天然產(chǎn)物Salvianolic Acid A與黃嘌呤氧化酶相互作用的酶動(dòng)力學(xué)和分子對(duì)接研究

張婧妍，劉亞婷，唐紅進(jìn)

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

痛風(fēng)，作為一種嚴(yán)重影響公共健康的代謝性疾病，是由機(jī)體內(nèi)嘌呤代謝紊亂和/或尿酸排泄減少引起的一種晶體性關(guān)節(jié)炎，臨床主要表現(xiàn)為高尿酸血癥和尿酸鹽結(jié)晶沉積所致的炎癥性反應(yīng)[1]。持續(xù)性的高尿酸血癥是痛風(fēng)發(fā)生的前兆和潛在誘因，更是其他一些慢性疾病如高血壓、冠心病、代謝綜合癥以及肥胖癥等發(fā)生與發(fā)展的危險(xiǎn)因素[2-3]。黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XO)，廣泛分布于人體肝、腸、心、肺等組織細(xì)胞中，是參與機(jī)體內(nèi)嘌呤代謝通路中一種重要的氧化還原酶類[4-5]。XO可催化次黃嘌呤氧化生成黃嘌呤，并進(jìn)一步催化黃嘌呤生成尿酸；同時(shí)還伴隨著大量超氧陰離子、過氧化氫等活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的產(chǎn)生[6]。XO是機(jī)體內(nèi)調(diào)控尿酸合成的關(guān)鍵酶，是痛風(fēng)及高尿酸血癥治療的直接藥物靶點(diǎn)之一[7]。XO抑制劑可通過抑制XO活性而阻斷尿酸生成，進(jìn)而降低血尿酸水平。目前，治療高尿酸血癥和痛風(fēng)并沒有特效藥，臨床使用的代表性藥物分別為別嘌呤醇(Allopurinol)、非布索坦(Febuxostat)、托匹司他(Topiroxostat)(結(jié)構(gòu)見圖1a～圖1c)。這些藥物在使用過程中伴有明顯的毒副作用[8-11]，如肝損傷、漸進(jìn)性腎衰竭、抑制骨髓造血功能、高血壓等心血管問題、胃腸不適以及過敏反應(yīng)等，這些不良反應(yīng)極大地限制了該類藥物在臨床的長期應(yīng)用[12]。因此，亟需尋找高效低毒的新型XO抑制劑，為痛風(fēng)及高尿酸血癥等相關(guān)疾病的治療提供更有效途徑。

天然產(chǎn)物一直都是治療各類疾病藥物的重要源泉，如川芎嗪、紫杉醇等藥物。研究表明，丹酚酸類成分通過多種作用機(jī)制而發(fā)揮藥理作用，如抑制血小板聚集、抗血栓形成、防止動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成、抑制細(xì)胞內(nèi)源性膽固醇合成、清除自由基、減少自由基對(duì)機(jī)體的損傷而產(chǎn)生保護(hù)作用等[13]。研究基于前期藥物篩選的基礎(chǔ)[14]，通過酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)探討了活性天然產(chǎn)物丹酚酸A(Salvianolic Acid A，SAA)(結(jié)構(gòu)見圖1d)對(duì)XO的體外抑制效應(yīng)，并運(yùn)用分子對(duì)接方法闡明了SAA與XO之間的結(jié)合特性。

圖1 部分已報(bào)道XO抑制劑化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

化合物SAA購買于國家藥品和生物制品檢定所(純度>99%);XO(來源于牛奶，E.C.1.1.3.22)、黃嘌呤、別嘌呤醇和DMSO購買于Sigma-Aldrich公司(USA)。其他所有化學(xué)試劑和溶劑均為分析純，且實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1)XO抑制活性實(shí)驗(yàn)。用75 mM的磷酸緩沖液(PB，pH 7.4)配制濃度分別為0.08 U/mL和0.48 mM的XO和黃嘌呤工作液，置于冰上保存，待用。用DMSO溶解供試藥物配制為10 mM的儲(chǔ)備液，實(shí)驗(yàn)前用PB稀釋至不同濃度(0～500 μM)，樣品溶液中DMSO含量小于0.1%。在96孔板上加入不同濃度的待測(cè)樣品溶液100 μL，再加入0.08 U/mL的XO溶液50 μL，并以相同體積的PB作為空白對(duì)照，以別嘌呤醇(由10 mM的儲(chǔ)備液經(jīng)PB稀釋至所需濃度)作為陽性對(duì)照，在酶標(biāo)儀上37 ℃孵育3 min，每組平行設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。隨后，向各孔中加入0.48 mM的底物黃嘌呤50 μL以啟動(dòng)反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀(Thermo Multiskan Go v1.01.10，Thermo Fisher Scientific，USA)記錄吸光度值，在波長295 nm處每隔15 s讀數(shù)一次，共計(jì)7 min。抑制率通過如下公式進(jìn)行計(jì)算：

