利用IlluminaMiseq測序技術(shù)研究鮑內(nèi)臟多肽對小鼠腸道微生物的影響

張莎莎 吳振聰 楊轉(zhuǎn)

摘要[目的]研究鮑內(nèi)臟活性物質(zhì)對小鼠腸道微生物的影響。[方法]從鮑內(nèi)臟中制備多肽并灌胃小鼠，利用Illumina Miseq測序技術(shù)分析小鼠腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化。[結(jié)果]門水平上，小鼠腸道微生物最優(yōu)勢菌群為擬桿菌門（Bacteroidetes），占總序列的69.10%；其次為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），分別占總序列的23.50%和5.00%，變形菌門又以δ-變形菌綱居多。屬水平上，最優(yōu)勢類群為擬桿菌目（Bacteroidales）的一個未知分類屬，占30.33%；其次為擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）和擬桿菌屬（Bacteroides），分別占12.47%和9.80%。灌胃鮑內(nèi)臟多肽后，小鼠腸道中豐度前30位的菌屬中有4個屬的豐度上調(diào)，其中副擬桿菌屬（Parabacteroides）的豐度顯著上調(diào)。豐度下調(diào)的屬有7個，其中毛螺菌科（Lachnospiraceae）一個未分類屬和厭氧支原體屬（Anaeroplasma）豐度顯著下調(diào)。[結(jié)論]灌胃鮑內(nèi)臟多肽后小鼠腸道微生物多樣性呈增加的趨勢，且在小鼠腸道中檢測到一些與宿主健康相關(guān)的差異細菌類群。

關(guān)鍵詞鮑內(nèi)臟多肽；腸道微生物；Illumina Miseq測序

中圖分類號S852.6文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）08-0093-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.024

Abstract[Objective] To study the effects of visceral active substance of abalone on intestinal microbe of mice by Illumina Miseq sequencing. [Method] Polypeptide extracted from abalone viscera and mice was fed with it by intragastric administration. The community structure and dynamic changes of intestinal microbe of mice were analyzed by using Illumina Miseq sequencing. [Result] The most dominant phyla of bacteria in the intestine of mice were Bacteroides， accounting for 69.10% of the total sequence， followed by Firmicutes and Proteobacteria（ accounting for 23.50% and 5.00% of the total sequences， respectively）. Proteobacteria was dominated by δProteobacteria.At the genus level， the most dominant group was norank_f_Bacteroidales_S247_group， accounting for 30.33%， followed by Alloprevotella and Bacteroides（accounting for 12.47% and 9.80%， respectively）. After the intragastric administration of abalone polypeptide， the abundance of 4 bacterial genera in the intestine of mice increased， among which the genus Parabcteroides significantly increased （P<0.05）. The abundance of 7 genera decreased， amongwhich the genus norank_f_Lachnospiraceae and Anaeroplasma significantly decreased （P<0.05）. [Conclusion] The intestinal microbial diversity of mice after intragastric administration of abalone viscera polypeptide， and some differentiated bacterial groups related to host health were detected in the intestinal tract of mice.

Key wordsAbalone viscera polypeptide；Intestinal microbiota；Illumina Miseq sequencing

鮑是具有較高經(jīng)濟價值的海洋貝類，但居我國傳統(tǒng)四大海味之首，其營養(yǎng)豐富，味濃鮮美，深受大眾喜愛。鮑具有滋陰補虛、養(yǎng)肝明目等功效[1]。鮑內(nèi)臟是指除去鮑外殼和肉質(zhì)后剩余的肝臟、消化系統(tǒng)等部分，約占整個鮑重量的25.0%，其營養(yǎng)成分及組成與鮑肌肉中的類似，都含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪以及多種生物活性物質(zhì)，比如盤鮑內(nèi)臟中含有包括人體必需的7種氨基酸在內(nèi)的16種氨基酸[2]。鮑內(nèi)臟中含有3.72%的粗脂肪，要比肌肉中的含量多3倍，而鮑脂肪中有含量較高的二十碳五烯酸，具有改善心血管循環(huán)的作用。鮑內(nèi)臟中還含有豐富的酶類、DHA、EPA、?；撬岬壬砘钚晕镔|(zhì)以及一些維持神經(jīng)肌肉興奮的微量元素。在鮑的食用和加工過程中，鮑內(nèi)臟往往被直接遺棄，不僅浪費資源，而且會造成環(huán)境污染[3-4]。

