膽固醇-25-羥化酶基因抗病毒功能研究進(jìn)展

呂麗霞，趙貴民，王洪梅，侯佩莉，潘 偉，何洪彬

（1.山東師范大學(xué) 反芻動(dòng)物疾病研究中心，濟(jì)南 250014；2.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250014）

膽固醇-25-羥化酶（cholesterol-25-hydroxylase，CH25H）是一種大小為31.6 kDa的多跨膜內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）相關(guān)酶，其主要功能是以O(shè)2為附加底物，NADPH為輔助因子來催化膽固醇產(chǎn)生25-羥基膽固醇（25-hydroxycholesterol，25HC），減少膽固醇積累[1-3]。近期研究發(fā)現(xiàn)，CH25H是一種保守的干擾素刺激基因（interferonstimulated genes，ISGs），I型和II型干擾素（interferons，IFNs）與其受體結(jié)合后，通過JAKSTAT信號通路招募轉(zhuǎn)錄因子STAT1到CH25H基因的啟動(dòng)子近端區(qū)域誘導(dǎo)CH25H基因迅速表達(dá)[4-6]。25HC也可通過調(diào)節(jié)核受體和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element-binding proteins，SREBPs）的活性抑制膽固醇的生物合成[7]。

CH25H具有廣譜的抗病毒功能，主要是通過其酶活性產(chǎn)物25HC來發(fā)揮抗病毒作用，25HC能夠以自分泌和旁分泌的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞功能以保護(hù)細(xì)胞免受病毒感染。過表達(dá)CH25H基因或用25HC處理細(xì)胞后可通過不同的機(jī)制發(fā)揮其對囊膜病毒的抗病毒功能；25HC對一些非囊膜病毒的顯著抗病毒活性也已經(jīng)被報(bào)道[2-3,8-9]；CH25H也可以通過不依賴其酶活性的方式抑制病毒的復(fù)制[2,7]。

1 CH25H基因的表達(dá)與結(jié)構(gòu)特征

Lund等[10]首次克隆了小鼠和人的CH25H基因，該基因在正常情況下在體內(nèi)多種組織中表達(dá)水平很低。有研究發(fā)現(xiàn)，CH25H基因經(jīng)各種Toll樣受體配體誘導(dǎo)，IFNs信號通路被激活后，其在肝臟、心臟、腦、肌肉、腎臟和肺臟等組織中會(huì)迅速表達(dá)[7]。

目前在多種哺乳類、魚類、鳥類上已經(jīng)克隆出CH25H基因。我們對哺乳類、鳥類等物種中代表動(dòng)物的CH25H進(jìn)行分子遺傳進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，不同哺乳動(dòng)物之間具有種屬差異性，哺乳類與禽類各聚為一簇，斑馬魚與吐緩雞、綠頭鴨等禽類CH25H基因的同源性高達(dá)99%，哺乳動(dòng)物中人與牛、羊等反芻動(dòng)物CH25H基因的同源性比小鼠的高（圖1）。

圖1 不同物種CH25H基因進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of CH25H gene of different species

大多數(shù)脊椎動(dòng)物的CH25H由270～274個(gè)氨基酸殘基組成，以人源CH25H基因?yàn)槔L包括272個(gè)氨基酸殘基（aa1～272），主要分為2個(gè)結(jié)構(gòu)域：跨膜（transmembrane，TM）結(jié)構(gòu)域（aa1～135）和FA（FAase）結(jié)構(gòu)域（aa136～272），F(xiàn)A結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)組氨酸殘基簇：(142-Trp-His-Leu/Val-Leu-Val-His-His-148)、(157-Phe/Ile-His-Lys-Val/Met/Leu-His-His-162)、(238-His-His-Asp-Leu/Met-His-His-244)，而242、243位的組氨酸密碼子對CH25H的酶催化活性和羥基化反應(yīng)是必不可少的[7,11]。CH25H N端位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外，而3個(gè)活性位點(diǎn)組氨酸殘基簇位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)，表明CH25H是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)發(fā)揮其催化酶的催化作用[6]。

2 CH25H在脂肪代謝通路中的作用

在脂肪代謝通路中CH25H主要是通過其羥基化作用催化膽固醇產(chǎn)生膽固醇代謝的氧化中間體25HC。25HC是一種重要的膽固醇調(diào)節(jié)分子，能有效抑制膽固醇的生物合成和SREBPs的加工。SREBPs是一類調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞脂質(zhì)合成的轉(zhuǎn)錄因子家族[12]，通過調(diào)控膽固醇合成關(guān)鍵酶3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme A reductase，HMG-CoA）還原酶和HMGCoA合成酶的水平從而調(diào)控SREBP-1和SREBP-2兩種蛋白的功能。SREBP-1負(fù)責(zé)膽固醇和脂肪酸的合成，SREBP-2介導(dǎo)膽固醇的合成。25HC除了抑制SREBPs來控制脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)外，還可作為Nr5a1（SF-1）和肝X受體（LXR）的天然內(nèi)源性配體發(fā)揮作用，通過LXR的信號傳導(dǎo)來維持哺乳動(dòng)物細(xì)胞的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)[13-14]。在巨噬細(xì)胞中，LXR激活參與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因如ATP-結(jié)合盒A1（ABCA1）泵、促生存基因Cd5l、Bcl-xl和Birc1a等，并將其載入載體蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，而ABCA1泵能去除細(xì)胞內(nèi)的膽固醇，對細(xì)胞內(nèi)25HC活性有重要的負(fù)反饋控制作用[15-17]。

