山楂葉總黃酮對非酒精性脂肪性肝病肝細(xì)胞抗氧化作用的研究*

黎運(yùn)呈 王 艷 鄭 迪 盛國光 高 莉 徐建良△

1.浙江省舟山醫(yī)院感染科 (浙江 舟山， 316004) 2.湖北省中醫(yī)院肝病科

肝臟是機(jī)體脂肪代謝的重要器官，肝細(xì)胞在脂肪的氧化、代謝、轉(zhuǎn)化、儲存中均起關(guān)鍵作用，也是內(nèi)源性和外源性脂肪代謝的交匯點(diǎn)和調(diào)節(jié)中樞，脂肪酸的氧化代謝障礙促成了非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的形成及進(jìn)展。因此，保護(hù)肝細(xì)胞功能，增強(qiáng)肝細(xì)胞的抗氧化能力，促進(jìn)肝臟的脂代謝可以延緩NAFLD的進(jìn)展。

山楂葉總黃酮(HLF)為薔薇科植物山楂中提取的黃酮類化合物，藥理研究表明，山楂葉總黃酮具有降血脂、抗氧化、抗血小板聚集等作用[1]。我們通過本實(shí)驗(yàn)觀察山楂葉總黃酮對NAFLD肝細(xì)胞氧化及抗氧化等因子的影響，揭示NAFLD發(fā)病的機(jī)理，同時(shí)為臨床治療NAFLD提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與細(xì)胞 山楂葉總黃酮(HLF)(長春三九生物制藥，批號:20140823)；水飛薊素膠囊(商品名:利加隆，德國馬博士大藥廠生產(chǎn))。人正常肝細(xì)胞L-02株，購自中科院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫。

1.1.2 化學(xué)藥品與試劑 胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司；達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)基(DMEM)和小牛血清(FCS)購于Gibco公司；軟脂酸(PA)、油紅O、二甲基亞砜(DMSO)、SDS-PAGE試劑、RNA酶購自美國Sigma公司；油酸(OA)購自天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GSH-ST)測試盒、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT) 試劑盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒購自南京建成生物工程公司。

1.1.3 儀器 全自動酶標(biāo)儀(Powerwave X340，美國Bio-Tek公司)；超低溫冰箱(MDF-382ECM)；CO2恒溫培養(yǎng)箱，(美國Thermo)；倒置顯微鏡(Olympus,日本)；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人正常肝L-02細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，細(xì)胞70%～80% 融合時(shí)，以0.25%胰酶/0.02% EDTA消化傳代，更換培養(yǎng)液。

1.2.2 NAFLD細(xì)胞模型 上述培養(yǎng)細(xì)胞換液時(shí)，換成含有1mmol/L 游離脂肪酸(FFA)混合物(OA∶PA= 2∶1)的10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，誘導(dǎo)24h、48h、72h，收集細(xì)胞，分別進(jìn)行油紅O染色、顯微鏡觀察、計(jì)算細(xì)胞活力和甘油三酯測定等，確定細(xì)胞模型。細(xì)胞活性測定采用MTT比色法。

1.2.3 NAFLD細(xì)胞分組 實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、水飛薊素組和山楂葉總黃酮組(簡稱HLF組)。水飛薊素組和HLF組細(xì)胞分別用含藥培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，水飛薊素藥物添加劑量為150ug/ml，HLF的添加劑量為400μg/ml。正常組用MEM培養(yǎng)液換液，而模型組、水飛薊素(150ug/ml)組和HLF(400μg/ml)組，換液時(shí)換成含有1mmol/L，F(xiàn)FA混合物(OA∶PA= 2∶1)的10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，每組分4個(gè)培養(yǎng)瓶。

1.2.4 待測細(xì)胞樣本的提取 模型成功后，藥物組細(xì)胞加入含藥培養(yǎng)液作用6h、12h、24h、48h，在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取傳代培養(yǎng)的細(xì)胞(1×107個(gè)/ml)，1000轉(zhuǎn)/分，離心10min，棄上清液，留細(xì)胞沉淀，PBS洗3次，離心1000轉(zhuǎn)/min，離心10min，棄上清液，留細(xì)胞沉淀，加入0.1mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，進(jìn)行勻漿，冰水浴條件下超聲破碎細(xì)胞，離心取上清進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.2.5 MDA、SOD、CAT和GSH-ST指標(biāo)檢測 按試劑盒說明書進(jìn)行操作檢測。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞MDA含量檢測結(jié)果 見表1。