隨著人們對海洋生物活性物質(zhì)的逐步認識以及人們對環(huán)境污染的關(guān)注，海產(chǎn)品加工中的廢棄物逐漸得到利用和開發(fā)。比如，魚內(nèi)臟蛋白水解物對人體健康的生物作用[5]；從文蛤中分離到的多肽對人肺癌細胞具有抑制作用[6]；從草魚蛋白中分離到的新型多肽具有較強的抗氧化活性[7]。對鮑內(nèi)臟活性物質(zhì)的研究也有一些報道，如酶解鮑內(nèi)臟所得產(chǎn)物具有體外抗氧化活性[8-9]；鮑內(nèi)臟蛋白肽具有一定的體外自由基清除能力和較強的體內(nèi)抗氧化活性，并能增強小鼠的免疫功能[10]；鮑內(nèi)臟水解液能降低肝素輔因子HCⅡ介導(dǎo)的凝血酶抑制率，改善血液的抗凝作用，大大延緩了凝血時間[11]。

腸道微生物是生物體的重要組成部分，是宿主“被遺忘的器官”[12]，影響著宿主的生長、發(fā)育、生理和病理[13-14]。目前對海洋生物多肽生物活性的評估大多集中在體內(nèi)外抗氧化、抗腫瘤活性和免疫指標測定等方面[4，15]，對宿主腸道微生物影響方面的研究尚未見報道。筆者以模式動物小鼠為研究對象，利用Illumina Miseq測序技術(shù)研究灌胃鮑內(nèi)臟多肽后小鼠腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化，從腸道微生物的角度研究鮑魚內(nèi)臟活性物質(zhì)對宿主的影響，進一步完善海洋多肽的生物活性評估，并為研制改善腸道微生物的益生元奠定基礎(chǔ)。此外，該研究在提升鮑內(nèi)臟的附加值，促進廢物利用，減少環(huán)境污染等方面也具有重要意義。

1材料與方法

1.1實驗動物

SPF級雄性昆明小鼠，體重190～230 g。

1.2試材與試劑

堿性蛋白酶（諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司）；糞便基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；GoodView熒光染料（北京賽百盛基因技術(shù)有限公司）；酶、生化試劑等購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3儀器與設(shè)備

PCR擴增儀 S1000，為BIO-RAD公司產(chǎn)品；真空冷凍干燥機，為北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司產(chǎn)品；CAVOY電泳儀PP-1153、電泳槽均為北京凱元信瑞儀器有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，為上海培清科技有限公司產(chǎn)品。

1.4方法

1.4.1鮑內(nèi)臟多肽的制備。皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai）內(nèi)臟來自廈門島之源生物科技有限公司，制備方法參考何傳波等[11]的方法。皺紋盤鮑的內(nèi)臟經(jīng)凍干磨粉處理，用堿性蛋白酶水解后滅酶，冷卻離心，上清過濾得透過液為多肽（以小分子肽為主），所得多肽凍干備用。

1.4.2樣品采集。將SPF級雄性昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始試驗。試驗開始前，隨機選取12只小鼠采集糞便樣品，每4只小鼠的糞便合并為1個樣品，共3個樣品（編號為K01、K02和K03）。然后將小鼠隨機分為陰性對照組（K）和灌胃鮑內(nèi)臟多肽的處理組（PH），每組12只小鼠。K組灌胃生理鹽水1 200 mg/（kg·d），PH組灌胃鮑內(nèi)臟多肽1 200 mg/（kg·d）。試驗期為28 d，分別在試驗的第14、28天采集小鼠糞便，每4只小鼠的糞便混合為一個樣品，每組3個平行樣品。第14天的6個樣品為K141、K142、K143、PH141、PH142、PH143，第28天6個樣品為K281、K282、K283、PH281、PH282、PH283。

1.4.3

DNA提取及Illumina Miseq高通量測序。小鼠糞便基因組DNA提取按照天根糞便基因組DNA試劑盒的步驟進行，提取后送至美吉生物公司進行Illumina Miseq PE300測序。通過美吉公司云平臺i-sanger，將所得序列先根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向進行數(shù)據(jù)優(yōu)化。然后，再對優(yōu)化的數(shù)據(jù)進行分類學(xué)分析，在各個分類水平上統(tǒng)計各樣本的群落組成。通過單樣本分析小鼠糞便樣品中的微生物菌群豐度和多樣性（α-多樣性）。為研究不同樣本間的相似性和差異關(guān)系，根據(jù)Bray-Curtis距離矩陣對樣本進行PCoA分析（principal coordinates analysis），即主坐標分析，可視化呈現(xiàn)小鼠糞便樣本中微生物群落的差異程度。最后，通過Heatmap圖對小鼠糞便樣品進行分析，根據(jù)高豐度和低豐度的物種分塊聚集可知，不同分組的樣品在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。