3 CH25H在病毒感染過程中的作用

膽固醇是細(xì)胞膜上豐富的脂質(zhì)，負(fù)責(zé)膜的包裝和流動(dòng)性。許多病毒的侵入和出芽釋放均受到細(xì)胞膜中膽固醇分布的影響，因此在膽固醇生物合成受到抑制時(shí)病毒的復(fù)制被抑制。CH25H可以催化膽固醇生成25HC，調(diào)節(jié)膽固醇代謝，并發(fā)揮廣譜的抗病毒作用[18-21]。已知控制細(xì)胞膽固醇水平的天然免疫反應(yīng)和穩(wěn)態(tài)途徑是相互調(diào)節(jié)的，早期發(fā)現(xiàn)25HC是眾所周知的固醇途徑的負(fù)反饋介質(zhì)，最新研究發(fā)現(xiàn)它可以在多個(gè)水平上介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的抗病毒功能[6]。

3.1 抗囊膜病毒25HC是一種天然存在的可以滲透膜的分泌型氧固醇[2]，它可通過多種機(jī)制抑制囊膜病毒的復(fù)制，見表1。目前研究發(fā)現(xiàn)，25HC可在病毒侵入、基因組復(fù)制、蛋白質(zhì)的合成等病毒復(fù)制周期的不同階段影響囊膜病毒的復(fù)制。

表1 CH25H抑制囊膜病毒概述Table 1 Overview of CH25H inhibition of envelope virus

3.1.1 25HC在病毒侵入階段發(fā)揮抗病毒作用 研究發(fā)現(xiàn)，25HC可以直接修飾細(xì)胞膜從而阻止人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）進(jìn)入，但不影響HIV的轉(zhuǎn)錄、翻譯或出芽過程[1,22]。塞卡病毒（Zika virus，ZIKV）和水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）感染細(xì)胞后內(nèi)源性CH25H基因的表達(dá)顯著上調(diào)，并且CH25H的酶活性產(chǎn)物25HC也可以以劑量依賴性方式阻斷病毒侵入細(xì)胞來抑制ZIKV和VSV的感染[1,23-24]。HCV（Hepatitis C virus，HCV）是一種正鏈RNA病毒，HCV能夠依賴低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）和SREBP1進(jìn)入細(xì)胞，25HC能夠通過影響LDLR抑制HCV侵入細(xì)胞[25-26]。對于病毒感染，SREBPs與HCV致病機(jī)制也緊密相關(guān)，HCV通過刺激PI3K/AKT信號傳導(dǎo)上調(diào)SREBP活性，25HC可以通過抑制SREBP-2活化，增強(qiáng)調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的microRNA-185的表達(dá)發(fā)揮其抗病毒作用，但其作用機(jī)制尚不清楚[5]。

3.1.2 25HC在病毒基因組復(fù)制階段發(fā)揮抗病毒作用 對于25HC抵抗HCV感染其他作用機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，25HC可以通過抑制雙膜囊泡的形成進(jìn)而抑制HCV基因組的復(fù)制[23]。皰疹病毒是一類具有囊膜包被的DNA病毒，在IFN信號通路中干擾素調(diào)節(jié)因子1（interferon regulatory factor 1，IRF-1）迅速誘導(dǎo)CH25H基因的表達(dá)上調(diào)，其酶活性產(chǎn)物25HC可通過抑制病毒復(fù)制后期DNA的合成，從而限制原代骨髓巨噬細(xì)胞中鼠γ皰疹病毒68（Maus Herpesvirus 68，MHV68）的復(fù)制[1,6,27]。

3.1.3 25HC在病毒蛋白質(zhì)合成階段發(fā)揮抗病毒作用 25HC還可通過影響病毒蛋白的翻譯后修飾（posttranslational modification，PTM）發(fā)揮抗病毒作用，如25HC通過抑制拉沙熱病毒（Lassa fever virus，LASV）糖蛋白GP1的糖基化發(fā)揮其抗病毒作用[28]。

3.1.4 CH25H以不依賴于其酶活性的方式發(fā)揮抗病毒作用 CH25H可以通過不依賴其酶活性的方式抑制病毒的復(fù)制，研究發(fā)現(xiàn)，CH25H可通過泛素蛋白酶體途徑降解豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的nsp1α蛋白，從而抑制PRRSV的復(fù)制[2]。HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A的Ⅰ結(jié)構(gòu)域也可以與CH25H基因的TM和FA結(jié)構(gòu)域相互作用從而抑制NS5A蛋白二聚體的形成，進(jìn)而抑制HCV的復(fù)制[7]。

