馬泰勒蟲新疆株EMA2基因的克隆及原核表達(dá)

張 楊，劉世芳，海尼木古力·艾合買提，王盼舉，宋瑞其，巴音查汗

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.托克遜縣夏鄉(xiāng)畜牧業(yè)服務(wù)中心，吐魯番 838100）

馬泰勒蟲病是由馬泰勒蟲（Theileria equi，T.equi）寄生于馬、騾、驢等馬屬動(dòng)物紅細(xì)胞內(nèi)而引起的一種原蟲病，該病的傳播媒介為硬蜱，如璃眼蜱和革蜱[1-2]，呈世界性流行，對(duì)全球馬產(chǎn)業(yè)的危害嚴(yán)重[3-4]。臨床上該病主要表現(xiàn)為發(fā)熱、貧血、黃疸和水腫，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致流產(chǎn)和死亡[5-6]。據(jù)報(bào)道，我國馬泰勒蟲病主要流行于新疆維吾爾族自治區(qū)、黑龍江省、吉林省、遼寧省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、青海省以及南方的一些省地區(qū)。尤其是新疆地區(qū)馬泰勒蟲感染率較高[7]，其中伊犁地區(qū)馬泰勒蟲感染率為34.44%[8]；阿勒泰馬匹馬泰勒蟲感染率為13.3%[9]；喀什地區(qū)驢感染馬泰勒蟲感染率為36.84%[10]；吉林省部分地區(qū)馬泰勒蟲病的陽性率為16.15%[11]；廣州、東莞、深圳馬泰勒蟲病平均抗體陽性率為13.3%[12]；貴州省三個(gè)馬群中馬泰勒蟲感染率為12.5%[13]。馬泰勒蟲病是全球獸醫(yī)界、公共衛(wèi)生及馬產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域普遍關(guān)注的焦點(diǎn)[14]。

裂殖子表面抗原是原生動(dòng)物界普遍存在的一類高度保守蛋白，其中T.equi裂殖子表面抗原蛋白家族中研究較多的是EMA1、EMA2 和 EMA3[15]，EMA 蛋白含有一個(gè)糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinosi-tol，GPI）錨定蛋白，被證實(shí)是蛋白與細(xì)胞膜結(jié)合的唯一方式，GPI錨定蛋白的C末端是通過乙醇胺磷酸鹽橋接于核心多糖上，該結(jié)構(gòu)高度保守，另有一個(gè)磷脂結(jié)構(gòu)將GPI錨連接在細(xì)胞膜上[16]，在T.equi膜表面的GPI錨定蛋白能通過周期性的改變逃避宿主免疫[17]。國內(nèi)外研究證明，EMA蛋白因其高度的保守性被作為馬泰勒蟲病ELSIA檢測(cè)中運(yùn)用最廣泛的蛋白。Donald[18]曾通過原核表達(dá)，獲得了EMA-1蛋白，用于CI ELISA。現(xiàn)階段，馬泰勒蟲病的血清學(xué)檢測(cè)方法多依賴于國外進(jìn)口試劑盒，存在成本高昂，且耗時(shí)，國外蟲株和國內(nèi)流行蟲株存在有一定差異性，在診斷的準(zhǔn)確性方面還有待商榷。本試驗(yàn)擬構(gòu)建T.equi新疆株EMA2基因原核表達(dá)載體，可為后續(xù)馬泰勒蟲病ELISA抗原檢測(cè)方法和EMA2蛋白的功能及機(jī)制進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 蟲株、質(zhì)粒和菌株T.equi新疆株由本實(shí)驗(yàn)室保存；pEASY-E1載體、大腸桿菌 DH5α、BL21細(xì)胞購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑全血、組織 DNA 提取試劑盒購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；TaqDNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、DNA DL2000、膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒等均購于寶生物工程（大連）有限公司；Blue Plus Protein Marker、pEASY-T1克隆試劑盒、pEASY-E1表達(dá)試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；增強(qiáng)型 ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 引物合成參照文獻(xiàn)合成T.equiEMA2 序列特異性引物，上游引物F8：5'-TTTTACCCTCGCAT ACTTG-3'、下游引物R8：5'-GCCATAGACGG AGAACCC-3'，由北京鼎國生物技術(shù)公司合成。

1.4 基因組的提取及目的基因的擴(kuò)增基因組的提取按照全血、組織提取試劑盒說明進(jìn)行，-20℃保存?zhèn)溆?。蟲體總核酸為模板，進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系（50 μL）：10×PCR緩沖液5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，rTaq聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，DNA模板2 μL，上下游引物（10 pmol/L）各1.5 μL，加DEPC水至50 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。取5 μL PCR 產(chǎn)物，于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 重組表達(dá)載體pEASY-E-TE的構(gòu)建及鑒定使用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，與pEASY-E1載體連接后轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp+的LB瓊脂平板上37℃過夜培養(yǎng)，挑取白色單菌落，接種于含氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB中振搖培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，命名為pEASYE-TE，并送至生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.6 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將含有重組質(zhì)粒pEASYE-TE菌液按照1∶100接種于含有抗性的LB液體培養(yǎng)基中，pEASY-E1空載體同步轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞作對(duì)照，37℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測(cè)。

1.7 目的蛋白的Western blot分析將SDS-PAGE分離的條帶轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用T.equi陽性血清（1∶200）作為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗馬IgG（1∶5000）為二抗，加入ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，X光曝光，顯影，定影后分析結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 T.equi EMA2基因的擴(kuò)增與重組表達(dá)載體pEASYE-TE 的構(gòu)建及鑒定以T.equi全基因組為模板，用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，獲得了約819 bp的特異性 DNA 片段（圖1），與預(yù)期的片段大小相一致。構(gòu)建的重組表達(dá)載體pEASY-ETE的測(cè)序結(jié)果通過Blast比對(duì)，與Genbank中T.equi裂殖子表面抗原2的mRNA（GenBank登錄號(hào)：XM004831448.1）高度同源。

圖1 EMA2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR-ampli fied EMA2 gene

2.2 目的蛋白的原核表達(dá)與鑒定重組表達(dá)載體pEASY-E-TE和空載體pEASY-E1經(jīng)IPTG誘導(dǎo)5 h，SDS-PAGE 檢測(cè)結(jié)果顯示，表達(dá)載體在約35 kDa處有1條明顯的表達(dá)帶，與預(yù)期的重組蛋白大小相符，獲得的重組蛋白命名為rEMA2而空載體無相應(yīng)條帶（圖2）。真核生物的基因絕大多數(shù)是斷裂基因，有外顯子和內(nèi)含子，基因被表達(dá)出來后，內(nèi)含子被切除，外顯子連接在一起，成為成熟mRNA，即可以進(jìn)行翻譯蛋白質(zhì)。在部分原生動(dòng)物中的某些基因中是不含內(nèi)含子的，通過擴(kuò)增馬泰勒蟲的EMA2基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體并純化重組蛋白，也反映出馬泰勒蟲裂殖子表面抗原基因不含內(nèi)含子序列。

圖2 重組蛋白rEMA2的SDS-PAGE表達(dá)結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE results of rEMA2 expression

2.3 重組蛋白rEMA2的Western blot分析免疫印跡結(jié)果顯示表達(dá)的重組rEMA2蛋白在約35 kDa出現(xiàn)特異性條帶（圖3），表明構(gòu)建的重組蛋白具有較好的反應(yīng)原性。Kumar等[19]表達(dá)了EMA1和EMA2蛋白，大小分別為34 kDa和30 kDa，而本實(shí)驗(yàn)所表達(dá)的EMA2蛋白的大小約為35 kDa。EMA2 蛋白作為T.equi自身高度保守的蛋白之一，其表面GPI錨定蛋白對(duì)于T.equi入侵宿主細(xì)胞及逃避宿主免疫等相關(guān)入侵機(jī)制機(jī)理至關(guān)重要，故重組蛋白rEMA2為后續(xù)進(jìn)一步探索 EMA2 靶基因及其相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

圖3 重組蛋白rEMA2 Western blot分析Fig.3 rEMA2 of Western blot analysis