表1 各組細(xì)胞MDA含量檢測結(jié)果比較

與HLF組比較,*P<0.01；與水飛薊素組比較,△P<0.01

2.2 各組細(xì)胞SOD、CAT、GSH-ST活力檢測結(jié)果 見表2、3、4。

表2 各組細(xì)胞SOD活力檢測結(jié)果比較

與HLF組比較,*P<0.01；與水飛薊素組比較,△P<0.01

表3 各組細(xì)胞CAT活力檢測結(jié)果比較

與HLF組比較,*P<0.01；與水飛薊素組比較,△P<0.01

表4 各組細(xì)胞GSH-ST活力檢測結(jié)果比較

與HLF組比較,*P<0.01；與水飛薊素組比較,△P<0.01

3 討論

NAFLD發(fā)病廣泛，在我國所有慢性肝病中僅次于病毒性肝炎。NAFLD的發(fā)病機(jī)制目前以“二次打擊”學(xué)說為主，前期主要表現(xiàn)為以肝內(nèi)脂質(zhì)沉積為主要特征，如果病情持續(xù)進(jìn)展，后期可演變?yōu)橹拘愿窝住⒏斡不?，甚至有罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)。在導(dǎo)致NAFLD的各種因素中，肥胖、2型糖尿病、高脂血癥為NAFLD的易感因素，肝細(xì)胞線粒體β氧化障礙、氧自由基的增多，過氧化反應(yīng)形成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物堆積，進(jìn)一步加速了NAFLD的發(fā)展[2]。肝臟內(nèi)不飽和脂肪酸在自由基和部分酶類的參與下發(fā)生過氧化反應(yīng)，在肝臟功能正常的條件下，因肝臟本身富含超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GSH-ST)、過氧化氫酶(CAT)、維生素E等抗氧化物質(zhì)，可以極大地限制脂肪酸的過氧化反應(yīng)，只有少量的脂質(zhì)過氧化物生成。NAFLD的第二次打擊正是由肝細(xì)胞對脂肪酸的氧化與抗氧化障礙所引發(fā)而導(dǎo)致了疾病進(jìn)展，因而可以通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的抗氧化及過氧化反應(yīng)來干預(yù)NAFLD，延緩或阻止NAFLD的進(jìn)展。

中醫(yī)認(rèn)為各種病因引起肝失疏泄、脾失健運(yùn)、腎精虧損，導(dǎo)致氣滯、痰濁、濕邪、血瘀等相互搏結(jié)于肝，導(dǎo)致了脂肪肝的發(fā)生。在防治NAFLD方面，多采用復(fù)方中藥，以化痰、祛濕、活血為基本治法進(jìn)行干預(yù)[3,4]。山楂葉為薔薇科植物山楂的干燥葉，具有降脂化濁、活血化瘀等功能，山楂葉總黃酮為山楂葉的提取物，藥理學(xué)研究表明其具有抗動脈粥樣硬化、降血脂、抗氧化應(yīng)激、抗血小板凝聚、抗細(xì)胞凋亡等多種作用[5～7]。

丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的主要終產(chǎn)物，它具有極大的生物毒性，可破壞蛋白質(zhì)氨基結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，改變細(xì)胞骨架蛋白結(jié)構(gòu)和功能。MDA指標(biāo)的高低可間接反映細(xì)胞受氧自由基損傷的程度。SOD可抑制由氧自由基所啟動的脂質(zhì)過氧化，是高效的清道夫，它可對抗與阻斷因氧自由基對細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞，復(fù)原氧自由基對細(xì)胞造成的傷害，對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著極其重要的作用。SOD活力的高低可間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。CAT 的主要作用是催化H2O2分解為H2O 和O2，使得H2O2不至于與O2在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成非常有害的羥自由基，從而對機(jī)體起重要的保護(hù)作用。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸組成的三肽，與肝臟的抗氧化功能密切相關(guān)，可通過自身提供H+來拮抗氧自由基毒性，清除體內(nèi)的超氧離子及其它自由基，尤其是線粒體內(nèi)的GSH，還控制著細(xì)胞壽命及調(diào)控基因的表達(dá)，當(dāng)GSH完全被耗竭時(shí)，肝細(xì)胞迅速發(fā)生死亡[8～11]。SOD、CAT和GSH共同作用，通過清除機(jī)體內(nèi)過氧化產(chǎn)物及多余的氧自由基，來保護(hù)機(jī)體免受脂質(zhì)過氧化物的傷害。

本實(shí)驗(yàn)中，MDA在模型組細(xì)胞中含量隨著時(shí)間的變化而有升高，在48h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到最高，通過藥物進(jìn)行干預(yù)治療后，MDA值明顯下降，模型組與藥物組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，模型組中SOD、CAT、GSH-ST活力測定值在6h、12h、24h、48h各時(shí)間點(diǎn)較正常組均明顯降低，隨著時(shí)間推移，測定值明顯下降，表明NAFLD發(fā)病過程中，肝細(xì)胞的抗氧化及抑制脂質(zhì)過氧化能力受損，在病程后期尤為明顯。通過藥物進(jìn)行干預(yù)后，SOD、CAT、GSH-ST活力指標(biāo)均有不同程度升高，在病程后期24h,48h時(shí)間點(diǎn)指標(biāo)升高尤為明顯，藥物組與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，我們可通過提高肝細(xì)胞的抗氧化及過氧化反應(yīng)的能力，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物這一途徑，來防治NAFLD的進(jìn)一步進(jìn)展并延緩其病程。在病程中后期，山楂葉總黃酮的干預(yù)效果明顯，可能與其具有降脂化濁、活血化瘀的功能密切相關(guān)，這也是中藥針對基本病機(jī)采用祛濕化濁，活血治法防治脂肪肝的體現(xiàn)[3]。中藥干預(yù)NAFLD的機(jī)制還需要進(jìn)一步的深入研究，結(jié)合中醫(yī)的辨證治療可能是今后防治NAFLD的一個(gè)重要方向。