基于高通量測序?qū)λ死敻缮衬暇?種多年生植物根際細菌及真菌群落結(jié)構(gòu)的研究

高歡歡　曾凡江　趙秀芳　朱心寧　郭自春　張波　丁澤華

摘要 本研究利用高通量測序法（Miseq測序平臺）對塔克拉瑪干沙漠南緣2種多年生植物根際土壤微生物進行初步研究。結(jié)果表明，駱駝刺根際土壤中細菌分為16門、33綱、67目、129科、320屬，檉柳根際土壤中細菌分為14門、30綱、66目、125科、335屬;駱駝刺根際土壤中真菌分為8門、13綱、36目、58科、104屬，檉柳根際土壤中真菌分為8門、13綱、34目、59科.92屬。2種植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)種間存在差異，真菌差異大于細菌且豐度高。

關(guān)鍵詞 根際微生物;高通量測序;多樣性Miseq測序平臺;塔克拉瑪干沙漠

中圖分類號 S154.36

文獻標識碼 A

文章編號 1007-5739（2019）08-0161-03

根際這一概念最早在1904年由德國科學(xué)家Hitner提出，是指根和土壤及其中間的一切物質(zhì)。根際微生物在根際生態(tài)中占據(jù)重要地位，它能自由穿梭于根際中的“自由空間”，鏈接植物一土壤，參與養(yǎng)分運輸與能量轉(zhuǎn)換"。沙漠是典型的干旱生態(tài)系統(tǒng)，降雨稀少、沙漠化嚴重、土壤養(yǎng)分貧瘠是其主要特點叫，但是在世界各地沙漠的土壤中都發(fā)現(xiàn)了豐富的微生物，可培養(yǎng)數(shù)量達1.6x107個/gH。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，高通量技術(shù)在土壤微生物多樣性研究中廣泛應(yīng)用，更多種類的微生物區(qū)系已經(jīng)在荒漠生態(tài)系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)，同時也為根際微生物生態(tài)學(xué)的研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

塔克拉瑪干沙漠南緣是典型的干旱生態(tài)系統(tǒng)，也是我國土地沙漠化最嚴重的地區(qū)之一?；哪脖皇蔷S系干旱區(qū)生態(tài)系統(tǒng)安全的基礎(chǔ)，加速自然植被的修復(fù)與重建依賴于主要植物生態(tài)學(xué)特性的深入了解。駱駝刺和檉柳作為這一地區(qū)的主要物種，在塔克拉瑪干沙漠南緣形成優(yōu)勢群落，在防風(fēng)固沙、維護脆弱過渡帶生態(tài)中起到重要作用8駱駝刺作為豆科多年生木質(zhì)化草本，具有較高含量的蛋白質(zhì)，是家畜優(yōu)良的飼料四。此外，駱駝刺植株可以分泌刺糖和油脂，具有良好的藥用價值"0，檉柳根系寄生著有沙漠人參之稱的管花肉蓯蓉叫，2種植物都有很高的經(jīng)濟價值。但是由于過渡區(qū)開墾和藥材采集過程中人類的過度砍伐和挖掘，2種植物受到了嚴重破壞。以往研究中主要關(guān)注水分、養(yǎng)分、鹽分對其植被修復(fù)的影響12-14，未能探究根際微生態(tài)過程中能量與物質(zhì)的轉(zhuǎn)換機制。因此，探索根際微生物群落結(jié)構(gòu)可為深人研究根系微生態(tài)中植物微生物一土壤協(xié)同作用機制奠定理論基礎(chǔ)1。

本研究中基于第二代16SrRNA高通量測序技術(shù)，初步探討了駱駝刺和檉柳根際士壤中細菌、真菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性及其差異，為今后進一步揭示根際微生態(tài)過程中養(yǎng)分循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換提供參考和理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1研究區(qū)概況

本研究依托策勒荒漠草地生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測研究站開展。研究區(qū)位于策勒綠洲前沿。策勒位于昆侖山北麓，塔克拉瑪干沙漠南緣，地處東經(jīng)80*03'24"～82°10'34"，北緯35917'55"～3930'00"。年平均合氣溫11.9C，極端最高氣溫41.9C，極端最低氣溫-23.9C年均降水量35.1mm，主要集中在5月和7月.蒸發(fā)量高達2595.3mm，干燥度20.8，無霜期平均約為209d，屬于暖溫帶極端千旱區(qū)。年平均風(fēng)速1.9m/s，沙塵暴和降塵是這一區(qū)域的主要生態(tài)災(zāi)害。策勒綠洲有9條季節(jié)性河流，均屬于降水、積雪融水和冰川融水綜合補給性河流。當(dāng)昆侖山的融雪水超出河流容量時，就會出現(xiàn)夏季（7-8月）洪水。駱駝刺和檉柳是沙漠綠洲過渡帶最重要的2種多年生植物。

