新型鵝細(xì)小病毒研究進(jìn)展

卞國志，馬海彬，羅夢萍，龔鳳平，王貴平，廖 明，袁建豐

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院， 廣州510642 ；2.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司， 廣州 511400）

1956年我國首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)小鵝瘟，并于1961年分離得到該病的病原體鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus，GPV）[1]。而番鴨細(xì)小病毒病最早于1980年在我國出現(xiàn)，1993年由程由銓等[2]首次分離到番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）。GPV和MDPV引起的鴨細(xì)小病毒病呈全球流行，歐洲、東南亞、美洲等地區(qū)都有該病的報(bào)道[3-4]。經(jīng)典GPV毒株可感染雛鵝和雛番鴨，MDPV只感染雛番鴨[4]，但是兩者都不感染櫻桃谷鴨。

新型鵝細(xì)小病毒（Novel Goose Parvovirus，N-GPV）典型的臨床癥狀為軟腳、短嘴和生長障礙[5]。Villatte報(bào)道1971年該病癥首次出現(xiàn)在法國西南部的半番鴨群中，另外1995年和2009年分別在波蘭和匈牙利爆發(fā)[6]。國內(nèi)最早于1989年臺灣報(bào)道了1例由N-GPV和鴨肝炎病毒混合感染的病例[7]。N-GPV引起的細(xì)小病毒病在大陸最早出現(xiàn)在2008年，但是并未引起足夠重視[8]。2015年福建部分地區(qū)的半番鴨爆發(fā)此流行病，隨后陸續(xù)在山東省、河北省、河南省、安徽省和江西省的半番鴨和櫻桃谷鴨中出現(xiàn)，該病發(fā)病率10%～30%，病死率一般低于3%，僵鴨淘汰率高達(dá)80%，造成養(yǎng)鴨業(yè)巨大經(jīng)濟(jì)損失[9]。

1 病原學(xué)特征

1.1 形態(tài)MDPV和GPV屬于細(xì)小病毒科（parvoviridae）細(xì)小病毒亞科（parvovirinae）依賴病毒屬（Dependovirus），為單股鏈狀DNA病毒[10-12]。在電鏡下MDPV和GPV病毒粒子分為實(shí)心和空心兩種形態(tài)，直徑為20～24 nm，無囊膜，正二十面體對稱，衣殼由32個管樁排列的殼粒構(gòu)成[13]。MDPV與GPV在病毒大小、形態(tài)、基因組結(jié)構(gòu)等都很相似，發(fā)病癥狀也很相似[10]。

1.2 基因組MDPV、GPV和N-GPV的基因組序列差別不大，各分離株都在5.1 kb左右[14-16]。三者基因組都包括2個開放閱讀框，左側(cè)開放閱讀框（left open reading frame，LORF）編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，右側(cè)開放閱讀狂（right open reading frame，RORF）編碼結(jié)構(gòu)蛋白。非結(jié)構(gòu)蛋白有2個，分別為NS1和NS2，肽鏈長度NS1＞NS2，并且共用一個終止密碼子。結(jié)構(gòu)蛋白有3個，分別為VP1、VP2和VP3，肽鏈長度VP1＞VP2＞VP3，也具有同一個終止密碼子。LORF和RORF間隔18 nt。

非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural protein，NS）重要功能為參與病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)[17-18]。其中NS1參與病毒復(fù)制，并有結(jié)合ATP和抑制宿主細(xì)胞DNA復(fù)制等功能[19]。NS2對NS1的功能有促進(jìn)作用，此外NS2蛋白還可能與病毒增值以及DNA合成相關(guān)[18]。

結(jié)構(gòu)蛋白VP是病毒衣殼的組成成分，MDPV結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3大小分別為91、78、58 kDa。N-GPV和GPV結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3蛋白大小分別為87、70、60 kDa。MDPV、GPV和N-GPV的VP2蛋白是其主要免疫原性蛋白。與VP2蛋白相比，VP1、VP3蛋白的免疫原性較弱。

