清肝化痰活血方對大鼠非酒精性脂肪性肝炎的防治作用*

侯藝鑫 李玉鑫 楊 雪 楊志云 江宇泳 王憲波

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合二科 (北京， 100015)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指酒精性因素以外多病因引起的以肝細胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積為主要特征的臨床病理綜合征。其包括了單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及相關(guān)的肝硬化、肝癌等[1]。目前NAFLD的發(fā)病機制尚不清楚，但脂質(zhì)代謝異常是NAFLD發(fā)病機制中最基礎(chǔ)、最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一[2，3]。肝X受體(LXR) /脂肪酸合成酶(FAS) 通路是調(diào)控肝細胞脂肪代謝平衡的重要通路之一，通過對肝細胞的脂肪代謝平衡的影響，導(dǎo)致肝細胞脂質(zhì)沉積[4]。因此，調(diào)控LXRa、FASmRNA基因表達，可能是有效防治NAFLD 的途徑之一。本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)清肝化痰活血方能夠有效降低NASH患者的甘油三酯及膽固醇水平，改善肝臟脂肪沉積。本實驗通過觀察清肝化痰活血方對NASH大鼠肝細胞LXRa、FAS基因表達的影響，探討該方防治大鼠NASH的分子機制，為臨床防治該病提供理論及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF 級雄性SD 大鼠70只，體量140～160g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號:SCXK(京)2007-0001] 。飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學(xué)SPF 級動物房。

1.2 藥物 清肝化痰活血方(茵陳蒿18g,茯苓、決明子、丹參各15g,梔子、陳皮、半夏、郁金各10g,大黃6g)。

1.3 造模與分組 70只大鼠正常喂養(yǎng)1周后隨機分組，正常組(20只)大鼠以普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水；模型組(30只)和預(yù)防組(20只)大鼠予高脂飼料(即基礎(chǔ)飼料+100g·L-1豬油+20g·L-1膽固醇)喂養(yǎng)；自由飲水。造模8周，模型制備成功后，隨機取預(yù)防組、模型組及正常組大鼠各10只，獲取血清及肝組織標(biāo)本。再將模型組剩余的20只大鼠隨機分為2組，即模型組(10只)與治療組(10只)。至此實驗大鼠共分為4組，即正常組(10只)、模型組(10只)、治療組(10只)、預(yù)防組(10只)。

1.4 給藥方法 預(yù)防組大鼠自造模之日起開始灌胃清肝化痰活血方湯劑1次/d，共12周；治療組大鼠在造模結(jié)束時開始灌胃該中藥，1次/d，共4周，用量均為0.19 g/kg體質(zhì)量，用藥量相當(dāng)于60kg成人劑量的10倍。模型組和正常組大鼠以等容積生理鹽水灌胃4周。

1.5 觀察指標(biāo)與檢測方法

1.5.1 檢測大鼠肝濕重、體重、肝指數(shù) 觀察大鼠肝臟形態(tài)包括重量、外形、色澤、質(zhì)地，計算肝重指數(shù)( 肝重指數(shù)= 肝臟濕重/體重×100%) 。

1.5.2 檢測血清生化指標(biāo) 大鼠經(jīng)腹腔麻醉后，立刻從腹主動脈取血，靜置30min，3000r/min離心3min，保留血清，采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清ALT、AST、TC、TG含量。

1.5.3 肝組織病理檢測 8 周造模結(jié)束、4周治療結(jié)束時，每組取10只大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，采集右葉1.5cm×1cm×0.5cm肝組織，經(jīng)磷酸緩沖福爾馬林溶液固定,石蠟切片,進行蘇木精-伊紅染色，觀察大鼠肝組織病理情況。