1.2研究方法

1.2.1根際土壤取樣。在沙漠綠洲過渡帶駱駝刺和檉柳天然群落中各選取3個10mx10m的樣方，每個樣方中選取3～5株長勢良好的植株進行挖掘，挖掘深度為1m。用抖土法抖落根上附著的土壤，用無菌刷刷取根上附著的土壤作為根際土將土壤樣品放入無菌袋中儲存在4C冰箱中。將3個樣方獲取的部分根際土混合均勻，過0.2mm篩，-70C冷凍以備DNA的提取。其余根際土風(fēng)干后過0.2mm篩，用于土壤理化性質(zhì)的鑒定。

1.2.2土壤理化性質(zhì)檢測。土壤含水量用鋁盒法測定;土壤總有機碳含量用總有機碳分析儀檢測（德國Elementar公司）;土壤總氮含量用自動凱氏定氮儀檢測（丹麥福斯公司）;土壤速效磷用0.5mol/L碳酸氫鈉浸提，用鉬銻抗比色法測定;將土壤與蒸餾水按1：5質(zhì)量比混勻用pH計和電導(dǎo)儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司）測定pH值和電導(dǎo)率。

1.2.3DNA提取與擴增。土壤總DNA用Ezup柱式土壤DNA抽提試劑盒按說明提取。提取后用去RNA酶進行去RNA處理。

利用Qubit2.0DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)應(yīng)加人的DNA量。利用Miseq焦磷酸測序平臺對2種植物根際土壤細菌、真菌群落結(jié)構(gòu)組成進行鑒定間。細菌PCR所用的引物已經(jīng)融合了Miseq測序平臺的V3-V4通用引物（融合341F引物為CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG;融合805R引物為GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC）。真菌PCR所用的引物同樣已經(jīng)融合了Miseq測序平臺的真菌通用引物（融合MSQ一NS1引物為CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode）GTAGTCATATGCTTGTCTC;融合MSQ-Fung引物為GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAATTCCCCGTTACCCGTTG）。PCR擴增體系及反應(yīng)條件參見文獻。

1.2.4測序數(shù)據(jù)處理及微生物群落組成鑒定。數(shù)據(jù)預(yù)處理，采用Flash軟件融合雙末端序列，而后通過各樣品barcode使數(shù)據(jù)回歸樣品，并對各樣本序列做質(zhì)量控制（QC）。QC之后序列長度大部分分布在400～600bp之間，平均長度均在440bp以，上，各樣本序列數(shù)均在500以上，滿足基本分析要求。質(zhì)控后的序列長度為去除barcode、兩端primer、以及部分低質(zhì)量序列的統(tǒng)計結(jié)果。將多條序列按其序列間的距離對它們進行聚類，后根據(jù)序列之間的相似性作為域值分成操作分類單元（OTU），通常域值的序列相似性定為0.97，操作分類單元被認為可能接近于屬。

采用軟件RDPclassifier進行物種分類。RDPclassifier是基于伯杰分類，采用NaiveBayesianassignment算法對每條序列在屬水平上計算其分配到此序列中的概率值。伯杰分類分為5層，它們依次為門、綱、目、科、屬。

1.2.5微生物群落多樣性分析。利用QIIME（Version1.50）軟件計算樣品的Alpha多樣性值，計算Alpha多樣性指標，包括豐富度指數(shù)、，Shannon指數(shù)ACE指數(shù)、Chaol指數(shù)Coverage等。豐富度指數(shù)用于衡量單個樣本中物種種類個數(shù)，實際通過操作分類單元（OTU）的個數(shù)來計算。

2結(jié)果與分析

2.12種植物根際土壤理化性質(zhì)對比

如表1所示，2種植物根際土壤總有機碳含量差異不顯著（P>0.05）。駱駝刺根際土壤速效磷和pH值顯著高于檉柳根際土壤（P<0.05），總氮含量、電導(dǎo)率及水分含量顯著低于檉柳根際土壤。

