制品中最為常用的品種，具有溫中化痰、降逆止嘔的功效。2015年版《中國藥典》雖記載了姜半夏的炮制方法，但各地藥材品質(zhì)差異較大，炮制過程影響因素較多，含量測定多限于有機酸而無生姜相關(guān)指標(biāo)成分；且對于其中的關(guān)鍵工藝：“另取生姜切片煎湯，加白礬與半夏共煮透”，詳于定性、略于定量，無明確的工藝參數(shù)（如煮制時間），缺乏客觀、量化的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

紅芽姜化學(xué)成分復(fù)雜，其中姜辣素類成分是姜屬植物中特有的成分，也是生姜中起抗炎、解熱、抗癌等作用的有效部位，其中6-姜酚含量最高[8]。本試驗選擇紅芽姜制半夏中6-姜酚的含量為有效成分指標(biāo)之一，采用HPLC法測定其含量，同藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相比較，使該飲片的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)更加客觀、量化。有機酸作為半夏的主要有效成分，具有鎮(zhèn)咳、平喘等多種生物活性[9]，半夏經(jīng)白礬炮制后，飲片中鋁殘留較高，若長期攝入過量鋁離子，容易誘發(fā)老年癡呆等疾病。

因此，本研究基于現(xiàn)行《中國藥典》規(guī)定的方法，利用正交設(shè)計法同時考察了紅芽姜制半夏中6-姜酚、有機酸和白礬殘留量3種指標(biāo)。其中6-姜酚和有機酸的含量宜高，而白礬的含量宜低，因此，通過多指標(biāo)綜合評分法設(shè)立“隸屬度”，再根據(jù)各項指標(biāo)對其炮制品質(zhì)量影響的重要程度，將6-姜酚和有機酸的權(quán)重比例均設(shè)為40%，白礬殘留量的權(quán)重比例設(shè)為20%，以此計算綜合評分（總分為1）。優(yōu)選出紅芽姜制半夏的最佳炮制工藝為：每100 g凈半夏，加入紅芽姜30 g，白礬15 g，炮制時間為4 h。優(yōu)選的姜半夏炮制工藝中，生姜與白礬用量均較藥典炮制方法有所增加，但使紅芽姜制半夏中的有效成分保持較高的含量，其中有機酸含量顯著高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，同時白礬殘留量低于藥典所規(guī)定的8.5%。本研究優(yōu)選的炮制工藝具有一定合理性，為紅芽姜制半夏飲片的加工提供理論依據(jù)，具有重要指導(dǎo)意義，同時測定了有效成分的含量為炮制工藝提供了定量指標(biāo)，為紅芽姜制半夏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定基礎(chǔ)。

致謝：本項目在福建省科技廳重點實驗室，福建省中藥資源研究與開發(fā)利用重點實驗室完成。