異歐前胡素對人胃癌BGC-823細胞的凋亡誘導作用的研究

王廷祥　婁國強　施軍平

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·論著·

異歐前胡素對人胃癌BGC-823細胞的凋亡誘導作用的研究

王廷祥婁國強施軍平

目的探討異歐前胡素對人胃癌BGC-823細胞的凋亡誘導作用。方法以體外培養(yǎng)人胃癌BGC-823細胞和裸鼠荷人胃癌模型為觀察對象，采用MTT法和Annexin V-FITC/PI雙染法觀察異歐前胡素對人胃癌BGC-823細胞的增殖存活率及誘導凋亡能力的影響，并且通過裸鼠成瘤實驗觀察異歐前胡素對BGC-823細胞的增殖生長情況。結(jié)果人胃癌BGC-823細胞系的增殖存活率隨著異歐前胡素濃度的提高或者處理時間的增加呈下降趨勢，增殖存活率與異歐前胡素呈劑量-時間依賴性；異歐前胡素可以明顯誘導BGC-823細胞發(fā)生凋亡，且在一定范圍內(nèi)隨著異歐前胡素濃度的提高，凋亡率也隨之升高；有效劑量的異歐前胡素瘤體內(nèi)注射能夠縮小裸鼠瘤體體積，增加瘤體抑制率，與對照組相比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論異歐前胡素能夠有效抑制人胃癌BGC-823細胞的增殖并誘導其凋亡，抑制胃癌細胞移植瘤的生長，但對于其具體的調(diào)控機制有待進一步研究。

異歐前胡素；胃癌；增殖；凋亡

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，盡管目前臨床上采取包括手術切除、化學治療、放射治療、基因治療等在內(nèi)的綜合治療策略，但胃癌患者的總體生存率仍然較低[1]。據(jù)中國腫瘤監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，目前胃癌居中國腫瘤發(fā)病譜第2位，腫瘤死因譜第3位[2-3]。因此，尋找新的高效、低毒藥物以及治療靶點在晚期胃癌的治療中顯得尤為迫切和重要。傳統(tǒng)中藥具有提高患者免疫功能，誘導腫瘤細胞凋亡，直接殺傷腫瘤細胞，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等多種機制[4-5]，因此，從天然物質(zhì)中尋找不良反應小、安全有效的抗腫瘤藥物是近年來的研究熱點。

異歐前胡素(Isoimpemtorin)屬于6，7-呋喃香豆素類(分子式：C16H14O4)，廣泛分布于植物界，尤其在傘形科常用中藥如白芷、獨活、前胡、羌活、北沙參等中含量豐富，并且是其主要的藥理效應成分。香豆素類化合物具有較高的應用價值和較多的生物學活性，目前研究發(fā)現(xiàn)異歐前胡素具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗腫瘤、舒張心血管等多種生物學特性，對多種腫瘤細胞系都具有明顯的凋亡誘導效果[6-7]。但目前關于異歐前胡素對人胃癌BGC-823細胞的凋亡誘導作用尚未見報道。因此，本研究以人胃癌BGC-823細胞作為研究對象，觀察異歐前胡素對其增殖、凋亡的影響。

1　材料

1.1動物及細胞株

6只雌性裸鼠，4～6周齡，質(zhì)量18～20 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，合格證號：SCXK(滬)2012-0002。人胃癌細胞株BGC-823細胞，購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.2藥品與試劑

GIBCO○RRPMI 1640細胞培養(yǎng)基(美國Invitrogen Life Technologies公司)；GIBCO○R胎牛血清(美國Invitrogen Life Technologies公司)；蛋白濃度測定試劑盒(美國Bio-Rad公司)；HRP標記的抗兔、抗小鼠免疫球蛋白G(IgG，北京中杉金橋生物技術有限公司)；抗鼠IgG(美國Millipore公司)；胰島素(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司)；蛋白酶抑制劑雞尾酒試劑盒(美國Pierce公司)；細胞培養(yǎng)皿、孔板(德國Greiner公司)；PVDF膜(美國Bio-Rad公司)；顯影定影液(美國Kodak公司)；MTT(美國Sigma公司)。動物實驗用異歐前胡素溶液(20 mg/mL)：稱取0.02 g異歐前胡素粉末，溶解于1 mL二甲基亞砜(DMSO)中，使用時用生理鹽水稀釋成不同劑量濃度，超聲助溶，分裝，室溫避光保存。