2.22種植物根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性比較

2個樣本序列共聚類到26075個序列，其中駱駝剌根際土含11390個序列、檉柳根際土含14685個序列。質(zhì)量控制處理后序列，基于97%的序列相似性，駱駝刺根際土獲得2481個OTU，檉柳根際土獲得2482個OTU。多樣性指數(shù)結(jié)果如表2所示。駱駝刺根際土Shannon、ACE、Chaol指數(shù)均大于檉柳根際土，分別為6.752、6653.227、4853.774。Coverage小于檉柳根際土，為0.884。

經(jīng)鑒定駱駝刺根際土壤中細菌分為16門、33綱、67目、129科、320屬;檉柳根際土壤中細菌分為14門、30綱、66目、125科、335屬。二者在門、綱、目、科分類級別上有相同的優(yōu)勢菌，為變形菌門（Proteobacteria）、a一變形菌綱（Alphaprote-obacteria）、根瘤菌目（Rhizobiales）.紅螺菌科（Rhodospirillac一eae）;屬級別優(yōu)勢菌不同，駱駝刺根際土壤中屬級別優(yōu)勢菌為一個紅螺菌科（Rhodospirillaceae）未被培養(yǎng)鑒定的菌屬，檉柳根際士壤中為Steroidobacter。2種植物根際土中細菌豐度均超過1%的有12個屬（圖1），其中已被鑒定的屬有Escherichia-Shigella、CandidatusMicrothrix、Sphingomonas、Fl一exibacterAzospira、Pelagibius、Planctomyces、Nitratireductor;其余未被培養(yǎng)鑒定，分別為uncultured_Rhodospirillaceae、unc-ultured_Nitrospinaceae、uncultured、Anaerolineaceae、uncultur-ed__Xanthobacteraceae。

2種植物根際土壤中有15個屬的細菌豐度差異超過1%（圖2）。駱駝刺根際土壤中含量較高的有7個屬，其中已被鑒定的屬有Pseudomonas、Ornithinibacter、Nitrosococcus、Blastocatella;其余未被培養(yǎng)鑒定，分別為uncultured_Gemm-atimonadaceae、uncultured_Rhodospirillaceae、Iachnospiraceae_Incertae_Sedis。檉柳根際土壤中含量較高的有8個屬，其中已被鑒定的屬為Amycolicicoccus、CandidatusXiphinemato-bacter、Rhizomicrobium、Planctomyces、Steroidobacter、Phenylo-bacterium;其余未被鑒定，分別為uncultured_Erythrobacterac-eae、uncultured_Flammeovirgaceae。駱駝刺根際土特有細菌有5個屬（駱駝刺根際士中相對豐度大于0.1%，檉柳根際土中未出現(xiàn)），其中已被鑒定的屬有Rhodanobacter、Inquilinus、Polaromonas、Pseudaminobacter，uncultured_Peptococcaceae未被培養(yǎng)鑒定。檉柳根際土特有細菌有2個屬（檉柳根際土中相對豐度大于0.1%，駱駝刺根際土中未出現(xiàn)），分別為Reichenbachiella和千維桿菌科（Fib-robacteracea）一個未被培養(yǎng)鑒定的屬。

2.32種植物根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性比較

如表2所示，2種植物根際土壤真菌豐度及多樣性值都小于細菌，2個樣本真菌序列共聚類到49957個序列，其中駱駝刺根際土含29428個序列、452個OTU，檉柳根際土含20529個序列、326個OTU。與細菌多樣性特征一樣駱駝刺根際土Shannon、ACE、Chaol指數(shù)均大于檉柳根際土，分別為3.793、592.684.604.455。

駱駝刺根際土壤中真菌分為8門、13綱36目、58科、104屬，各分類級別上優(yōu)勢菌分別為子囊菌門（Ascomyco-ta）、子囊菌綱（Sordariomycetes）、肉座菌目（Hypocreales）、赤殼科（Nectriaceae）、從赤殼屬（Nectria）;檉柳根際土壤中真菌分為8門、13綱、34目、59科.92屬，各分類級別上優(yōu)勢菌分別為子囊菌（Ascomycota）、子囊菌綱（Sordariomycet-es）、散囊菌目（Eurotiales）、發(fā)菌科（Trichocomaceae）、青霉菌屬（Penicillium）。2種植物根際土中真菌豐度均超過1%的有7個屬（圖3），分別為Acremonium、Nais、Nectria、Geosmithia、Orbilia、Pleospora、Geopyxis。

