豬支原體肺炎活疫苗（168株）氣溶膠免疫后呼吸道sIgA分泌及抗原存留規(guī)律

華利忠，白 昀，武昱孜，王 佳，楊 浩，吳 猛，袁 廳，邵國(guó)青，馮志新

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014）

豬支原體肺炎（mycoplasmal pneumonia of swine，Mps）是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的一種慢性呼吸道疾病，陽(yáng)性感染率一般為70%～90%，發(fā)病率40%以上，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展。目前疫苗免疫是防控該病的主要措施[1]。市場(chǎng)上豬肺炎支原體相關(guān)疫苗主要包括經(jīng)肌肉注射免疫的滅活苗以及經(jīng)肺內(nèi)或滴鼻免疫的活疫苗兩種類型[2]。其中滅活苗不能阻止野毒的感染[3]，活疫苗經(jīng)肺內(nèi)注射免疫效果較好。我們近幾年在研究活疫苗的氣溶膠免疫技術(shù)，以期在活疫苗良好免疫保護(hù)的基礎(chǔ)上，節(jié)省免疫工作的人力成本，降低免疫動(dòng)物的應(yīng)激。氣溶膠免疫等無(wú)針化免疫技術(shù)將有更好的市場(chǎng)前景[4]。馮志新等[5]建立了豬支原體肺炎活疫苗（168株）經(jīng)氣溶膠免疫的方法，免疫后疫苗株可定植在豬氣管上皮細(xì)胞上，并誘導(dǎo)感染豬的黏膜免疫。這一發(fā)現(xiàn)證明豬支原體肺炎活疫苗（168株）氣溶膠免疫的可行性，氣溶膠免疫和肺內(nèi)免疫一樣，都可將活疫苗菌株輸送到靶組織，產(chǎn)生占位效應(yīng)，并激活宿主局部的黏膜免疫應(yīng)答，這也是支原體活疫苗的主要免疫機(jī)理之一[6]。然而經(jīng)氣溶膠免疫后呼吸道中疫苗株含量與經(jīng)肺內(nèi)免疫途徑的差異還未見(jiàn)報(bào)道，為探討豬肺炎支原體活疫苗168株經(jīng)氣溶膠免疫后疫苗株在體內(nèi)的增殖規(guī)律，本研究在前期開(kāi)發(fā)豬支原體肺炎活疫苗（168株）氣溶膠免疫技術(shù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究該疫苗株經(jīng)氣溶膠免疫后在免疫豬肺內(nèi)的占位存留規(guī)律與免疫應(yīng)答水平的相關(guān)性，探求該疫苗株氣溶膠免疫劑量的優(yōu)化方式，為豬肺炎支原體活疫苗（168株）氣溶膠免疫技術(shù)的進(jìn)一步研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)用3周齡不吃初乳豬（snatchfarrowed porcine-colostrum-deprived pig，SF-pCD pig）27頭，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所根據(jù)Huang等[7]的方法培育，經(jīng)ELISA檢測(cè)Mhp、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬瘟病毒（Swine fever virus，CSFV）和豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）均為陰性。

