快速檢測技術(shù)在煙草農(nóng)藥殘留檢測中的應用探討

張燕　陳丹　李苓　王春瓊

摘要 快速檢測技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測中發(fā)揮著重要作用。本文重點介紹了酶抑制法、免疫分析法、光譜法和生物傳感器等幾種農(nóng)藥快速檢測技術(shù)的檢測原理和研究進展，概述了快速檢測技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測中的應用研究，并對農(nóng)藥快速檢測技術(shù)的發(fā)展給予了展望，以期推進煙草農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)的發(fā)展。

關(guān)鍵詞 農(nóng)藥殘留;快速檢測;應用;煙草

中圖分類號 S481*.8

文獻標識碼 A

文章編號 1007-5739（2019）08-0111-03

農(nóng)藥殘留超標問題是人們長期關(guān)注的重點，煙草在大田生產(chǎn)和儲存過程中都不可避免地會使用農(nóng)藥。合理的農(nóng)藥使用為煙草帶來了可觀的經(jīng)濟效益，然而在實際應用中，農(nóng)藥的過量和違規(guī)使用導致煙葉農(nóng)藥殘留甚至超標的現(xiàn)象時有發(fā)生。為了提高煙草制品質(zhì)量安全水平，對煙葉中農(nóng)藥殘留進行及時和準確分析是控制煙葉安全性的重要環(huán)節(jié)。目前，煙草農(nóng)藥殘留量主要采，用色譜法或色譜一質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)檢測，方法穩(wěn)定，結(jié)果準確、重復性好，但不能滿足現(xiàn)場快速篩查需求，不能及時對煙葉農(nóng)藥殘留作出評價。隨著農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)的研究和應用，一些特異性強、高靈敏度的快速檢測方法實現(xiàn)了對農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場快速篩查和檢測。本文對酶抑制法、免疫分析法、光譜法和生物傳感器等幾種農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)的原理和應用進行了概述，以期為探討煙草農(nóng)藥快速檢測技術(shù)的研究和應用提供參考。

1酶抑制法

酶抑制法是利用酶的功能基團受到某種物質(zhì)的影響，從而導致酶活力降低或喪失作用的一種檢測方法。乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶是酶抑制快速檢測中應用最多的2種酶，是有機磷和氨基甲酸酯兩大類農(nóng)藥的作用靶標，有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥雖然分子結(jié)構(gòu)不同，但是防治害蟲的作用機理相同，都能對這2種酶的活性產(chǎn)生特異性抑制，其抑制率與農(nóng)藥殘留量成正相關(guān)關(guān)系。因此，可以通過酶促反應中酶活性受抑制的程度判斷樣品中這2類農(nóng)藥的殘留情況”，并開發(fā)了農(nóng)藥殘留速測儀和速測卡。陳興江等2用速測儀和農(nóng)藥速測卡測定了煙草中樂果、辛硫磷和滅多威等3種農(nóng)藥殘留，與氣相色譜法的檢測結(jié)果一致。酶抑制法操作過程簡便，檢測速度快，適合現(xiàn)場大量樣品的篩查，但是其適用范圍有限，只能對有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留總量進行定性檢測，且檢測過程中酶的敏感程度和穩(wěn)定性、底物和顯色劑的特異性以及提取液的濃度等因素都會影響其檢測結(jié)果，導致出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象。羅俊霞等采用試劑盒提供的方法和國標2種前處理方法，對50種有機磷農(nóng)藥的殘留進行了測定，結(jié)果顯示，用國標方法進行樣品處理，測定有機磷的檢出限相對比較低，檢出的有機磷農(nóng)藥的抑制率也隨著濃度的增加而增加，達到一定濃度之后幾乎將酶活性全部抑制，抑制率接近100%。由此可見，酶、顯色劑及底物的濃度都是影響酶抑制法測定農(nóng)藥殘留結(jié)果的因素，在酶促反應過程中要控制多個條件才能盡量提高其檢測的準確性。

