東方田鼠感染日本血吸蟲前后血常規(guī)和血清生化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化

柴淑梅 ，張 倩 ，翟 頎 ，余新剛 ，洪 煬 ，陸 珂 ，李 浩 ，林矯矯 ，柏熊 ，謝建蕓，傅志強(qiáng)

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203）

日本血吸蟲?。╯chistosomiasis japonicum）是一種危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病。日本血吸蟲（Schistosoma japonicum，S. japonicum）是該病病原，可寄生于7屬41種哺乳動(dòng)物，不同種類的宿主對日本血吸蟲感染的適宜性差異較大[1]。根據(jù)血吸蟲在感染宿主體內(nèi)的生長發(fā)育情況，可將宿主分為適宜宿主和非適宜宿主。東方田鼠（Microtus fortis，M.fortis）是我國迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一種具有天然抗日本血吸蟲病特征的哺乳動(dòng)物。日本血吸蟲在東方田鼠體內(nèi)先后經(jīng)歷皮膚期童蟲、肺期童蟲及肝期童蟲的發(fā)育過程，最終在肝臟消亡[2]。多位學(xué)者從血清、組織蛋白質(zhì)組學(xué)和差異基因等多個(gè)途徑研究了東方田鼠與其他宿主之間差異，然而東方田鼠天然抗日本血吸蟲的機(jī)制仍然是一個(gè)未解之謎[3-4]。

血吸蟲尾蚴侵入終末宿主皮膚后通過毛細(xì)血管和毛細(xì)淋巴管進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，此后在其中生長發(fā)育。血液不僅為蟲體生長發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)，也是宿主對其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要環(huán)境，因此分析血液中的免疫細(xì)胞和生化物質(zhì)是了解宿主和血吸蟲相互作用的重要途徑。邵偉娟等[5-6]測定了東方田鼠正常生理狀態(tài)下的血液和生化血清指標(biāo)，結(jié)果顯示部分指標(biāo)與小鼠有差異。本研究比較分析了BALB/c鼠、東方田鼠未感染和感染日本血吸蟲后不同時(shí)間點(diǎn)的血常規(guī)和生化各項(xiàng)指標(biāo)變化情況。

1 材料與方法

1.1 生物材料清潔級東方田鼠長江亞種（70 g，雄性）由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供；BALB/c鼠（25 g，雄性）購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司；日本血吸蟲中國大陸株尾蚴由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物血吸蟲病研究室提供。

1.2 主要儀器血細(xì)胞分析儀（邁瑞B(yǎng)C5300），生化分析儀（邁瑞B(yǎng)S200），TOMY全自動(dòng)高壓滅菌鍋（SX-500，日本TOMY公司），純水/超純水一體化系統(tǒng)（Millipore公司）。

1.3 血常規(guī)檢測東方田鼠、BALB/c鼠各20只，分別腹部攻擊感染日本血吸蟲尾蚴100條，并在感染后第0、1、3、5、8、12、16、21、28、35、42 d進(jìn)行尾部毛細(xì)管采血 20 μL。將采集血液迅速轉(zhuǎn)移到含180 μL稀釋液的1.5 mL離心管中吹打混勻，放置2 min 后采用血細(xì)胞分析儀檢測。檢測指標(biāo)包括：白細(xì)胞（white blood cell，WBC）、嗜中性粒細(xì)胞（neutrophils，Neu）、淋巴細(xì)胞（lymphocyte，Lym）、單核細(xì)胞（monocytes，Mon）、嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophil，Eos）、嗜堿性粒細(xì)胞（basophil，Bas）、紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）、血紅蛋白（hemoglobin，HGB）、血細(xì)胞壓積（packcd cell volume，HCT）、紅細(xì)胞平均容量（mean corpuscular volume，MCV）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白容量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）、紅細(xì)胞平均血細(xì)胞濃度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）和血小板計(jì)數(shù)（platelet，PLT）。所有樣本均在2 h內(nèi)檢測完畢。