1.2 疫苗及稀釋液豬支原體肺炎活疫苗（168株）F328：由本實(shí)驗(yàn)室自制凍干苗，2 mL/瓶，CCU為2×108CCU/瓶，批號(hào) 20160713。豬支原體肺炎活疫苗稀釋液由南京天邦生物科技有限公司提供，批號(hào)169017。豬支原體肺炎霧化活疫苗稀釋液由本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 主要試劑及儀器豬肺炎支原體sIgA檢測(cè)試劑盒由本實(shí)驗(yàn)室自制保存；豬肺炎支原體血清抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)愛(ài)德士生物科技有限公司；Premix ExTaqTM（Perfect real-time）120次量購(gòu)自TaKaRa公司；real-time PCR 7500儀購(gòu)自ABI公司；real-time PCR 8聯(lián)管購(gòu)自BIO plastics公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將上述27頭試驗(yàn)豬隨機(jī)分為3組，G1氣溶膠免疫組12頭，根據(jù)Feng等[5]的方法和劑量進(jìn)行豬肺炎支原體（168株）的氣溶膠免疫，劑量為108CCU/頭（10頭份）；G2肺內(nèi)免疫組12頭，肺內(nèi)注射免疫豬肺炎支原體活疫苗（168株），劑量為107CCU/頭（1頭份），同時(shí)設(shè)立G0陰性對(duì)照組3頭。所有豬分別于免疫前和免疫后第2 h、7 d、14 d以及28 d時(shí)采集全血分離血清，同時(shí)按照馮志新等[8]方法采集和預(yù)處理鼻拭子，收集鼻拭子浸泡液，-20℃保存?zhèn)溆?。另外在上述時(shí)間點(diǎn)分別宰殺G1和G2組各3頭，對(duì)照組在免疫組免疫后28 d宰殺，采集肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）（當(dāng)天需要宰殺的豬在宰殺前先采集血清和鼻拭子）。肺泡灌洗液采集方法：剖檢試驗(yàn)豬時(shí)，連同氣管完整取出肺臟，灌注50 mL滅菌PBS（PH7.2），反復(fù)揉捏2 min，倒入已經(jīng)準(zhǔn)備好的滅菌離心管中即為肺泡灌洗液。每個(gè)灌洗液樣本均取10 mL，18 512×g、4℃離心30 min，分離上清和沉淀，其中上清于-20℃以下保存?zhèn)溆?；沉淀? mL無(wú)菌去離子水重懸，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，-20℃以下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 豬肺炎支原體血清抗體檢測(cè)試驗(yàn)豬在免疫前和免疫后第2 h、7 d、14 d以及28 d 采集血清，豬肺炎支原體檢測(cè)試劑盒（IDEXX）按說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中豬肺炎支原體特異性IgG抗體。

1.6 鼻拭子和肺泡灌洗液Mhp特異性sIgA檢測(cè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，統(tǒng)一取出-20℃以下保存的免疫前和免疫后第2 h、7 d、14 d以及28 d的鼻拭子浸泡液和肺泡灌洗液上清，參照Feng等[9]建立的豬肺炎支原體sIgA檢測(cè)方法，利用實(shí)驗(yàn)室自行組裝的豬肺炎支原體特異性sIgA檢測(cè)試劑盒，進(jìn)行豬鼻拭子和肺泡灌洗液中Mhp特異性sIgA檢測(cè)，酶標(biāo)儀上讀取OD450值，根據(jù)S/P值=（樣品OD450值-陰性對(duì)照OD450平均值）/（陽(yáng)性對(duì)照OD450平均值-陰性對(duì)照OD450平均值）計(jì)算S/P值。

1.7 豬肺泡灌洗液中豬肺炎支原體疫苗株含量檢測(cè)取出-20℃以下保存的肺泡灌洗液沉淀懸液，混勻，取其中200 uL，100℃水浴10 min后，12 857×g離心10 min，收集上清，即為real-time qPCR模板。利用實(shí)驗(yàn)室已建立的豬肺炎支原體real-time qPCR方法[9]進(jìn)行豬肺泡灌洗液中Mhp 疫苗株含量的測(cè)定。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法采用方差分析的新復(fù)極差法（即Duncan法）對(duì)各試驗(yàn)組之間的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 血清中Mhp特異性IgG抗體檢測(cè)采集免疫前和免疫后第2 h、7 d、14 d及28 d的血清，豬肺炎支原體血清抗體檢測(cè)試劑盒（IDEXX）檢測(cè)血清中Mhp特異性 IgG抗體，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，G0、G1和G2組所有豬血清抗體均為陰性，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)陽(yáng)現(xiàn)象。