1.3儀器

倒置顯微鏡(德國Leica公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)；PURELAB Classic 純水系統(tǒng)(美國Pall公司)；CBN8-30型水浴鍋(美國Heto公司)；全波長酶標儀(美國Bio-Rad公司)；超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；Pico/Fresco離心機(德國Sorvall公司)；Legend RT低溫水平離心機(德國Sorvall公司)；BD FACSCalibur流式細胞儀、細胞獲取軟件及分析軟件(美國BD公司)。

2　方法

2.1細胞培養(yǎng)

將人胃癌BGC-823細胞接種于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，放入37℃、相對濕度90%、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長良好，呈單層貼壁生長，每2～3 d換液1次。實驗前在倒置顯微鏡下觀察，細胞形態(tài)良好，無退化，細胞長滿貼壁即可傳代，每3 d傳代1次，經(jīng)消化傳代后處于指數(shù)生長期備用。

2.2MTT法檢測人胃癌BGC-823細胞增殖抑制情況

取處于指數(shù)生長期的BGC-823細胞，將其鋪至96孔板，每孔10 000個細胞，在血清饑餓24 h后加入相應濃度的異歐前胡素處理24 h或48 h，經(jīng)藥物處理后各孔加入MTT(500 mg/L)100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后棄上清，加入DMSO 200 μL，搖床上輕輕振蕩待甲臜沉淀完全溶解。采用酶標儀檢測各孔OD值(490 nm)，根據(jù)公式：細胞抑制率=(OD對照組-OD給藥組)/OD對照組×100%，計算出各組細胞的增殖存活率。

2.3Annexin V-FITC/PI雙染法檢測人胃癌BGC-823細胞的凋亡

將對數(shù)生長期的細胞接種于六孔板，24 h后加入藥物進行處理，并用不含EDTA的胰酶消化收集細胞，然后用PBS緩沖液洗滌細胞2次，1 000 rpm離心5 min，吸除上清液，并按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書的要求進行操作。結(jié)果判斷：在雙變量流式細胞儀的散點圖上，以Annexin V-FITC為橫軸，PI為縱軸。左上象限為機械性損傷細胞；左下象限顯示活細胞，即(FITC-/PI-)；右上為晚期凋亡細胞或者壞死細胞，即(FITC+/PI+)；而右下象限為凋亡細胞，即(FITC+/PI-)。

2.4裸鼠成瘤實驗

將6只雌性裸鼠隨機分為觀察組(異歐前胡素10 mg/kg)和對照組(生理鹽水)，每組3只，稱量體質(zhì)量，編號；將BGC-823細胞重懸于無血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，按照2×106/鼠的細胞數(shù)量，接種于裸鼠俯臥位右前肢皮下；接種后72 h開始給藥，兩組裸鼠分別給予生理鹽水、異歐前胡素10 mg/kg進行處理，給藥方式為瘤內(nèi)注射[8]，每72 h給藥1次；每次給藥前測量腫瘤體積；連續(xù)給藥6次，停藥24 h后，稱量裸鼠體質(zhì)量，拍照并處死裸鼠，取出腫瘤組織進行稱量，腫瘤體積和腫瘤體積抑制率計算公式參考文獻[9]，具體如下：腫瘤體積V=L×I2×0.5，L為腫瘤長徑，I為腫瘤寬徑；腫瘤體積抑制率=[1-(觀察組平均腫瘤體積/對照組平均腫瘤體積)]×100%。