3.2 抗非囊膜病毒25HC對脊髓灰質(zhì)炎病毒（Poliovirus）、人乳頭瘤病毒16型（Human papilloma virus，HPV-16）、人輪狀病毒（Human rotavirus，HRoV）、人鼻病毒（Human rhinovirus，HRhV）等非囊膜病毒具有顯著的抗病毒活性[2,8]。25HC能夠通過靶向氧固醇結(jié)合蛋白（oxysterol binding protein，OSBP）家族I的成員，減少4-磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 4-phosphate，PI4P）在高爾基體上的積累，從而抑制脊髓灰質(zhì)炎病毒的復(fù)制[21,29]。同樣，HRhV感染細(xì)胞后會(huì)形成富含PI4P的高爾基體膜，并依賴于這種機(jī)制來促進(jìn)自身RNA的復(fù)制，25HC通過與OSBP結(jié)合，將其鎖定在無活性狀態(tài)，導(dǎo)致PI4P在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和復(fù)制膜之間的穿梭受阻，從而抑制HRhV的復(fù)制[9,21]。

哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒（Reovirus）是一類具分節(jié)段的雙鏈RNA病毒。最新研究報(bào)道，呼腸孤病毒感染細(xì)胞后，先天免疫反應(yīng)誘導(dǎo)了CH25H基因的表達(dá)，25HC處理細(xì)胞后抑制了基因Ⅰ型和Ⅲ型呼腸孤病毒的感染。25HC并不會(huì)抑制呼腸孤病毒具有感染性的病毒樣粒子ISVPs，ISVPs仍然可以直接穿透細(xì)胞膜或早期內(nèi)體膜。25HC能夠在病毒入侵階段延遲呼腸孤病毒衣殼蛋白水解和脫殼，從而抑制病毒侵入細(xì)胞[3]。對25HC抗病毒作用機(jī)制的研究可以為新的抗病毒療法提供依據(jù)。

4 在免疫中的作用

氧固醇不僅在脂代謝中發(fā)揮重要作用，而且在免疫中也發(fā)揮重要功能，許多研究已經(jīng)表明它們在免疫中的重要性。B細(xì)胞表達(dá)的CH25H是免疫球蛋白A（IgA）的抑制劑，當(dāng)25HC處理初始B細(xì)胞后，B細(xì)胞增殖和類別轉(zhuǎn)換重組減少，從而抑制IgA的產(chǎn)生，可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)寄生菌的生長[15,33]。25HC的失調(diào)還與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)，25HC可以誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子和白細(xì)胞介素-8（IL-8）的表達(dá)[34]。在膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或TR1細(xì)胞中，I型IFN和白介素-27（IL-27）誘導(dǎo)CH25H基因的表達(dá)，25HC觸發(fā)LXR的激活，阻斷Tr1細(xì)胞的分化并通過抑制炎癥小體NLRP3從而抑制白介素-1β（IL-1β）和白介素-18（IL-18）的成熟[35]。

5 展望

越來越多的研究表明固醇通路中相關(guān)因子包括25HC在病毒感染過程中扮演著重要的角色。CH25H作為一種早期的天然干擾素應(yīng)答的效應(yīng)分子，更多研究發(fā)現(xiàn)了之前未被認(rèn)識(shí)到的生物學(xué)作用，即能夠發(fā)揮廣譜的抗病毒功能。STAT1與CH25H啟動(dòng)子結(jié)合使得天然免疫刺激、病毒感染和巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇分泌25HC之間具有了聯(lián)系。此外，人的CH25H基因作為一種ISGs仍存在爭議，而不同病毒感染宿主細(xì)胞后CH25H的表達(dá)也存在差異，如ZIKV、HIV等病毒感染宿主細(xì)胞后CH25H的表達(dá)被顯著上調(diào)，而PRRSV、HSV等病毒感染宿主細(xì)胞后CH25H的表達(dá)被顯著下調(diào)，可能是不同病毒感染宿主細(xì)胞后對CH25H表達(dá)調(diào)控的機(jī)制不同，而且人CH25H在肝臟內(nèi)的表達(dá)以及其對HCV感染后機(jī)體的內(nèi)在調(diào)節(jié)仍然不清楚，有待進(jìn)一步闡明。大量研究已經(jīng)證明了25HC在天然免疫防御病毒感染中的作用，但多數(shù)研究都是在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中進(jìn)行的，很少使用動(dòng)物模型，所以病毒感染的結(jié)果不僅取決于宿主控制病毒復(fù)制的能力，還取決于宿主對病毒的免疫反應(yīng)所造成的損害程度?？傊?，目前仍需要大量的研究以證明25HC在體內(nèi)不同病毒感染過程中所起的作用，并評估它作為抗病毒藥物的臨床潛力。