1.4 血清生化檢測東方田鼠、BALB/c鼠各40只，分別腹部攻擊感染日本血吸蟲尾蚴100條，并在感染后第0、1、3、5、8、12、16、21、28、35、42 d進(jìn)行摘眼球采血并處死。全血室溫下靜置30 min，4℃靜置30 min，400×g離心15 min，收集血清-20℃保存?zhèn)溆?。生化指?biāo)包括總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、前白蛋白（prealbumin，PA）、高密度脂蛋白膽固醇（highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、載脂蛋白A1（apolipoproteinⅠ，ApoA1）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）、補(bǔ)體C3 （complement C3）和補(bǔ)體C4（complement C4）等。

2 結(jié)果

2.1 血細(xì)胞變化血常規(guī)檢測東方田鼠感染血吸蟲前后血細(xì)胞含量及其變化（表1）發(fā)現(xiàn)，東方田鼠感染日本血吸蟲尾蚴后第1～16 d期間WBC、Neu、Lym、Mon、Eos、Bas等顯著高于感染前（0 d），BALB/c鼠感染后血象變化稍有差異，但不顯著（表2）。比較小鼠與東方田鼠的白細(xì)胞分類含量及其變化發(fā)現(xiàn)，東方田鼠感染日本血吸蟲尾蚴第1～16 d 期間WBC顯著高于正常值，主要原因是Neu的顯著升高；而小鼠感染血吸蟲后WBC數(shù)量升高，但只有第5、16 d顯著高于感染前（0 d），且在正常參考值之內(nèi)，可能與Eos和Lym的升高相關(guān)（圖1）。

圖1 東方田鼠、BALB/c鼠感染日本血吸蟲后白細(xì)胞及分類細(xì)胞變化趨勢Fig.1 The dynamic changes of white blood cell and its classi fication from S. japonicum-infected Microtus fortis and BALB/c mouse

表1 東方田鼠感染日本血吸蟲前后血細(xì)胞指標(biāo)Table 1 Blood cell indexes of Microtus fortis before and after infection of Schistosoma japonicum

表2 BALB/c 小鼠感染日本血吸蟲前后血細(xì)胞指標(biāo)Table 2 Blood cell indexes of BALB/c mice befor e and after infection of Schistosoma japonicum

2.2 血清生化變化東方田鼠、BALB/c鼠感染日本血吸蟲尾蚴前后血清生化指標(biāo)含量及其結(jié)果見表3～4。東方田鼠感染后ALB、HDL-C顯著升高，BALB/c鼠IgG、IgM在感染后第4周顯著升高，其他指標(biāo)變化不顯著。比較東方田鼠和小鼠的各指標(biāo)結(jié)果表明，東方田鼠血清TP、LDL-C、ApoA1、PA含量高于小鼠，IgM、HDL-C含量低于小鼠（圖2）。

表3 東方田鼠感染日本血吸蟲前后血清生化指標(biāo)Table 3 Blood biochemical indexes of Microtus fortis before and after infection of Schistosoma j

表4 BALB/c 小鼠感染日本血吸蟲前后血清生化指標(biāo)Table 4 Blood biochemical indexes of BALB/c mice befor e and after infection of Schistosoma japonicum

3 討論

日本血吸蟲可自然寄生于40多種哺乳動(dòng)物，唯獨(dú)不能在東方田鼠中發(fā)育成熟，這一獨(dú)特的生物學(xué)現(xiàn)象及抗性機(jī)制引起了廣泛關(guān)注。宿主和寄生蟲的相互作用是寄生蟲能否完成生活史和宿主發(fā)病情況的重要因素[7]。東方田鼠對日本血吸蟲的抗性為研究宿主殺傷血吸蟲，控制和限制感染的宿主-寄生蟲相互作用提供了良好的模型系統(tǒng)。血吸蟲尾蚴侵入東方田鼠皮膚后進(jìn)入其循環(huán)系統(tǒng)，血液是血吸蟲童蟲賴以生存攝取營養(yǎng)的主要環(huán)境，其中的細(xì)胞和生化物質(zhì)可能是其抵抗感染的重要因素，因此分析東方田鼠感染日本血吸蟲尾蚴后血細(xì)胞和生化物質(zhì)的含量及其變化可為抗性機(jī)制的研究提供線索。