3　統(tǒng)計學方法

4　結(jié)果

4.1異歐前胡素對胃癌BGC-823細胞增殖抑制的影響

采用MTT法測定人胃癌BGC-823細胞在異歐前胡素處理下的細胞存活能力，觀察經(jīng)不同濃度異歐前胡素處理24 h和48 h的細胞增殖存活率，發(fā)現(xiàn)BGC-823細胞系的增殖存活率隨著異歐前胡素濃度的增加呈下降趨勢。見圖1。研究又觀察了采用10 μmol/L異歐前胡素處理不同時間后的細胞增殖存活率，發(fā)現(xiàn)BGC-823細胞系的增殖存活率隨著處理時間的增加呈下降趨勢。見圖2。

4.2異歐前胡素對胃癌BGC-823細胞凋亡的影響

上述MTT結(jié)果提示，異歐前胡素對BGC-823細胞的毒性與藥物濃度呈正比。進一步采用Annexin V-FITC/PI雙染法經(jīng)流式細胞儀檢測人胃癌BGC-823細胞經(jīng)不同濃度異歐前胡素處理6 h后的細胞凋亡情況。結(jié)果顯示，10 μmol/L組BGC-823細胞的凋亡率為10.77%，100 μmol/L組的

凋亡率為19.12%，兩組相比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖1不同濃度的異歐前胡素處理24 h和48 h后BGC-823細胞的增殖存活率

圖210 μmol/L異歐前胡素處理BGC-823細胞不同時間后的增殖存活率

圖3　Annexin V-FITC/PI雙染法檢測不同濃度異歐前胡素對人胃癌BGC-823細胞凋亡的影響

4.3異歐前胡素對胃癌BGC-823細胞移植瘤的影響

上述研究發(fā)現(xiàn)，異歐前胡素在體外對人胃癌BGC-823細胞具有存活抑制及誘導凋亡的作用。通過對裸鼠皮下注射BGC-823細胞建立了裸鼠荷人胃癌細胞動物模型。觀察10 mg/kg異歐前胡素對BGC-823細胞在裸鼠體內(nèi)增殖生長情況的影響。將人胃癌BGC-823細胞接種于裸鼠右下背側(cè)皮膚后，第3天均長出皮下結(jié)節(jié)，觀察組和對照組移植瘤體積均達100 mm3，且兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。之后觀察組每隔3 d予以10 mg/kg異歐前胡素行瘤內(nèi)注射，對照組予以相同劑量生理鹽水瘤內(nèi)注射。干預后，觀察組瘤體顯著被抑制，在第18天時，與干預前體積相比較，觀察組瘤體體積減小了43%，對照組瘤體體積減小了30%，兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。第18天時，觀察組瘤體的體質(zhì)量為(408±37.75) mg，對照組瘤體的體質(zhì)量為(727±110.48) mg，兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖4　兩組第18天時裸鼠成瘤的體積

5　討論

2015年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的全球腫瘤報告指出，胃癌在所有腫瘤類疾病中的病死率占第3位。在中國，胃癌的發(fā)病數(shù)與病死數(shù)均接近全球胃癌發(fā)病總數(shù)及病死總數(shù)的50%[10-11]。對于中晚期胃癌患者而言，即使進行了有效的外科手術切除，患者的臨床預后仍不佳，嚴重威脅著人們的健康和生命。在中國胃癌惡性程度較高，確診時大多已屬晚期，化學治療的效果較差，不良反應往往難以耐受，而且還存在腫瘤耐藥等問題，這已成為制約胃癌治療的一個瓶頸，因此，尋找新的高效、低毒藥物以及治療靶點顯得尤為重要。目前研究發(fā)現(xiàn)，中藥具有提高患者免疫功能，誘導腫瘤細胞凋亡，直接殺傷腫瘤細胞和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等多種機制[12]。異歐前胡素具有多種藥理學活性，尤其對多種腫瘤細胞系都具有明顯的凋亡誘導效果。有研究從杭白芷的抗腫瘤活性部位中分離出了異歐前胡素，并發(fā)現(xiàn)異歐前胡素與其他組分相比較，具有更強的抗腫瘤作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，杭白芷中的異歐前胡素能夠降低結(jié)腸癌HT-29細胞系中p53、Bcl-2及Bax基因表達，且能夠誘導細胞周期阻滯及細胞凋亡[13-14]。在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，異歐前胡素對人乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231，人肺癌細胞株A549，人卵巢癌細胞株SK-OV-3，人皮膚癌細胞株SK-MEL-2，人中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤細胞株XF498及人結(jié)腸癌細胞株HCT-15細胞均具有不同程度的抑制作用[15-16]。但目前關于異歐前胡素對人胃癌BGC-823細胞的凋亡誘導作用尚未見報道。