2生物傳感器法

生物傳感器是將生物敏感元件與轉(zhuǎn)換器連接組成的一種分析裝置，通過轉(zhuǎn)換器捕捉特定待測化學活性物質(zhì)與生物敏感元件之間的反應，將其轉(zhuǎn)換成可識別的物理化學信號，再通過檢測元件信號數(shù)值的變化，達到檢測農(nóng)藥殘留量的目的，是目前農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)的研究熱點，在檢測靈敏度、反應時間現(xiàn)場檢測和自動化分析等方面都有較大進展。

生物傳感器具有特異性識別分子的能力，對被測物質(zhì)有高度選擇性.根據(jù)生物分子識別元件上敏感物質(zhì)或信號轉(zhuǎn)換器的不同，可分為酶生物傳感器、免疫生物傳感器和電化學傳感器等不同類型。最早開發(fā)的主要是酶生物傳感器，包括膽堿酯酶、有機磷水解酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶等酶生物傳感器，用于測定有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥。

生物傳感器的性能受固定生物分子的載體及固定方法的影響較大，新型納米材料的引人提高了酶生物傳感器的檢測性能：Yan等{制備了多壁碳納米管的乙酰膽堿酯酶生物傳感器對敵敵畏進行了檢測，結(jié)果顯示，敵敵畏的檢測限為（0.680+0.076）μg/L，酶抑制率在0.25～1.75μumol/L及2.00～10.00μumol/L范圍內(nèi)與敵敵畏的濃度呈線性關(guān)系。Crew等F]制備了6種乙酰膽堿酯酶生物傳感器，6min內(nèi)可同時測定馬拉硫磷敵敵畏和毒蟲畏等6種有機磷農(nóng)藥，這種多酶抑制系統(tǒng)傳感器的開發(fā)實現(xiàn)了同時對幾種有機磷農(nóng)藥的測定。

利用免疫分析技術(shù)結(jié)合傳感技術(shù)開發(fā)的免疫生物傳感器是利用農(nóng)藥與抗體間的特異性識別來檢測樣品中農(nóng)藥殘留的一種方法，可以直接測定抗原抗體復合物的變化，通過轉(zhuǎn)換器對檢測結(jié)果進行定量，具有特異性好、高通量處理樣品等特點。Wang等制備了非標記免疫生物傳感器測定對硫磷，檢出限為0.08μg/L，線性范圍為0.17～32.50μg/L，檢測結(jié)果與氣相色譜的結(jié)果一致。免疫生物傳感器特異性好，制備簡單，但是農(nóng)藥抗體開發(fā)成本高，且只能檢測單一農(nóng)藥，不適用多種農(nóng)藥殘留的檢測。

3光譜法

現(xiàn)代光譜技術(shù)是用調(diào)制后的光線照射被檢測的物質(zhì)，使物質(zhì)內(nèi)部在外界刺激下發(fā)生電子能級躍遷，從而產(chǎn)生不同的光譜，通過采集光譜特征來檢測農(nóng)藥殘留量。光譜法可以無損檢測，沒有繁雜的樣品前處理，分析速度快、特征性強，可實時快速檢測。常見的光譜技術(shù)有紅外光譜法、拉曼光譜法和熒光光譜法等幾種。

劉翠玲等8用近紅外光譜對混合液溶液中毒死蜱進行了測定，樣品的預測值和化學值之間有很好的相關(guān)性，通過聚類分析可以將含有毒死蜱的混合液與不含毒死蜱的混合液分開，進行直觀識別和無損檢測。