2結(jié)果與分析

2.1α-多樣性指數(shù)分析

15個樣品共獲得754 345個reads，測得樣品的覆蓋率在99%以上，各樣品獲得的reads為40 828～59 970個，平均每個樣品的reads為（50 290±1 379）個。由于各樣品測序深度不同可能會帶來多樣性分析誤差，因此將樣品均一化到40 000條序列后再進行后續(xù)分析。

chao1指數(shù)用來估計物種總數(shù)，F(xiàn)aiths PD指數(shù)反映某一樣品物種組成的系統(tǒng)進化特征多樣性；Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)來估算樣品中微生物多樣性，其中Shannon值越大，說明群落多樣性越高；Simpson指數(shù)越大，說明群落多樣性越低。從表1可以看出，灌胃鮑內(nèi)臟多肽的處理組（PH）的Chao1指數(shù)和Faiths PD指數(shù)均比同期對照組（K）要高，灌胃鮑內(nèi)臟多肽能增加小鼠腸道微生物多樣性的趨勢，但各組間差異均未達到顯著水平（P>0.05）。試驗第28天處理組（PH）的Simpson指數(shù)顯著低于同期對照組（K）（P<0.05），但對照組和處理組間Shannon指數(shù)差異不明顯。

2.2PCoA分析

小鼠腸道微生物在門、屬、OUT水平上的PCoA分析結(jié)果見圖1。在各水平上，與對照組相比，鮑內(nèi)臟多肽處理組的樣品PH141、PH142、PH143、PH281、PH282和PH283均相對集中地聚在一起，而對照組較為分散。這說明小鼠在灌胃鮑內(nèi)臟多肽后其腸道微生物發(fā)生了一定的偏移，灌胃鮑內(nèi)臟多肽對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)造成了一定的影響。第14、28天采集的鮑內(nèi)臟多肽處理組樣品未分開，在該試驗條件下延長灌胃時間對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響不明顯。

2.3小鼠腸道微生物門水平上的菌群構(gòu)成及灌胃鮑內(nèi)臟多肽對其影響

小鼠腸道中檢測到的微生物序列可分為13門，分別為擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、Saccharibacteria門、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、藍細菌門（Cyanobacteria）、疣微菌門（Verrcomicrobia）、TM6_Dependentiae門、放線菌門（Actinobacteria）、綠菌門（Chlorobi）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）。其中優(yōu)勢類群為擬桿菌門，占總序列的69.10%，其次為厚壁菌門和變形菌門，分別占總序列的23.50%和5.00%，其中變形菌門又以δ-變形菌綱居多，占所有序列的3.80%，此外還有少量的α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱和ε-變形菌綱細菌，所占比例均不到1%。藍細菌門（Cyanobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、Saccharibacteria門和脫鐵桿菌門（Deferribacteres）在所有樣品中也均能檢測到，但所占比例均不到1%。放線菌門（Actinobacteria）在各個樣品中都有檢出，但豐度很低，不到0.1%。綠彎菌門（Chloroflexi）、綠菌門（Chlorobi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、TM6_Dependentiae等僅在PH141樣品中檢測到。不同采樣時間的對照樣品相比，隨著試驗的進行，軟壁菌門的豐度有所下降，而放線菌門的豐度有所上升。與同期對照組相比，灌胃鮑內(nèi)臟多肽后脫鐵桿菌門、Saccharibacteria門和軟壁菌門豐度下調(diào)，其中軟壁菌門豐度顯著下調(diào)，而放線菌門和擬桿菌門豐度上調(diào)（圖2）。

2.4小鼠腸道微生物屬水平上的構(gòu)成及灌胃鮑內(nèi)臟多肽對其影響

小鼠糞便樣品中共檢測到110屬，選取豐度前30位的屬繪制成熱圖，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，小鼠腸道中平均豐度較高的屬有擬桿菌目（Bacteroidales）的一個未分類的屬、擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）、擬桿菌屬（Bacteroides）、另枝菌屬（Alistipes）、毛螺菌科NK4A136（Lachnospiraceae_NK4A136_group）、普雷沃氏菌科UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）、螺桿菌屬（Helicobacter）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）未分類屬、瘤胃菌科UCG-04（Ruminococcaceae_UCG-014）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、副擬桿菌屬（Parabacteroides）、梭菌目vadinBB60組（norank_f__Clostridiales_vadinBB60_group）等。其中擬桿菌目的未分類屬占比30.33%，為優(yōu)勢菌屬；其次是擬普雷沃菌屬，占比12.47%；擬桿菌屬占比9.80%，另枝菌屬占比7.87%。