天然免疫細(xì)胞是參與先天性免疫應(yīng)答的免疫細(xì)胞統(tǒng)稱，包括吞噬細(xì)胞（單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等）和非吞噬性先天性免疫細(xì)胞（NK、NKT等）。這些細(xì)胞在先天性免疫應(yīng)答中起重要作用，也可通過分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[8-9]。蔣偉斌等[10]表明，東方田鼠感染日本血吸蟲后第3～16 d血液嗜酸性粒細(xì)胞具有趨化性和粗大的嗜酸性顆粒，顆粒內(nèi)含有過氧化物酶和酸性磷酸酶，能有效的殺滅寄生蟲，劉金明等[11]發(fā)現(xiàn)東方田鼠EOS能粘附在日本血吸蟲童蟲表面，是否起到殺蟲作用仍然未知。胡媛等[12]在東方田鼠免疫抑制模型中成功抑制了淋巴細(xì)胞的增值，但東方田鼠對日本血吸蟲感染的表型沒有改變，推測淋巴細(xì)胞在東方田鼠抗血吸蟲病機(jī)制中可能不發(fā)揮直接作用。本研究分析比較了東方田鼠和BALB/c鼠感染日本血吸蟲后血常規(guī)五分類的含量和動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果表明東方田鼠外周血中Neu的含量顯著大于BALB/c鼠的正常參考值，而且其變化趨勢與感染過程有一定的相關(guān)性。中性粒細(xì)胞具有變形運(yùn)動(dòng)和吞噬活動(dòng)的能力，細(xì)胞表面具有補(bǔ)體和免疫球蛋白受體，是機(jī)體對抗病原最重要的防衛(wèi)系統(tǒng)[13]。提示Neu可能在東方田鼠抗日本血吸蟲機(jī)制發(fā)揮了重要作用，可能與補(bǔ)體殺傷日本血吸蟲機(jī)制相關(guān)。

圖2 東方田鼠、BALB/c鼠感染日本血吸蟲后血清生化指標(biāo)變化趨勢Fig.2 The dynamic changes of serum biochemical indexes from S. japonicum-infected Microtus fortis and BALB/c mouse

總蛋白和白蛋白含量及變化是機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的敏感標(biāo)識(shí)[14]，也可反映機(jī)體的免疫功能狀況。血清白蛋白與球蛋白的比值可以反映機(jī)體免疫系統(tǒng)狀態(tài)，如果在適當(dāng)范圍內(nèi)球蛋白合成提高或白蛋白合成下降，機(jī)體免疫功能就會(huì)有增強(qiáng)趨勢。有研究表明，血吸蟲可以利用宿主的白蛋白作為抗氧化劑，是蟲體在宿主體內(nèi)生存必需的物質(zhì)[15-16]，Holtfreter等[17]研究表明，宿主的白蛋白是血吸蟲童蟲在早期發(fā)育過程中的主要能量來源，也是成蟲的輔助能量來源。邵偉娟等[18]研究發(fā)現(xiàn)東方田鼠正常生理狀態(tài)下血清白蛋白與球蛋白比例倒置。Li等[19]研究表明東方田鼠血清ALB與日本血吸蟲童蟲孵育可以誘導(dǎo)46.2%的童蟲死亡率，顯著高于陰性對照；與對照組動(dòng)物相比，注射Mf-白蛋白的小鼠可誘導(dǎo)43.5%的減蟲率和48.1%的減卵率。本研究結(jié)果顯示東方田鼠感染日本血吸蟲尾蚴后血清ALB含量顯著增加。要進(jìn)一步明確白蛋白在東方田鼠抗日本血吸蟲特性中的作用還需要更深入的研究。血清高密度脂蛋白質(zhì)（high density lipoprotein，HDL）是肝病預(yù)后判斷的重要指標(biāo)，與肝病病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，HDL降低是病情惡化的表現(xiàn)，當(dāng)患肝硬化或重型肝炎時(shí)，其含量會(huì)下降[20]。但是，HDL 可隨著病情的好轉(zhuǎn)而逐漸升高。HDL-C是臨床檢驗(yàn)的指標(biāo)，它代表了血液中HDL的水平。東方田鼠感染日本血吸蟲后HDL-C不降反而逐漸升高，說明其逐漸自愈血吸蟲帶來的組織損傷。