MDPV、GPV和N-GPV的基因組5'端均折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（圖1），發(fā)夾結(jié)構(gòu)呈“箭”形，兩端存在著相同的末端重復(fù)序列（inverted terminal repeat，ITR），長度約為440 bp，發(fā)夾結(jié)構(gòu)和ITR對病毒的復(fù)制起重要作用[20]。發(fā)夾結(jié)構(gòu)有約180 nt的“莖”部和45 nt的“泡”區(qū)構(gòu)成。“箭”頭上有限制性內(nèi)切酶SphI的酶切位點(diǎn)，是ITR的對稱中心。ITR含有多個4～10 bp的重復(fù)序列，如TTCCGG及其衍生體重復(fù)了18次。在復(fù)制過程中ITR或發(fā)夾結(jié)構(gòu)起到至關(guān)重要的作用。

圖1 MDPV和GPV病毒基因序列圖Fig.1 Genetic map of MDPV and GPV

1.3 核苷酸序列通過對2015年N-GPV爆發(fā)以來的7株分離株全基因組核苷酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，不同N-GPV的分離株全基因序列相似性為99.2%～99.7%。與2012年分離的經(jīng)典GPV LH株全基因組核苷酸相似性為93.4%～95.2%。與2015年分離的MDPV P1株全基因組核苷酸相似性為81.3%～83.4%，見圖2。

圖2 全基因組核苷酸序列比對Fig.2 Genome nucleotide sequence comparison

通過對2015年N-GPV爆發(fā)以來的7株分離株非結(jié)構(gòu)蛋白核苷酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，不同N-GPV的分離株非結(jié)構(gòu)蛋白序列相似性為99.1%～99.9%。與2012年分離的經(jīng)典GPV LH株非結(jié)構(gòu)蛋白核苷酸相似性為96.2%～96.4 %。與2015年分離的MDPV P1株非結(jié)構(gòu)蛋白核苷酸相似性為81.7% ～82.9%，見圖3。

圖3 非結(jié)構(gòu)蛋白核苷酸序列比對Fig.3 Non-structural protein sequence comparisons

通過對2015年N-GPV爆發(fā)以來的6株分離株結(jié)構(gòu)蛋白核苷酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，不同N-GPV的分離株結(jié)構(gòu)蛋白序列相似性為99.6%～99.9%。與2012年分離的經(jīng)典GPV LH株結(jié)構(gòu)蛋白核苷酸相似性為94.7%～95.0 %。與2015年分離的MDPV P1株結(jié)構(gòu)蛋白核苷酸相似性為80.4%～ 81.1%，見圖4。

圖4 結(jié)構(gòu)蛋白核苷酸序列比對Fig.4 Structural protein sequence comparisons

1.4 N-GPV關(guān)鍵突變位點(diǎn)分析VP2蛋白是決定病毒結(jié)合位點(diǎn)和宿主特異性的關(guān)鍵因素[21]。其結(jié)構(gòu)和氨基酸同源性分析證實(shí)N-GPV QH15株的VP2 3個不同表面位點(diǎn)（392、430和558位氨基酸）在GPV和MDPV中是有區(qū)別的。MDPV分別為I392、L430、N558或L392、K430、N558，GPV為L392、K430、D558，而N-GPV QH15株、GPV a2006株、GPV 1995株為I392、R430、N558，與MDPV和GPV都不同。暗示有可能是這些位點(diǎn)的變化導(dǎo)致GPV能在櫻桃谷鴨、半番鴨體內(nèi)復(fù)制并且致病[22]。