拉曼光譜：是借助分子的振動譜來識別物質(zhì)，農(nóng)藥分子因結(jié)構(gòu)不同可產(chǎn)生不同的振動譜，并在特定的拉曼位移處產(chǎn)生特征信號峰，從而獲得農(nóng)藥分子的“指紋信息”。利用拉曼光譜法識別農(nóng)藥時需要測量不同農(nóng)藥的拉曼光譜數(shù)據(jù)，建立數(shù)據(jù)庫和評判模型0，才能快速分析農(nóng)藥殘留量。李曉舟等叫用表面增強拉曼光譜技術(shù)對蘋果表面的甲拌磷和倍硫磷殘留量進行了測定，結(jié)果顯示，識別蘋果表面甲拌磷和倍硫磷這2種農(nóng)藥的特征峰頻率較為豐富，建立線性回歸預測模型可以作為定量測定這2種農(nóng)藥的參考模型。劉文涵等2用激光拉曼光譜測定辣椒表面甲基毒死蜱農(nóng)藥殘留量，發(fā)現(xiàn)殘留量與拉曼光譜特征峰相對強度有較高的線性關(guān)系。翟晨3）用拉曼光譜技術(shù)測定蘋果中溴氰菊酯和啶蟲脒2種農(nóng)藥，當溴氰菊酯和啶蟲脒殘留含量分別為0.78、0.15mg/kg時，其特征峰清晰可見。拉曼光譜法穩(wěn)定性好、分辨率高，但是容易受熒光干擾、圖譜分析復雜，檢測的準確性有待提高。

利用待測混合液的熒光特性對農(nóng)藥殘留量進行定性和定量檢測的熒光光譜法的應用也較為廣泛。薛龍等4用熒光光譜圖像技術(shù)無損化快速測定臍橙表面的敵敵畏殘留！量，結(jié)果表明，實測值和預測值之間的相關(guān)系數(shù)為0.8101。李滿秀等5用熒光光譜法對蔬菜中溴氰菊酯農(nóng)藥殘留量進行測定，加標回收率為975%～103.8%，其熒光強度與溴氰菊酯農(nóng)藥殘留量有良好的線性關(guān)系。熒光分析只能對自身能夠產(chǎn)生出熒光的物質(zhì)進行檢測，檢測過程中溫度、溶劑和溶液的pH值都會對檢測結(jié)果造成影響。

4免疫分析法

免疫分析法是以抗體和抗原之間的特異性結(jié)合反應為基礎的一種分析方法，該方法以農(nóng)藥分子作為抗原物質(zhì)，用特異性抗體作為生物化學檢測器對農(nóng)藥進行定性和定量檢測。由于抗體只能對特定的農(nóng)藥抗原進行特異性結(jié)合，所以免疫反應具有很強的選擇性和特異性。酶聯(lián)免疫分析技術(shù)是免疫分析方法中應用最為廣泛的一種，有60多種農(nóng)藥16可用酶聯(lián)免疫法測定，主要是除草劑、殺蟲劑和少量的殺菌劑，包括有機磷，氨基甲酸酯類殺蟲劑及除草劑在內(nèi)的幾十種商品化的試劑盒已在市場上得到應用。Otieno等"建立了毒死蜱殘留量檢測的酶聯(lián)免疫法，毒死蜱的檢測限為0.37～0.42μgkg，平均回收率為90.20～101.88%，與高效液相色譜法相比無顯著差異。曾俊源等8用直接競爭酶聯(lián)免疫吸附法測定氰戊菊酯殘留量，在高、中、低2.00.0.20、0.05mg/kg3個添加水平下，回收率分別為81%～89%.85%～98%、85%～106%。萬宇平等9研制出甲基對硫磷酶聯(lián)免疫試劑盒，通過與氣相色譜檢測結(jié)果比對，其檢測限和加標回收率等基本一致，可對樣品中甲基對硫磷殘留量進行快速篩查。

將化學發(fā)光技術(shù)與免疫方法相結(jié)合的化學發(fā)光免疫分析法也具有高靈敏度和高特異性。單云等0在納米晶膜上建立了噻蟲啉殘留量測定的電化學發(fā)光免疫法，噻蟲啉濃度的對數(shù)與標記物發(fā)光強度的對數(shù)在0.1～10.0pg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢測限為0.1pg/mL。劉濤等叫合成了一種具有較強發(fā)光能力的新型化學發(fā)光標記物，可用于二乙氧基類有機磷農(nóng)藥多殘留化學發(fā)光免疫檢測。以膠體金作為標記物的免疫層析技術(shù)，可以制作成檢測試紙條的形式，靈敏性和特異性高，可以快速檢測特定抗原或抗體。劉瑩2制備了有機磷膠體金試紙條測定殺螟硫磷、甲基對硫磷和對硫磷等9種有機磷農(nóng)藥殘留量，最低檢測限為0.25mg/kg。樓小華等31建立了煙葉中三唑酮殘留量膠體金試紙條快速檢測方法，結(jié)果表明，三唑酮的檢測限為1mg/kg，檢測時間5～10min，與氣相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜檢測法結(jié)果比對，符合率為98%，并且該試紙與多菌靈、甲霜靈和吡蟲啉等農(nóng)藥不存在交叉反應，對煙葉中三唑酮的殘留檢測具有較高的特異性。