(2)XO抑制可逆性分析。在96孔板上加入100 μL不同濃度的待測(cè)樣品溶液(0、50 μM、100 μM)，再加入50 μL不同濃度的XO溶液(0.01 U/mL、0.025 U/mL、0.05 U/mL、0.10 U/mL)，并以相同體積的PB作為空白對(duì)照，在酶標(biāo)儀上37 ℃孵育3 min，每組平行設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。隨后，加入0.48 mM的底物黃嘌呤50 μL以啟動(dòng)酶反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在波長295 nm處記錄吸光度值，每隔15 s讀數(shù)一次，共計(jì)5 min。以酶反應(yīng)速率(v，ΔA/min)對(duì)不同濃度的XO溶液作圖，用于判斷化合物SAA對(duì)XO的抑制可逆性。

(3)XO抑制類型分析。在96孔板上加入100 μL不同濃度的待測(cè)樣品溶液(0、50 μM、75 μM、100 μM)，再加入50 μL一定濃度的XO溶液(0.08 U/mL)，并以相同體積的PB作為空白對(duì)照，在酶標(biāo)儀上37 ℃孵育3 min，每組平行設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。隨后，加入50 μL不同濃度的底物黃嘌呤(0.08 mM、0.12 mM、0.16 mM、0.20 mM)以啟動(dòng)酶反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在波長295 nm處記錄吸光度值，每隔15 s讀數(shù)一次，共計(jì)5 min。通過酶反應(yīng)速率的倒數(shù)(1/v(ΔA/min))對(duì)不同濃度的底物黃嘌呤的倒數(shù)作圖，獲得Lineweaver-Burk Plots方程。酶抑制類型通過雙倒數(shù)方程進(jìn)行計(jì)算，Ki值代表化合物與游離酶結(jié)合時(shí)的抑制速率常數(shù)，可通過雙倒數(shù)方程二次計(jì)算獲得。

(4)XO失活動(dòng)力學(xué)分析。在體系中先加入不同濃度的待測(cè)樣品溶液(100 μL，5 μM、25 μM、40 μM、80 μM)和底物黃嘌呤(50 μL，0.48 mM)，隨后再加入一定濃度的酶溶液(50 μL，0.08 U/mL)。立即混合均勻后置于酶標(biāo)儀上37 ℃孵育，在波長295 nm處記錄吸光度值，每隔3 min讀數(shù)一次，計(jì)30 min，隨后每隔10 min讀數(shù)一次，共計(jì)180 min。每組實(shí)驗(yàn)平行設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。通過XO相對(duì)活性對(duì)混合體系反應(yīng)時(shí)間作圖，用于評(píng)價(jià)化合物SAA介導(dǎo)下的酶失活動(dòng)力學(xué)進(jìn)程。

(5)分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)。分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)通過分子計(jì)算模擬軟件AutoDock v4.2完成。XO/水楊酸的晶體復(fù)合物結(jié)構(gòu)從RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫下載獲得，其PDB編號(hào)為1FIQ。小分子化合物的3D化學(xué)結(jié)構(gòu)通過Chem3D Pro 14.0繪制，對(duì)運(yùn)用分子計(jì)算軟件SYBYL X-2.0的標(biāo)準(zhǔn)Tripos力場(chǎng)對(duì)小分子化合物進(jìn)行能量最優(yōu)化處理(能量梯度收斂標(biāo)準(zhǔn)0.005 kcal·mol-1、最大迭代次數(shù)為10 000，并為小分子添加Gasteiger-Hückel電荷)，并使用AutoDock工具進(jìn)行小分子配體可旋轉(zhuǎn)鍵的搜尋與定義。大分子蛋白結(jié)構(gòu)通過多肽鏈缺失殘基和末端殘基修補(bǔ)、除去水分子、添加氫原子、添加Gasteiger電荷以完成大分子的準(zhǔn)備過程。Grid盒子大小被定義為60 ?×60 ?×60 ?，且中心為0.375 ?，以覆蓋整個(gè)蛋白分子的催化活性中心位點(diǎn)。拉馬克遺傳算法(Lamarckian Genetic Algorithm，LGA)用于對(duì)接過程運(yùn)算，且運(yùn)行100次，其他參數(shù)設(shè)置取默認(rèn)值。取對(duì)接結(jié)合能量最低且具有最高百分頻率的簇類分析(Cluster Analysis，rsmd 2.0 ?)后的構(gòu)象用于配體-蛋白復(fù)合物結(jié)合模式分析，并使用Pymol對(duì)SAA-XO復(fù)合物構(gòu)象進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果及分析

2.1 SAA對(duì)XO抑制活性評(píng)價(jià)

通過體外酶抑制活性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行化合物SAA對(duì)XO抑制活性評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，與陽性對(duì)照藥Allopurinol(IC50=3.07±0.08 μM)相比，SAA濃度依賴性抑制XO活性，隨著化合物濃度的升高，酶抑制活性也不斷增強(qiáng)，且其IC50值為65.49±0.94 μM。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物SAA是潛在的XO抑制劑，可作為痛風(fēng)及高尿酸血癥治療的藥物先導(dǎo)物，有待于進(jìn)一步研究開發(fā)。

2.2 SAA對(duì)XO抑制可逆性判斷

為了進(jìn)一步探討化合物SAA對(duì)XO的抑制是否為可逆性抑制過程，進(jìn)而繪制了不同待測(cè)物濃度下的酶反應(yīng)體系的反應(yīng)速率動(dòng)力學(xué)方程，如圖3所示。由圖3可以看出，所有直線均通過原點(diǎn)，且隨著抑制劑SAA濃度不斷增加，直線斜率呈現(xiàn)不斷降低的趨勢(shì)；如果為非可逆性抑制，則不同待測(cè)物濃度下的曲線不相交于坐標(biāo)軸原點(diǎn)位置，這與文獻(xiàn)報(bào)道的黃酮類化合物木犀草素(Leteolin)對(duì)XO的抑制表現(xiàn)出相似的性質(zhì)[15]。由此表明，化合物SAA通過可逆性抑制XO來表現(xiàn)出酶的抑制效應(yīng)。

圖2 化合物SAA對(duì)XO抑制活性評(píng)價(jià)圖3 化合物SAA對(duì)XO抑制可逆性分析

2.3 SAA對(duì)XO抑制類型判斷

2.4 SAA對(duì)XO失活動(dòng)力學(xué)分析

通過測(cè)定化合物SAA對(duì)XO抑制作用時(shí)間進(jìn)程來探討酶失活動(dòng)力學(xué)過程，研究結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，在不同濃度SAA(5 μM、25 μM、40 μM、80 μM)存在下，XO相對(duì)活性隨著與SAA孵育時(shí)間的增加(0～180 min)并沒有發(fā)生顯著變化，而是維持在一個(gè)相對(duì)恒定的抑制活性處。當(dāng)化合物SAA濃度為5 μM，與酶初始活性相比，XO的相對(duì)活性約為92%；當(dāng)抑制劑SAA濃度為最大待測(cè)濃度80 μM時(shí)，在測(cè)定時(shí)間180 min內(nèi)，酶的相對(duì)活性約為初始活性的25%。這表明化合物SAA能夠相對(duì)容易地結(jié)合于XO活性位點(diǎn)，與酶發(fā)生相互作用或誘導(dǎo)該酶二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生改變，使酶活性得到快速抑制，并在較短時(shí)間內(nèi)失活，從而介導(dǎo)酶的快速抑制失活動(dòng)力學(xué)過程。

圖4 化合物SAA對(duì)XO抑制類型Lineweaver-Burk Plots分析圖5 化合物SAA對(duì)XO失活動(dòng)力學(xué)分析

2.5 分子對(duì)接模擬

分子對(duì)接被廣泛用于分析小分子配體與蛋白相互作用的結(jié)合機(jī)制。XO(PDB Code:1FIQ)由A、B、C 3條亞基構(gòu)成，其中包含3個(gè)活性結(jié)構(gòu)域，分別為A鏈中的Fe/S中心結(jié)構(gòu)域、B鏈中的FAD結(jié)構(gòu)域和C鏈中的鉬蝶呤結(jié)構(gòu)域[16]?；衔颯AA與XO對(duì)接結(jié)果如圖6所示。首先，蛋白原始配體水楊酸被重新對(duì)接到XO活性中心，并產(chǎn)生0.51 ?的RMSD值，重新對(duì)接的配體構(gòu)象與晶體復(fù)合物原始構(gòu)象保持相對(duì)一致(如圖6b所示)，表明所建立的對(duì)接方法具有可靠性。SAA對(duì)接進(jìn)入XO活性口袋，其口袋由關(guān)鍵氨基酸殘基Leu648、Glu802、Ser876、Glu879、Arg880、Phe914、Phe1009、Thr1010、Val1011、Leu1014、Pro1076等組成。由圖6c可以觀察到，化合物SAA結(jié)構(gòu)中1,2-二芳基乙烯基團(tuán)伸入到活性口袋最里端的疏水性區(qū)域，位于鉬蝶呤(Mo-pt)結(jié)構(gòu)域處，由殘基Leu648、Arg880、Phe914、Phe1009、Val1011、Phe1013和Pro1076等組成，而結(jié)構(gòu)中3,4-二羥基芳基丙酸基團(tuán)則游離于活性口袋袋口處，表明疏水相互作用對(duì)于配體SAA結(jié)合于XO和復(fù)合物構(gòu)象穩(wěn)定性的維系有著非常重要的作用。同時(shí)可以看出，化合物SAA結(jié)構(gòu)中的游離羥基分別與殘基Gln767、Asn768、Arg880、Thr1010生成了4個(gè)氫鍵相互作用，這表明氫鍵相互作用對(duì)于維持SAA-XO復(fù)合物構(gòu)象穩(wěn)定性也有著不可缺少的作用。此外，潛在的芳香π-π堆積作用也可以被觀察到，如化合物SAA結(jié)構(gòu)中的芳香苯環(huán)與殘基Phe914直接形成face-to-face的π-stacking效應(yīng)，與殘基Phe1009之間產(chǎn)生了face-to-edge的π-π相互作用。

由此可見，化合物SAA可結(jié)合于XO活性位點(diǎn)處，二者在結(jié)合過程中所產(chǎn)生的疏水相互作用和氫鍵作用對(duì)于SAA-XO復(fù)合物構(gòu)象發(fā)揮著極為重要的穩(wěn)定性維系作用。

圖6 化合物SAA與XO(PDB Code：1FIQ)分子對(duì)接結(jié)果

3 結(jié)論

綜上所述，天然產(chǎn)物SAA表現(xiàn)出潛在的XO抑制活性，其IC50值為65.49±0.94 μM?；衔颯AA通過競(jìng)爭性且可逆性抑制XO，使其快速失活，并表現(xiàn)出濃度依賴性。同時(shí)，通過分子對(duì)接對(duì)SAA-XO結(jié)合構(gòu)象分析，有理由推斷，化合物SAA可以與底物競(jìng)爭性結(jié)合于XO的活性中心。如果SAA濃度較低，則酶活性被輕度抑制。隨著SAA濃度不斷增加，SAA可能通過誘導(dǎo)酶二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生變化，阻止底物進(jìn)入活性位點(diǎn)，從而表現(xiàn)出較強(qiáng)的酶抑制效應(yīng)。因此，天然產(chǎn)物SAA可作為新型XO抑制劑備選化合物，用于抗痛風(fēng)及高尿酸血癥藥物先導(dǎo)物進(jìn)行后續(xù)研究開發(fā)。