2.2 鼻拭子和肺泡灌洗液中豬肺炎支原體特異性sIgA含量測(cè)定動(dòng)物實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束后，取出-20℃以下保存的鼻拭子浸泡液以及肺泡灌洗液上清，利用實(shí)驗(yàn)室研制的豬肺炎支原體sIgA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行豬肺炎支原體sIgA檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1A。由圖1A可知對(duì)照組實(shí)驗(yàn)豬的鼻拭子Mhp sIgA在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持陰性，沒(méi)有轉(zhuǎn)陽(yáng)；氣溶膠免疫組和肺內(nèi)免疫組的鼻拭子Mhp sIgA陽(yáng)性率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中氣溶膠免疫組在免疫后第7 d和14 d時(shí)陽(yáng)性率最高，為33.3%，肺內(nèi)免疫組在免疫后第7 d時(shí)最高，為44.4%。在免疫后第7 d和14 d時(shí)，氣溶膠免疫組平均S/P值相比對(duì)照組顯著升高（p＜0.05），但28 d有所下降，相比對(duì)照組差異不顯著（p＞0.05）。肺內(nèi)免疫組的鼻拭子Mhp sIgA在免疫后7 d和14 d平均S/P值相比對(duì)照組顯著升高（p＜0.05），但28 d有所下降，相比對(duì)照組差異不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。兩實(shí)驗(yàn)組之間比較，鼻拭子Mhp sIgA在免疫后的幾個(gè)監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)差異均不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。

肺泡灌洗液sIgA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1B。由圖1B發(fā)現(xiàn)氣溶膠免疫組肺泡灌洗液中的Mhp sIgA在免疫后第14 d開(kāi)始部分轉(zhuǎn)陽(yáng)（陽(yáng)性率為33.33%），到第28 d已全部轉(zhuǎn)陽(yáng)（陽(yáng)性率為100%），sIgA濃度相比對(duì)照組差異具備極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。而肺內(nèi)免疫組在免疫14 d時(shí)已全部轉(zhuǎn)陽(yáng)（陽(yáng)性率為100%），28 d時(shí)陽(yáng)性率也為100%，相比對(duì)照組差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。但免疫后14 d和28 d，兩實(shí)驗(yàn)組肺泡灌洗液中的平均Mhp sIgA濃度差異不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。

2.3 肺泡灌洗液中疫苗株含量測(cè)定由圖2可知，在免疫后第2 h、7 d、14 d和28 d，氣溶膠免疫組肺泡灌洗液內(nèi)平均Mhp疫苗株含量分別為0.848×104、1.986×104、2.038×104和1.266×104拷貝數(shù)/mL，分別是相應(yīng)肺內(nèi)免疫組的0.37倍、1.01倍、0.88倍以及0.52倍。而空白對(duì)照組全為陰性，未檢測(cè)出疫苗株。同一時(shí)間點(diǎn)兩免疫組之間比較，僅2 h時(shí)氣溶膠免疫組肺泡灌洗液內(nèi)Mhp疫苗株含量顯著低于肺內(nèi)免疫組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），其余時(shí)間點(diǎn)差異不顯著，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。

表1 免疫前后各試驗(yàn)組豬肺炎支原體血清IgG檢測(cè)結(jié)果Table 1 Mhp speci fic IgG antibody response in sera of vaccinated and Non-vaccinated piglets, respectively

圖1 免疫前后各試驗(yàn)組鼻拭子和肺泡灌洗液Mhp sIgA檢測(cè)結(jié)果Fig. 1 Mhp speci fic sIgA antibody response in nasal cavities and BALF of vaccinated and non-vaccinated piglets,respectively