5結(jié)論與展望

目前，農(nóng)藥殘留檢測仍然以氣相色譜法、高效液相色譜法和色譜一質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)為主要的常規(guī)檢測手段，檢測結(jié)果準確穩(wěn)定，可同時測定多種農(nóng)藥殘留，方法的重復性好、靈敏度高，但是檢測成本高，樣品前處理繁雜，不適合田間農(nóng)藥監(jiān)控的快速篩查，不能及時對產(chǎn)品的安全性作出評價。因此，適用于現(xiàn)場篩查的快捷簡便和低成本的農(nóng)藥殘留快速檢測方法和技術(shù)應運而生。

酶抑制法操作簡單、時間短，適合田間檢測及對大量樣品的初篩，但是應用范圍有限，而且酶、底物和顯色劑都有一定的特異性，檢測結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性或假陰性，導致方法的重復性和回收率較低。生物傳感器技術(shù)容易實現(xiàn)對農(nóng)藥殘留進行快速現(xiàn)場檢測篩查，但是也存在選擇性低酶活性不高、檢測成本較高等缺點。近年來，新型納米材料的引入提高了傳感器的檢測性能除了納米材料，分子印跡技術(shù)也將成為農(nóng)殘快速檢測技術(shù)研究開發(fā)的熱點和發(fā)展趨勢。光譜法作為一種無損檢測技術(shù)，可實現(xiàn)多組分實時快速同時測定，但是方法的靈敏度較低，受樣品組分的相關(guān)信息以及背景干擾因素所產(chǎn)生的噪音信號影響，檢測結(jié)果準確度和特異性較低，同時需要大量數(shù)據(jù)分析建立模型擬合，且要不斷更新模型。免疫分析法檢測試劑盒易普及和推廣，尤其適用極性強、難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定農(nóng)藥的田間快速檢測，在實際應用中，可根據(jù)農(nóng)藥種類和結(jié)構(gòu)建立不同的農(nóng)藥免疫檢測分析系統(tǒng)。因為檢測前需要明確待檢農(nóng)藥，一種農(nóng)藥抗體只能對這種農(nóng)藥或結(jié)構(gòu)相似的幾種農(nóng)藥進行檢測，因而不適合多種農(nóng)藥殘留分析和未知農(nóng)藥的檢測，廣譜性較難實現(xiàn)，同時農(nóng)藥特異性抗體的開發(fā)和制備也較為困難，不同批次的抗體在性能方面也存在差別，從而會影響到檢測結(jié)果的重復性。

目前，農(nóng)藥快速檢測技術(shù)在煙草上的應用研究報道極少，煙草大田生產(chǎn)中快速的農(nóng)藥篩查應用也很少。隨著人們對煙草制品中農(nóng)藥殘留的關(guān)注和重視，未來快速檢測技術(shù)將會成為煙草農(nóng)藥殘留檢測的必要技術(shù)，在煙草質(zhì)量安全監(jiān)督管理中與傳統(tǒng)的實驗室檢測方法一樣具有不可替代的作用。

6參考文獻

[1]劉順字，郭淑貞，林雙娣，等酶抑制法在農(nóng)藥殘留快速檢測過程中的應用分析[J].湖南農(nóng)業(yè)科學，2017（7）：85-87.

[2]陳興江，邱雪柏，商勝華，等.農(nóng)殘速測卡和速測儀在煙葉農(nóng)藥殘留檢測中的應用[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，2013，41（6）：102-105.

[3]羅俊霞，樊彥超，宋志強，等酶抑制法測定多種有機磷農(nóng)藥殘留試驗[J].生物災害科學，2014，37（4）：308-313.