1.5.4 大鼠肝細胞LXRa和FASmRNA測定 肝細胞RNA 的提取和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):TRIzol 提取肝細胞RNA，測定含量并計算濃度，采用Oligo(dT) 逆轉(zhuǎn)錄法，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物設(shè)計與合成:據(jù)Genebank提供LXRa( NM-031627.2)、FAS (NM-1 39194.2)、ACTIN (NM-031144) 基因序列，以大鼠ACTIN作為內(nèi)參基因，引物由武漢塞維爾生物科技有限公司設(shè)計并合成(見表1)。反應(yīng)體系:2.5×Real Master Mix/20×SYBRsolution 9ul，上、下游引物各2ul，DNA 模板1ul，加滅菌雙蒸水補至總體積20μL。反應(yīng)條件:①95℃持續(xù)1 min預(yù)變性；② 95 ℃持續(xù)10s變性； ③GAPDH 60℃，LXRa60℃，F(xiàn)AS60℃，退火20 s；④ 68 ℃持續(xù)30 s 延伸，②～④ 39個循環(huán)；⑤溶解曲線分析， 72～95 ℃，持續(xù)5～10 s。反應(yīng)完畢，采用Opticon Monitor3.1 軟件分析，用公式2-△△Ct方法進行相對定量。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況 70只大鼠均無死亡，其中正常組大鼠飲食正常，毛發(fā)有光澤，活潑愛動；模型組大鼠體型肥胖，嗜睡懶動，毛發(fā)油膩欠光澤；預(yù)防組和治療組大鼠飲食減少，活動量均有不同程度下降，毛發(fā)欠光澤。

2．2 各組大鼠兩時段肝濕重、體重、肝指數(shù)情況 見表2

表2 各組大鼠兩時段肝濕重、體重、肝指數(shù)比較

與正常組同時段比較，*P<0.05,**P<0.01；與模型組同時段比較,△P<0.05，△△P<0.01

2.3 各組大鼠肝臟病理變化

2.3.1 肉眼觀察肝組織 正常組大鼠肝臟形態(tài)正常,肝臟為紅褐色,表面光滑有光澤,實驗結(jié)束時無1例出現(xiàn)異常；模型組大鼠肝臟體積明顯增大,重量明顯增加,切面油膩,邊緣鈍,表面粗糙呈現(xiàn)黃褐色；預(yù)防組大鼠肝臟比正常組的增大,肝臟重量增加,但比模型組的體積小，肝臟呈較淡黃褐色,但表面光滑；治療組大鼠肝臟體積比正常組的增大,呈現(xiàn)磚紅色,

表面光滑,但比模型組大鼠肝臟體積偏小。

2.3.2 肝臟HE染色結(jié)果 4周治療結(jié)束時，正常組大鼠肝小葉輪廓清晰、完整，肝索排列有序，肝細胞呈放射狀圍繞在中央靜脈周圍，肝細胞無脂肪變性，細胞核位于肝細胞中央，核大而圓(見插頁圖1A),模型組大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝竇結(jié)構(gòu)難以辨認(rèn)，肝索排列不整齊，肝細胞呈彌漫性脂肪變性，胞漿內(nèi)可見大小不等的大泡樣脂滴，部分融合為大脂滴，與周圍邊界不清晰，還可見到肝細胞有點狀壞死，碎霄樣壞死和炎性細胞(見插頁圖1B)；預(yù)防組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，脂肪變性細胞數(shù)目較模型組明顯減少，僅見少數(shù)細小脂滴散布于肝細胞內(nèi)，肝索結(jié)構(gòu)排列整齊(見插頁圖1C)；治療組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)尚清晰，肝細胞的脂肪變性數(shù)目亦明顯減少，胞漿內(nèi)脂滴數(shù)目減少，偶見個別大脂滴存在(見插頁圖1D)。

圖1 各組大鼠肝組織病理圖（HE，×200）

2.4 各組大鼠兩時段肝細胞LXRa、FASmRNA表達情況 見表3。

表3 各組大鼠兩時段肝細胞LXRa、FASmRNA表達比較

與正常組同時段比較，*P<0.05,**P<0.01；與模型組同時段比較,△P<0.05，△△P<0.01

2.5 各組大鼠血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果 見表4。

表4 各組大鼠兩時段血清各生化指標(biāo)比較

與正常組同時段比較，*P<0.05,**P<0.01；與模型組同時段比較,△P<0.05，△△P<0.01

3 討論

肝臟脂肪沉積是NASH的最典型的病理特征。各種原因?qū)е碌母闻K脂質(zhì)代謝紊亂和肝細胞內(nèi)異常脂肪沉積；而異常的脂肪沉積又會是代謝紊亂的啟動因素，從而加重肝細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂和肝細胞內(nèi)脂肪沉積[5]。