3 討論

霧化免疫是通過(guò)霧化發(fā)生器，使疫苗形成一定大小的霧滴，均勻地懸浮于空氣中，隨呼吸進(jìn)入體內(nèi)。這種免疫方式對(duì)呼吸道有親嗜性的疫苗尤為有效，如雞新城疫疫苗和傳染性支氣管炎弱毒疫苗等[11]。疫苗通過(guò)噴霧免疫進(jìn)入體內(nèi)后，一方面在呼吸道粘膜局部刺激吞噬細(xì)胞分化漿細(xì)胞，產(chǎn)生局部抗體或干擾素的作用，另一方面被吞噬細(xì)胞吞噬后產(chǎn)生體液免疫。其免疫效果較好，如丁美娟等[12]對(duì)比了雞毒支原體氣霧免疫的免疫效果，發(fā)現(xiàn)氣霧免疫與點(diǎn)眼免疫同樣能產(chǎn)生良好的免疫效果。因霧化免疫省工省力，近年來(lái)在大型規(guī)模禽場(chǎng)、哺化場(chǎng)雞群越來(lái)越普及，但由于豬的呼吸道結(jié)構(gòu)特殊，普通的霧化免疫難以用于豬群免疫，而設(shè)計(jì)特殊粒徑要求的氣溶膠免疫在豬用疫苗研發(fā)上具有很好的前景。豬肺炎支原體主要定植在豬氣管上皮細(xì)胞上，對(duì)豬呼吸道具有很好的親嗜性，且豬肺炎支原體本身可通過(guò)空氣傳播[13]，這是豬支原體肺炎活疫苗在肺內(nèi)免疫的基礎(chǔ)上能夠開(kāi)發(fā)氣溶膠免疫途徑的前提條件。馮志新等[5]報(bào)道的豬支原體肺炎活疫苗氣溶膠免疫技術(shù)，解決了活疫苗如何通過(guò)氣溶膠進(jìn)入豬呼吸道的問(wèn)題。本研究在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討豬支原體肺炎活疫苗（168株）經(jīng)氣溶膠免疫途徑進(jìn)入免疫豬呼吸道和肺內(nèi)后的增殖情況，一方面通過(guò)血清抗體以及上呼吸道和下呼吸道sIgA的檢測(cè)驗(yàn)證該疫苗株誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答情況，更重要的是探討疫苗株經(jīng)氣溶膠免疫后在免疫豬體內(nèi)的增殖規(guī)律及其和sIgA抗體分泌規(guī)律的相關(guān)性。

圖2 肺泡灌洗液中豬肺炎支原體活疫苗（168株）熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of fluorescent qPCR detection of Mhp live vaccine (168 strains) in bronchoalveolar lavage fluid

本研究結(jié)果顯示無(wú)論是肺內(nèi)免疫還是氣溶膠免疫，在整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，始終沒(méi)有產(chǎn)生血清特異性IgG抗體，說(shuō)明豬支原體肺炎活疫苗（168株）經(jīng)氣溶膠免疫和肺內(nèi)注射免疫均不能有效誘導(dǎo)全身體液免疫，這一結(jié)果和馮志新等[4]研究結(jié)果一致。在黏膜免疫方面，姚景霆等[14]研究發(fā)現(xiàn)，豬肺炎支原體感染仔豬后第6 d，呼吸道中抗Mhp P36、P46、P97R1的3種特異性sIgA抗體分泌量均開(kāi)始上升，于感染后第12 d達(dá)到高峰，并可持續(xù)到第21 d。本研究發(fā)現(xiàn)兩試驗(yàn)組鼻拭子sIgA水平在免疫后第7～14 d均有所升高，相比對(duì)照組差異顯著，但到第28 d時(shí)又有所下降，結(jié)果與姚景霆等[14]研究結(jié)果一致，說(shuō)明氣溶膠免疫和肺內(nèi)免疫均能在一定時(shí)間內(nèi)短暫誘導(dǎo)免疫豬上呼吸道的黏膜免疫，為免疫豬提供早期保護(hù)。雖然在免疫后第28 d上呼吸道sIgA水平有所下降，但此時(shí)免疫豬已誘導(dǎo)了足夠的下呼吸道黏膜免疫，以此對(duì)免疫豬進(jìn)行保護(hù)。本研究發(fā)現(xiàn)，氣溶膠免疫組在免疫后第14 d部分樣品肺泡灌洗液中已檢測(cè)到Mhp sIgA抗體，28 d時(shí)所有免疫豬均有較高濃度的Mhp sIgA抗體水平，而肺內(nèi)免疫組在免疫后14 d已全部轉(zhuǎn)陽(yáng)，并持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。本研究還發(fā)現(xiàn)肺泡灌洗液sIgA濃度在免疫后第14 d后比同時(shí)間點(diǎn)鼻拭子sIgA濃度高許多，說(shuō)明豬支原體肺炎活疫苗（168株）具有更強(qiáng)烈的誘導(dǎo)下呼吸道黏膜免疫的功能，這一結(jié)果與馮志新等[15]早期研究結(jié)果一致。另一方面，在免疫后第28 d時(shí)兩試驗(yàn)組sIgA水平相互比較差異不顯著，說(shuō)明豬支原體肺炎活疫苗（168株）經(jīng)氣溶膠免疫誘導(dǎo)下呼吸道產(chǎn)生的黏膜免疫比經(jīng)肺內(nèi)免疫途徑相對(duì)較慢，但最終誘導(dǎo)的sIgA水平?jīng)]有差異，均能很好的誘導(dǎo)黏膜免疫。