[4] YAN J，GUAN H，YU J，et al.Acetylcholinesterase biosensor based on

assembly of multiwall carbon nanotubles on to liposome bioreactors fordetection of organophosphates pesticides[J ].Pesticide Biochemistry andPhysiology ， 2013， 105（3）： 197-202

[5] CREW A，LONSDATE D， BYRED N，et al.Ascreen-printed ， amperometric

biosensor array incorporated into a novel automsted system for the simul-taneous determination of organophosphate pesticides[J].Biosens Bioelec-tron， 2011，26（6）：2847-2851

[6]戴瑩，王紀華，韓平，等.生物傳感器在有機磷農(nóng)藥殘留量檢測中的

應用研究進展[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2015，6（8）：2976-2980.

[7] WANG J J，CHEN D，YAN X，et al.Labelifree immunosensor based on

micromachined bulk acoustic resonator for the detection of trace pesticide residus[J].Sensor Actual B-Chem， 2014， 190，378-383.

[8]劉翠玲，隋淑霞，吳靜珠，等近紅外光譜技術(shù)檢測溶液中毒死蜱含量試驗[J].農(nóng)業(yè)機械學報，2009，40（1）：129-131.

[9]李志成，鄭曉東，閆新煥，等快速檢測技術(shù)在果蔬農(nóng)藥殘留檢測中的應用[J].中國果菜，2016，36（12）：33-36.

[10]李曉婷，王紀華，朱大洲，等.農(nóng)藥殘留快速檢測方法研究進展[J].農(nóng)業(yè)工程學報，201l（增刊2）：363-370.

[11]李曉舟，于壯，楊天月，等.SERS技術(shù)用于蘋果表面有機磷農(nóng)藥殘留的檢測[J].光譜學與光譜分析，2013，33（10）：2711-2714.

[12]劉文涵，張丹，何華麗，等激光拉曼光譜內(nèi)標法測定紅辣椒表面的農(nóng)殘甲基毒死蜱[J].光譜實驗室，2012（4）：2059-2062.

[13]翟晨.基于拉曼光譜的蘋果中農(nóng)藥殘留種類識別及濃度預測的研究[J].光譜學與光譜分析，2015（8）：67-68.

[14]薛龍，莊宏，黎靜，等基于激光誘導熒光高光譜技術(shù)無損檢測臍橙表面敵敵畏殘留水[J].中國農(nóng)機化，2012（1）：180-193.

[15]李滿秀，高首琴.蔬菜中溴氰菊酯農(nóng)藥殘留的β一CD包結(jié)熒光光度法測定[J].化學研究與應用，2011，23（6）：788-791.

[16]楊依軍，王勇，楊秀榮，等免疫分析法在農(nóng)藥殘留分析中的應用[J].華北農(nóng)學報，2001（4）：119-124.

[17] OTIENO P O，0WUOR P O，LALAH J O， et al.Comparative evaluation

of ELISA kit and HPLC DAD for the determination of chlorpyrifos ethylresidues inwater and sediments[J].Talanta， 2013（ 117）：250 -257.

[18]曾俊源，崔巧利，劉曙照.直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析法測定桃氰戊菊酯的殘留量[J].農(nóng)藥學學報，2014，16（1）：61-65.

[19]萬宇平，孫震，馮靜，等甲基對硫磷殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的研制[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2013，52（5）：1154-1157.

[20]單云，張洪琳，彭智敏.電化學發(fā)光免疫分析方法檢測蔬菜中噻蟲啉的含量[J].南京曉莊學院學報2014（6）：1-5.

[21]劉濤，孟超，姚鑫，等.有機磷農(nóng)藥多殘留檢測化學發(fā)光標記物的合成及鑒定[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2014（5）：1365-1370.

[22]劉瑩有機磷農(nóng)藥的膠體金免疫層析快速檢測試紙條的研制[D]上海：上海師范大學，2009.

[23]樓小華，高川川，朱文靜，等膠體金免疫層析法快速檢測煙葉中三唑酮殘留量[J].中國煙草學報，2016，29（1）：8-14.