灌胃鮑內(nèi)臟多肽后，與對照組相比，豐度上調(diào)的屬有4個：理研菌科RC9_gut_group（Rikenellaceae_RC9_gut_group）、副擬桿菌屬（Parabacteroides）、普雷沃氏菌科NK3B31（Prevortellaceae_NK3B31_group）、普雷沃氏菌科UCG-001；其中，副擬桿菌屬的豐度上調(diào)與對照間差異達到顯著水平（P<0.05）。灌胃鮑多肽后豐度下調(diào)的屬有7個，分別為螺桿菌屬、毛螺菌科未分類屬、顫螺旋菌屬（Oscillibacter）、Anaerotruncus屬、糞球菌屬_1（Coprococcus_1）、羅斯氏菌屬（Roseburia）和厭氧支原體屬（Anaeroplasma）。其中，厭氧支原體屬與對照間的豐度差異達到顯著水平（P<0.05）。

3結(jié)論與討論

筆者采用Illumina高通量測序?qū)π∈竽c道微生物的群落結(jié)構(gòu)及灌胃鮑內(nèi)臟多肽對其的影響進行了研究。結(jié)果表明，雖然反映腸道微生物多樣性的Shannon指數(shù)、Faiths PD指數(shù)與對照間差異未達到顯著水平（P>0.05），但鮑內(nèi)臟多肽處理組均高于對照組，第28天Simpson指數(shù)顯著低于對照組（P<0.05）。灌胃鮑內(nèi)臟多肽后小鼠腸道微生物多樣性有增加的趨勢。后續(xù)試驗應(yīng)延長試驗周期，進一步考察灌胃鮑內(nèi)臟多肽對小鼠腸道微生物多樣性的影響。

該研究中PCoA分析結(jié)果表明，灌胃鮑內(nèi)臟多肽后小鼠腸道微生物在門、屬和OTU水平上有趨同聚類趨勢，但整體上還是比較分散，對照組樣品更為分散。這可能是由于小鼠間個體差異造成的。比如在PH141中檢測到綠彎菌門、綠菌門、浮霉菌門、TM6_Dependentiae等，但在其他樣品中極少或未檢測到。盡管該試驗采集的每個樣品都是4只小鼠糞便的混合物，但重復(fù)數(shù)偏少（3個重復(fù)），后續(xù)研究應(yīng)增加生物學(xué)重復(fù)，以減少個體差異帶來的影響。

該研究中灌胃鮑內(nèi)臟多肽后在小鼠腸道中檢測到一些與宿主健康相關(guān)的差異細菌類群。灌胃鮑內(nèi)臟多肽后，豐度顯著上調(diào)的副擬桿菌Parabacteroide能有效產(chǎn)生和分泌水解酶，是厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸過程中的優(yōu)勢種群[16]。豐度上調(diào)的理研菌科_RC9_gut組也被發(fā)現(xiàn)在酒精液體飼料誘導(dǎo)的酒精性肝病中顯著下降[17]，暗示了該菌與小鼠健康之間的關(guān)聯(lián)性。普雷沃氏菌科NK3B31組和普雷沃氏菌科UCG-001也是上調(diào)類群，這些菌屬可以幫助分解蛋白質(zhì)和碳水化合物食物，且與退行性疾病有關(guān)[18-19]。

該研究中灌胃鮑內(nèi)臟多肽后小鼠腸道毛螺菌科一未分類屬、厭氧支原體屬的豐度顯著下調(diào)。毛螺菌科在腸道中較早被發(fā)現(xiàn)，含量豐富，該科的菌種之間差異很大。已有研究表明，與健康的個體相比，毛螺菌科在非酒精性脂肪性肝病的小鼠[20]及患過敏性紫癲幼兒的腸道內(nèi)有更高的豐度[21]，但具體功能有待進一步研究。厭氧支原體是一類無細胞壁的細菌，關(guān)于其功能的研究報道很少，其具體生理功能尚有待進一步研究。其他一些豐度下調(diào)（未達到顯著水平）的屬中，螺桿菌屬中最廣為人知的幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori）是感染率較高的致病菌。顫螺旋菌屬（Oscillibacter）、Anaerotruncus屬等在抵抗肥胖方面起作用[22]，這可能與鮑內(nèi)臟多肽是一種營養(yǎng)豐富的蛋白質(zhì)有關(guān)。

由于方法和數(shù)據(jù)庫信息的限制，該研究獲得的一些差異和未知的細菌類群尚需要進一步鑒定，并對差異細菌進行分離培養(yