一株豬細小病毒7群的鑒定和分離

張 志，張麗麗,2，劉 爽，吳發(fā)興，李曉成，王樹雙

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，青島266032；2.青島農(nóng)業(yè)大學，青島 266019）

豬細小病毒（Porcine parvovirus，PPV）屬于細小病毒科，是一種單股非囊膜線性DNA病毒，基因組大小為4～6.3 kb，由5'端非翻譯區(qū)、非結(jié)構(gòu)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和3'端UTR組成[1]。PPV主要引起豬的木乃伊胎、不孕不育、早期胚胎死亡、死胎等繁殖障礙癥狀，是影響?zhàn)B豬業(yè)的重要病原之一。數(shù)十年來，隨著PPV疫苗的普遍應用，豬細小病毒病的危害逐漸減輕，多呈散發(fā)和零星發(fā)生[2]。但是，近十年間，隨著檢測技術(shù)的提高和新型檢測技術(shù)的運用，又陸續(xù)從豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)和鑒定了6種不同的細小病毒（PPV2～7）[3-8]，根據(jù)細小病毒的分子遺傳演化特征，國際病毒分類專業(yè)委員會重新對細小病毒進行了分類，將細小病毒亞科調(diào)整為8個屬，這些PPV分別屬于不同的細小病毒屬，其中，傳統(tǒng)的PPV1仍然歸屬于經(jīng)典的Prothoparvovirus屬，PPV2～3則歸屬于Tetraparvovirus屬，PPV4～6屬于Copiparvovirus屬[9]。PPV-7是2016年首次從美國健康豬的棉拭子中通過基因組測序發(fā)現(xiàn)的新的PPV，它與細小病毒的其他屬之間的同源性較低，其病毒的ORF與狐蝠細小病毒2和火雞細小病毒TP1-2012/HUN[8]毒株之間的同源分別為42.4%和37.9%，因此Palinski等[8]建議把這3種病毒歸為一個新的屬Chapparvovirus。2017年，我國Xing等[10]提取廣東某2個商品代豬場的豬血清DNA，運用PCR方法從中檢測到了PPV-7，表明我國已經(jīng)有PPV-7的感染，但發(fā)病豬群的病料中能否直接檢測出PPV-7尚未知。為此，本研究從我國某些豬場中采集了病料，進行PPV-7檢測，進一步對陽性樣品進行了病毒分離鑒定，結(jié)果證實我國豬群存在新的PPV-7感染。

1 材料和方法

1.1 樣品來源20份豬病料樣品，采集自福建省、山東省、河南省等省份的發(fā)病豬群。其中10份來自流產(chǎn)胎兒，10份來自保育仔豬。

1.2 主要試劑寶生物染料法熒光定量試劑盒（RR390A）、Premix Ex-Taq酶、pMD18-T載體和DH5α感受態(tài)細胞為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品，病毒DNA提取試劑盒（DNAZol）、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶等為Life公司產(chǎn)品，PK-15細胞由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心畜病監(jiān)測室保存。

1.3 引物設(shè)計參考PPV-7基因組序列（Genbank登錄號：KU563733）和參考文獻[10]的檢測方法，設(shè)計引物，詳見表1。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 本文使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 real-time qPCR檢測方法根據(jù)DNAZol說明書從豬樣品中提取基因組DNA，作為PPV-7 real-time qPCR的模板。real-time qPCR反應體系：Premix EX-Taq反應液12.5 μL，PPV7-F1（10 μmol/mL）、PPV7-R1（10 μmol/mL）和熒光探針PPV7-P1（5 μmol/mL）各1 μL，待測DNA樣品 2 μL，用ddH2O 補充至25 μL；real-time qPCR的反應擴增條件：95℃預變性3 min，95℃變性5 s、60℃延伸14 s，共45個循環(huán)，60℃讀取熒光。

1.5 常規(guī)PCR檢測方法對real-time qPCR方法檢測PPV-7陽性樣品再進行常規(guī)PCR擴增。常規(guī)PCR擴增引物為PPV7-3430F和PPV7-3675R，序列見表1，預期擴增246 bp大小的序列。常規(guī)PCR的反應體系：25 μL 2×Premix，1 μL PPV7-3430F（10 μmol/mL），1 μL PPV7-3675R（10 μmol/mL），2 μL樣品DNA模板，補充ddH2O至50 μL。PCR的反應程序：95℃預變性3 min，95℃變性 30 s、55℃ 退火30 s，72℃ 延伸30 s，共33個循環(huán)，72℃延伸10 min，然后電泳觀察擴增結(jié)果。

1.6 測序和測序結(jié)果分析將常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性質(zhì)粒并測序。選擇GenBank中已登錄的PPV1～6等其他6種不同屬的細小病毒毒株和2株P(guān)PV-7毒株的序列作為參考毒株序列（表2），利用DNAStar和CLUSTALW1.83等軟件進行核苷酸序列比對、同源性分析，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，并以Bootstrap值1000驗證進化樹的可信度。

表2 本文構(gòu)建同源進化樹選擇的參考毒株Table 2 Some reference strains selected to construct the homology tree in this study

1.7 其他病原的檢測采用參考文獻[11]方法，同時檢測1.4提取的樣品DNA中是否存在豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus 2，PCV 2）、豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）、牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus，BVDV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬乙型腦炎病毒（Porcine encephalitis virus，PEV）。

1.8 病毒分離和傳代將PPV-7的陽性樣品同步接種PK-15細胞，3 d后將接種細胞凍存，然后再繼續(xù)同步接種PK-15細胞，如此連續(xù)傳代5次，記錄有無細胞病變。

2 結(jié)果

2.1 樣品中PPV-7的檢測結(jié)果real-time qPCR方法檢測10個流產(chǎn)胎兒樣品和10個保育仔豬樣品顯示，10個流產(chǎn)胎兒樣品中未檢測到PPV-7，但10個保育仔豬樣品中有1份樣品陽性，詳見圖1。同時，常規(guī)PCR方法的檢測結(jié)果顯示，該樣品可以擴增出1條246 bp左右的特異性條帶，而其他樣品均未擴增出特異性條帶，見圖2。

2.2 序列分析將擴增產(chǎn)物連至PMD18-T載體，篩選陽性質(zhì)粒，送去測序。結(jié)果顯示，該序列長度為246 bp，與PPV1～6的同源性分別為36.1%、32.9%、37.0%、39.8%、40.2%、30.9%，與另外2株P(guān)PV7（42和GD-2014-2）的同源性分別為99.6%和98.0%，見圖3，這表明該毒株為PPV-7屬的病毒。本研究獲得的PPV-7毒株序列與PPV-7 2株參考毒株類似，在第3059處發(fā)生一段10 bp的缺失，而PPV-1、PPV-4、PPV-5和PPV-6等屬只有6個bp的缺失，PPV-2和PPV-3在此位置無缺失，見圖4。從遺傳進化樹上也可以看出，本文所得到的陽性樣品中的病毒與PPV-7的其他株病毒屬于同一個進化分支，見圖5。

2.3 其他病原的檢測結(jié)果對樣品中的CSFV、PCV2、PRV、BVDV、PRRSV、PEV 6種病原體檢測結(jié)果均為陰性。

2.4 PPV-7的細胞分離結(jié)果將鑒定PPV-7陽性樣品接種至PK-15細胞，培養(yǎng)3 d均未發(fā)現(xiàn)明顯的細胞病變，連續(xù)傳代5次后，均未發(fā)現(xiàn)明顯的細胞病變，接毒細胞與陰性正常細胞的形態(tài)沒有明顯差異。但取上清液進行real-time qPCR時發(fā)現(xiàn)，每一代次的上清液均可以檢測出PPV-7，而且不同代次之間的Ct值有所變化。第1～5代的Ct值分別為24.04、27.21、29.56、29.39、31.12，Ct值呈逐漸下降的趨勢，這表明PPV-7盡管能在PK-15細胞上生長和增殖，但適應性并不好，所以其滴度不高。

圖1 20份樣品中PPV-7的real-time qPCR檢測結(jié)果Fig.1 Ampli fication of PPV-7 from 20 samples by real-time qPCR

圖2 樣品中PPV-7的PCR檢測結(jié)果Fig.2 PPV-7 detection of samples from nursery piglets byPCR