黏膜免疫僅僅是豬支原體肺炎活疫苗的免疫機(jī)制之一，占位效應(yīng)是支原體活疫苗肺內(nèi)免疫和氣溶膠免疫的特殊免疫機(jī)制[6]，能夠阻止Mhp野毒的入侵，是豬肺炎支原體活疫苗的優(yōu)勢(shì)之一?；钜呙缯嘉恍Чc支氣管上皮細(xì)胞上疫苗株的黏附量直接相關(guān)。氣溶膠免疫組中霧化的疫苗株在免疫過(guò)程中就能接觸氣管上皮細(xì)胞表面，車巧林等[16]發(fā)現(xiàn)支原體僅需要1 h就能大量黏附宿主細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)在免疫后第2 h即可在肺泡灌洗液中檢出疫苗株。由于黏附力的作用，可能呼吸道中實(shí)際感染劑量要高于肺泡灌洗液中的檢出量，但在免疫后2 h，氣溶膠免疫組的疫苗載量要顯著低于肺內(nèi)免疫組，氣溶膠免疫組大量氣溶膠的散失導(dǎo)致較低的有效吸入量是造成組間差異的主要原因之一。肺內(nèi)免疫組呼吸道中大量殘存未感染黏附的疫苗株也可能是影響真實(shí)載量檢測(cè)的原因之一。盡管試驗(yàn)豬數(shù)量限制以及個(gè)體差異等因素影響了疫苗株定植規(guī)律的表現(xiàn)，感染7 d以后的數(shù)據(jù)或許更能反映疫苗株在呼吸道的定植情況。另外，馮志新等[17]前期研究發(fā)現(xiàn)，在霧化過(guò)程中產(chǎn)生的切割力，以及外環(huán)境等因素會(huì)造成疫苗活力的損失。在氣溶膠免疫時(shí)加大疫苗的免疫劑量或者在疫苗中添加保護(hù)劑和免疫增強(qiáng)劑是氣溶膠疫苗研發(fā)需要考慮的策略。在本實(shí)驗(yàn)中，在免疫后第7 d直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，氣溶膠免疫組和肺內(nèi)免疫組肺泡灌洗液中疫苗株的含量沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明兩種免疫途徑均能起到很好的占位作用。

Hua等[18]研究發(fā)現(xiàn)，豬肺炎支原體在呼吸道內(nèi)的含量與其誘導(dǎo)的黏膜免疫有關(guān)，鼻拭子Mhp sIgA水平越高，其病原含量越低。本實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，隨著免疫組下呼吸道特異性sIgA抗體的升高，免疫組呼吸道中疫苗株的增殖在免疫后第7 d后趨向平緩?；钜呙缯T導(dǎo)的黏膜免疫水平可能調(diào)節(jié)疫苗株在體內(nèi)的定植及復(fù)制，這一動(dòng)態(tài)的變化或許是影響疫苗免疫效力的主要因素之一，所以不能僅僅靠黏膜免疫或疫苗株定植情況的某一項(xiàng)指標(biāo)評(píng)判疫苗的免疫效力，需要綜合考慮所有因素，并進(jìn)一步做攻毒實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行疫苗保護(hù)率的確定。

豬支原體肺炎活疫苗（168株）經(jīng)氣溶膠免疫后，和肺內(nèi)免疫一樣可以誘導(dǎo)免疫豬的局部黏膜免疫，具有同等的占位效應(yīng)，經(jīng)氣溶膠免疫的疫苗株在免疫仔豬體內(nèi)的定植情況與其誘導(dǎo)的黏膜免疫水平有關(guān)。