本研究通過形態(tài)學觀察與定量分析相結(jié)合的方法，對異歐前胡素在人胃癌BGC-823細胞中的凋亡誘導作用進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異歐前胡素對BGC-823細胞的存活具有明顯的抑制作用，且增殖存活率與異歐前胡素呈劑量-時間依賴性。本研究結(jié)果還提示，異歐前胡素可以明顯誘導BGC-823細胞發(fā)生凋亡，且在一定范圍內(nèi)隨著異歐前胡素濃度的提高，凋亡率也隨之升高。另外，本研究建立了裸鼠荷人胃癌BGC-823細胞的動物模型，發(fā)現(xiàn)異歐前胡素在裸鼠體內(nèi)可以有效抑制移植瘤的增殖和生長。

綜上所述，雖然本研究證實了異歐前胡素能夠有效抑制人胃癌BGC-823細胞的增殖并誘導其凋亡，抑制胃癌細胞移植瘤的生長，但對于其具體的調(diào)控機制仍有待進一步研究。

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(本文編輯：周駿)

Effect of isoimperatorin on inducing apoptosis and proliferation inhibition of gastric cancer cells BGC-823

WANGTingxiang.TheSecondClinicalMedicalCollege,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou(310005),China;LOUGuoqiang,SHIJunping.

DepartmentofGastroenterology,theSecondPeople′sHospital,Hangzhou(310005),China

ObjectiveThis paper intends to explore the apoptosis and proliferation inhibition of isoimperatorin in human gastric cancer cells BGC-823. MethodsHuman gastric cancer cells were trainedinvitro, and taking the Dutch gastric cancer BGC-823 and nude mice model as the observation object, the effects of isoimperatorin on human gastric cancer BGC-823 cell proliferation, and survival rate and the induction of apoptosis were determined by using the MTT method and Annexin V-FITC/PI staining observation, and by observation of the nude mice tumor experiment of BGC-823 cell proliferation growth. ResultsThe survival rate of human gastric cancer cell proliferation cell line BGC-823 decreases with the increase of the concentration of isoimperatorin or the increase of the processing time, and there exists a dose-time dependence between the proliferation of survival and isoimperatorin. Isoimperatorin could significantly induce BGC-823 cells apoptosis, and within a certain range with the increase of the concentration of isoimperatorin, the apoptosis rate also would increase. Effective dose of isoimperatorin tumors within tumor volume injection could narrow nude mice and increase the tumor inhibition rate. The difference was statistically significant compared with the control group (P<0.05). ConclusionsIsoimperatorin can effectively inhibite cell proliferation of human gastric cancer BGC-823 and induce its apoptosis, inhibiting gastric cancer cell transplantation tumor growth. However, the specific regulatory mechanism of isoimperatorin requires further research.

Isoimperatorin; Gastric cancer; Proliferation; Apoptosis

浙江省中醫(yī)藥科技計劃(2013ZA014)

310005杭州，浙江中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院(王廷祥)；310005杭州市第二人民醫(yī)院消化科(婁國強，施軍平)

10.3969/j.issn.1673-534X.2016.04.015

2016-03-25)