圖3 不同細小病毒毒株同源性比較Fig.3 The homology analysis of different PPV strains

3 討論

近年來，二代測序、三代測序等高通量測序技術(shù)得到了快速發(fā)展，這些新技術(shù)在新病原檢測上的應用日益廣泛，由此一些新病原體不斷被發(fā)現(xiàn)[12-13]。在豬細小病毒中，PPV-7和PPV-6都是首先利用高通量檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)的新型豬細小病毒[8,14]，隨后開展的病毒全基因組測序和流行病學研究也是基于此，高通量測序技術(shù)已經(jīng)成為開展疫病流行病學監(jiān)測和調(diào)查等研究工作必不可少的技術(shù)之一。本研究最初設(shè)計時擬先對20份樣品進行PPV-7的檢測，如果沒有發(fā)現(xiàn)PPV-7，則進行高通量測序，結(jié)果檢測出陽性樣品，其序列與PPV-7參考株42和GD-2014-2間的同源性分別為99.6%和98.0%，根據(jù)病毒分類規(guī)則，如果病毒之間的同源性超過了85%，則屬于同一種病毒，這表明該病毒為PPV-7。并且該樣品中同時沒有檢測到豬瘟等多種病毒，下一步擬通過高通量測序技術(shù)，進一步確證該樣品中存在哪些病原體。

細小病毒感染的宿主眾多，豬、鴨、鵝、虎、犬等都可以感染[15-17]，這就導致細小病毒的分類比較復雜，根據(jù)ICTV的分類[9]，細小病毒亞科分為8個屬，除此以外還有一些細小病毒的分類地位沒有確定，Palinski等[8]建議新建一個屬Chapparvovirus，將PPV-7歸于其中，但由于目前的PPV-7毒株較少，這一新的細小病毒屬尚存在爭議。本文新發(fā)現(xiàn)的PPV-7病毒為該屬的確立提供了更多的證據(jù)。

圖4 不同細小病毒毒株序列的對比分析Fig.4 The comparison of DNA sequences among PPV strains

圖5 不同細小病毒毒株的進化樹分析（ML法）Fig.5 The phylogenetic tree of different PPV strains using maximum likelihood estimators

經(jīng)典PPV引起豬的臨床癥狀主要是流產(chǎn)、死產(chǎn)、木乃伊、死胎和不育[18]，因此本研究在選擇樣品時，分別選擇了10份流產(chǎn)胎兒和10份保育仔豬的樣品進行檢測，結(jié)果保育仔豬樣品中檢測到了PPV-7，而流產(chǎn)胎兒沒有檢測到PPV-7，這是否意味著流產(chǎn)并不是PPV-7引起的主要癥狀？由于本研究采集的樣品較少，這一推測還需要更多的實驗數(shù)據(jù)驗證。對于近年來發(fā)現(xiàn)的PPV-2～7等幾種新細小病毒屬來說，不但這些病毒的組織分布比較廣泛、組織親嗜性也不相同，如PPV-4首先從肺灌洗液中發(fā)現(xiàn)，PPV-5首先發(fā)現(xiàn)于肺組織中，PPV-6首先從流產(chǎn)胎兒中發(fā)現(xiàn)，PPV-7首先發(fā)現(xiàn)于成年豬的直腸棉拭子和血清中，而且除了PPV-1以外，其他屬病毒的致病性尚不明確，不同屬之間病毒的致病性差別也較大[7,19-20]。本研究采集的病料來自流產(chǎn)胎兒和保育仔豬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)保育仔豬中也可以檢測到PPV-7，這一結(jié)果提示，在PPV-7采樣監(jiān)測時選擇保育仔豬的樣品似乎更好。

美國學者Palinski等[8]報道，采集的不同樣品中，PPV-7的感染率不同，95份血清中2份檢測到PPV-7，29份直腸和鼻腔棉拭子中5份檢測到PPV-7，29份肺灌洗液中4份檢測到PPV-7。而我國Xing等[10]從2個豬場的64份血清中21份檢測到PPV-7，而這些血清均來自2014年，至今已有3年的歷史，這表明我國的PPV-7感染至少可以追溯到3年以前。更令人擔心的是，3年來國內(nèi)無人對PPV-7的感染和流行狀況做過任何研究，也沒有采取過任何相關(guān)措施。

另外，PPV的生長和增殖的細胞比較多，如PK-15、PT、PFT和PK等[21]，本研究在不清楚PPV-7生長特性的前提下參照經(jīng)典PPV-1毒株的分離和培養(yǎng)方法，用PK-15細胞對PPV-7陽性樣品進行了同步接毒和連續(xù)盲傳，但盲傳至5代時仍未見到明顯的細胞病變，而上清液中仍然可以檢測PPV-7核酸，說明PPV-7能在PK-15細胞中增殖，但PK-15不是其最佳的培養(yǎng)細胞或者在PK-15細胞上的培養(yǎng)條件還需要改進和提高，從而增加病毒的滴度。