2種植物根際土壤中有26個屬的真菌豐度差異超過1%（圖4）。駱駝刺根際土壤中含量較高的有13個屬，分別為Bionectria、Absidia、Beauveria、Phyllosticta、Volutella、Rhiz-ophagus、ThanatephorusActinomucor、GeopyxisMattirolomyces、Geomyces、Knufia、Nectria;檉柳根際土中含量較高的有12個屬，分別為Penicillium、Cephalotheca、Phoma、PsathyrellaPlu-teus、UlosporaArachnomyces、MicroascusNais、Penidiella、Ma-durellaCochlonema。駱駝刺根際土特有真菌有6個屬，分別為Mattirolomyces、Metarhizium、Stephanospora、Oxrporus、Col-letotrichum和被孢霉科（Mortierellaceae）一個未被培養(yǎng)鑒定的屬;檉柳根際土特有真菌有6個屬，分別為Corollospora、Taifanglania、XylariaCatenu-lostroma、Grosmannia、Diatrype。

3結(jié)論

（1）2種植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)在植物種間存在差異，真菌差異大于細菌，豐度高。

（2）極端環(huán)境微生物及新發(fā)現(xiàn)菌屬較多，新發(fā)現(xiàn)菌屬分離和功能鑒定在今后的研究工作中仍需要開展。

（3）特殊功能型微生物差異與養(yǎng)分等因素具體相關(guān)性和解釋率需要進一步研究。

4參考文獻

[1] ROVIRA A D.Plant root exudates{J].Botanical Review， 1969 ，35（1）：35-57.[2] NOY -MEIR I.Desert ecosystems ：environment and producers [J].AnnualReview of Ecology and Systematics， 1975，4：25-41.

[3] SKUJINS J.Microbial ecology of desert soils[J].Advances in MicrobialEcology ， 1984，7：49-91.

[4] AMANN RI，LUDWIG W ，SCHLEIFER KH.Phylogenetic identification

and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J].Microbiol.Rev.， 1995，59：143-169.

[5] BECERRA A，BARTOLONI N， COFRE N，et al.Arbuscular mycorrhizal

fungi in saline soils： Vertical distribution at different soil depth [J].Brazilian Journal of Microbiology ， 2014 ，45（2）：585-594.

[6]LIU J，SUI Y， YU Z，et al.Soil carbon content drives the biogeographical

distribution of fungal communities in the black soil zone of northestChina[].Soil Biology & Biochemistry，2015， 83（1）：29-39.

[7] SHAMIR I， STEINBERGER Y.Vertical distribution and activity of soil

microbial population in a sandy desert ecosystem[J].Microbial Ecology，2007 ， 53（2）： 340- -347.

[8]朱軍濤，李向義，張希明，等.灌溉對疏葉駱駝刺幼苗光合生理指標及滲透物質(zhì)的影響[J].中國沙漠，2009，29（4）：697-702.

[9]曾凡江，張希明，李小明.駱駝刺植被及其資源保護與開發(fā)的意義[J].干旱區(qū)地理，2002，25（3）：286-288.

[10]李君山，劉勇民，蔡少青.維吾爾醫(yī)用駱駝剌類藥材的資源、商品流通及民間應(yīng)用研究[J].中國民族醫(yī)藥雜志，1996，2（2）：39-40.

[11]張媛，屠鵬飛.檉柳屬藥用植物研究進展[D].中草藥，2008，39（6）：947-951.

[12]曾杰，曾凡江，郭海峰，等.策勒綠洲外圍2種植物幼苗對NaCl的生理響應(yīng)[J].千旱區(qū)研究，2008，25（5）：673-678.

[13]郭海峰，曾凡江，SKARNDT，等.洪水灌溉對策勒綠洲優(yōu)勢植物及生境的影響[J].科學(xué)通報，2008（53）：140-146.

[14]張利剛，曾凡江，袁娜，等.不同水分條件下疏葉駱駝刺（Alhagi

sparsifolia）生長季根系分株構(gòu)型特征[J].中國沙漠，2013，33（3）：717-723.

[15] BERG G，GRUBE M ， SCHLOTER M，et al.Unraveling the plant micro-

biome ： Looking back and future perspectives[J].Front Microbiol ， 2014，5：1-6.

[16] CHAKRAVORTY S， HELB D， BURDAY M，et al.A detailed analysis of

16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenicbacteria[J].Journal of Microbiological Methods ，2007 ， 69（2）：330-339.[17] WAKELINS A，COLLOFF MJ，HARVEY P R， et al.The effects of stubble

retention and nitrogen application on soil microbial community struc -ture and functional gene abundance under irrigated maize [J].FEMSMicrobiol.Ecol.， 2007 ， 59（3）：661-670.