通過和其他GPV序列比對發(fā)現(xiàn)N-GPV SDLC01株的REP基因32位氨基酸由Asn替代了Ser，進(jìn)而影響了磷酸酯酶A2（phospholipase A2，PLA2）的催化區(qū)域和活性，從而導(dǎo)致鈣磷代謝的異常，導(dǎo)致骨發(fā)育異常，特別表現(xiàn)在喙、跖骨和翅骨。喙是由多個突出面組成，隨著鴨的生長，這些突出面共同組成鴨喙。喙的額鼻處有2個增生區(qū)域，這些區(qū)域和骨形成蛋白4有關(guān)?？赡苁怯捎诓《靖腥緦?dǎo)致骨形成蛋白4活性改變，導(dǎo)致鴨喙形狀的改變[6]。

2 致病特征

2.1 臨床癥狀N-GPV引起的病鴨臨床癥狀為舌頭腫脹、腹瀉、脛骨變短，此外還有喙變短，舌頭突出，生長障礙等[9]（圖5）。而典型的MDPV和GPV引起的鴨細(xì)小病毒病臨床癥狀按照發(fā)病情況分為最急性、急性和亞急性。最急性：多發(fā)生于6日齡內(nèi)番鴨，病程數(shù)小時(shí)，幾乎不出現(xiàn)前期癥狀就死亡，臨死前病鴨頭頸朝一側(cè)彎曲，兩腳呈游泳狀；急性型：多發(fā)生7～14日齡番鴨，病程2～4 d，前期癥狀為不同程度腹瀉、呼吸困難、兩腳無力、厭食；亞急性型：多發(fā)生14日齡以上的雛番鴨，病程5～7 d，癥狀與急性型相似，病死率較低[23]。比較發(fā)現(xiàn)N-GPV與典型細(xì)小病毒病的區(qū)別為喙變短，舌頭突出，具有很好的區(qū)分度。

圖5 N-GPV引起的病鴨典型癥狀Fig.5 Typical symptoms caused by N-GPV

2.2 剖檢特點(diǎn)感染N-GPV后的病鴨舌頭出現(xiàn)間質(zhì)性炎癥，舌部的結(jié)締組織疏松、水腫；胸腺出血、水腫，并有壞死點(diǎn)；腎小管存在出血、水腫和炎性細(xì)胞浸潤，肝臟輕微萎縮，胸腺腫脹和出血，其他器官無特征性病變[14]。而感染經(jīng)典GPV和MDPV的番鴨細(xì)小病毒病特征性病理變化為滲出性腸炎和胰臟壞死，另外還包括腸粘膜充血出血，胰臟蒼白，表面有灰白色壞死點(diǎn)，膽囊腫大，心肌束間有紅細(xì)胞滲出，血管擴(kuò)張，肝細(xì)胞局部有顆粒變性和脂肪變性，神經(jīng)細(xì)胞輕度變性，膠質(zhì)細(xì)胞輕度增生[1-2,24-25]。

與GPV和MDPV引起的癥狀相比，N-GPV的病理學(xué)變化更輕微，對組織的損傷相對較小。比較發(fā)現(xiàn)，3種毒株造成鴨群的發(fā)病率差異不顯著，但病死率差別很大。

3 流行病學(xué)

N-GPV感染宿主為櫻桃谷鴨和半番鴨，該病發(fā)病率10%～30%，病死率一般低于3%，僵鴨淘汰率高達(dá)80%[26]。GPV是小鵝瘟的病原，易感染4～20日齡的雛鵝和雛番鴨[1,27]。雛番鴨爆發(fā)典型GPV的發(fā)病率為50%～70%，病死率40%～65%。MDPV僅能感染番鴨并使之發(fā)病，并不能感染麻鴨、半番鴨、北京鴨、櫻桃谷鴨、鵝等，三周齡內(nèi)發(fā)病率40%～60%，死亡率20%～40%[4,28]。

表1 引起鴨細(xì)小病毒病的毒株比較Table 1 Comparison of virus strains that causing duck Parvovirus disease

通過表1可以看出，N-GPV不僅和經(jīng)典GPV和MDPV在宿主方面有很大差別，并且發(fā)病率相對較低，死亡率更是遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于GPV和MDPV引起的鴨細(xì)小病毒病。不過，這些毒株對鴨群的危害都集中在三周齡內(nèi)的雛鴨。