肝細胞脂質(zhì)代謝的平衡受到多條信號通路的共同調(diào)控和影響，目前針對核受體對肝細胞內(nèi)脂質(zhì)平衡機制的研究越來越多[6]。本實驗研究了核受體LXRa與靶基因FAS結(jié)合通過調(diào)節(jié)肝細胞脂肪酸的生成，從而影響脂肪的合成，進而導(dǎo)致脂肪肝的形成。LXRa是脂肪酸生成的關(guān)建基因，F(xiàn)AS是LXRa的下游基因，是脂肪合成的關(guān)鍵酶，其中LXRa對于FAS的調(diào)節(jié)，一方面是直接與FAS啟動子結(jié)合，另一方面是間接通過SREBP-1C途徑從而上調(diào)FAS基因表達來實現(xiàn)的[7]。SREBP-1C的過度表達增加FAS基因轉(zhuǎn)錄，從而增強FAS基因活性，引起脂肪酸合成增多，進而導(dǎo)致肝細胞內(nèi)異常脂肪沉積形成脂肪肝[8]。在缺失LXR基因的小鼠體內(nèi)，肝細胞內(nèi)SREBP-1C的mRNA基因表達水平顯著下降，而FASmRNA水平顯著下降[5]。本研究結(jié)果表明，模型組較正常組大鼠肝細胞LXRa、FAS基因表達水平均明顯升高(P<0.01),本結(jié)果與既往研究結(jié)果一致，表明LXRa、FAS基因調(diào)控了肝細胞內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂。

從中醫(yī)角度來看，NASH屬于“積聚、脅痛、痰濕”等范疇,病位在肝,涉及脾胃。病因或過度肥胖,或感受濕熱疫毒,或過食肥甘厚味，或情致失調(diào)等。肝失疏泄,濕熱內(nèi)蘊，脾失健運,瘀血阻滯,痰濁內(nèi)結(jié),最終形成濕熱痰瘀相互膠結(jié),痹阻于肝臟脈絡(luò)是NHSH病機演變的基本規(guī)律[9]。文獻報告表明針對單純性脂肪肝的患者，只要注意控制飲食，加強鍛煉，就能收到很好的臨床效果,而對于NASH的患者(如血清轉(zhuǎn)氨酶升高以及肝活檢有炎癥改變)則需要采用藥物，如用清熱利濕，化痰活血的藥物。清肝化痰活血方是地壇醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合中心臨床用于治療NASH的基本方劑,由茵陳蒿湯合二陳湯加減化載組成，具有清熱利濕活血化瘀功效。本次實驗結(jié)果提示該方可有效地防止肥胖、防止肝內(nèi)脂肪大量沉積，而且具有逆轉(zhuǎn)脂肪沉積的作用，對已經(jīng)發(fā)生脂肪變的肝臟有緩解作用。ALT和AST,是非特異性細胞內(nèi)功能酶,正常時血清內(nèi)含量很低，只有當(dāng)肝細胞受損時,肝細胞膜通透性增加,導(dǎo)致其活性迅速增加，是迄今為止被認(rèn)為反映肝細胞損害的重要指標(biāo)。NASH患者轉(zhuǎn)氨酶升高常以AST升高為主，且升高幅度不太顯著[10]。本實驗結(jié)果說明清肝化痰活血方對NASH有很好地保肝抗炎降酶作用，同時該方能夠調(diào)節(jié)LXRa/FAS信號通路，減少脂肪合成與沉積，達到改善NASH大鼠肝臟病理情況，使肝細胞脂質(zhì)代謝紊亂趨于正常。

清肝化痰活血方對NASH有較好的臨床治療作用，可在一定程度上防止肥胖、防止肝臟脂肪過度沉積、改善肝功能、改善肝細胞脂肪變性、減輕肝組織炎癥、調(diào)節(jié)LXRa/FAS 信號通路，減少肝臟脂肪沉積，此方可在臨床推廣運用。