4 培養(yǎng)特性

MDPV初代分離只能用番鴨胚，病毒適應(yīng)鴨胚后，才可以在鵝胚中增值；GPV的分離培養(yǎng)能使用鵝胚和鴨胚，而N-GPV只能使用鴨胚分離，并不能在鵝胚中增值。GPV和MDPV接種鴨胚尿囊腔3～5 d后死亡，感染番鴨胚絨毛尿囊膜變厚，胚體充血，翅、頭、趾等部位有出血點(diǎn)[29]。N-GPV毒性較弱，接種鴨胚后連續(xù)4代才會死亡，死亡鴨胚尿囊膜增厚和呈灰色[30]。

番鴨胚成纖維細(xì)胞（muscovy duck embryo fibroblast cell，MDEFC）和番鴨胚腎細(xì)胞（muscovy duck embryo kidney cell，MDEKC）可用來增值MDPV。MDPV適應(yīng)細(xì)胞后，產(chǎn)生細(xì)胞病變和包涵體，形成藍(lán)色小噬斑。鵝胚或鴨胚成纖維細(xì)胞感染GPV 3～5 d后，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞變大、細(xì)變圓和脫落。連續(xù)DEF細(xì)胞傳代N-GPV第4代才能發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，新型鴨源鵝細(xì)小病毒能在DEF中培養(yǎng)，而不能在雞胚成纖維細(xì)胞中增值[16]。

5 免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)

凝集實(shí)驗(yàn)（latex agglutination，LA）表明新型鴨源鵝細(xì)小病毒和GPV抗原反應(yīng)陽性，與MDPV抗原反應(yīng)陰性。凝集抑制實(shí)驗(yàn)（latex agglutination inhibition，LAI）表明患N-GPV病鴨對MDPV和GPV抗體都是血清反應(yīng)陽性，不過GPV抗體滴度（25.0～29.6）明顯高于MDPV抗體滴度（22.2～26.4）。N-GPV病毒回歸實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雛鴨感染后7 d，部分對GPV抗體血清反應(yīng)陽性，感染后14～42 d全部攻毒鴨對GPV抗體血清反應(yīng)陽性[30-31]。

6 總結(jié)

目前，新型鵝細(xì)小病毒的感染范圍已經(jīng)擴(kuò)散到了北京市、山東省、河南省、河北省、江蘇省、浙江省、安徽省、湖北省、上海市、福建省、廣東省和廣西壯族自治區(qū)等12個省市區(qū)，而這些地區(qū)正是養(yǎng)鴨業(yè)的主產(chǎn)區(qū)。盡管N-GPV造成的死亡率不高，但耐過鴨由于生長障礙和畸形嚴(yán)重降低了其市場價(jià)值及經(jīng)濟(jì)效益，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大損失。

雖然我國2008年就出現(xiàn)了新型鵝細(xì)小病毒病，但2015年以前并未大區(qū)域爆發(fā)，分析可能原因是2015年該病毒發(fā)生了突變，導(dǎo)致其傳播能力突然增強(qiáng)，但也不排除大規(guī)模養(yǎng)殖模式對該病毒傳播的影響。目前典型的GPV疫苗仍可預(yù)防N-GPV的發(fā)生，但是該病毒仍在變異中，傳統(tǒng)小鵝瘟疫苗和抗體可能面臨失效的風(fēng)險(xiǎn)。

雖然該病自2015年爆發(fā)以來，國內(nèi)科研工作者都在研究其病原體來源、致病性、與其他毒株的差異性，但是其致病機(jī)理及演化過程還不清楚，需要進(jìn)一步研究。本研究旨在分析N-GPV的遺傳變異和與經(jīng)典GPV、MDPV的區(qū)別，為今后該病的研究及防控提供詳盡的技術(shù)支撐。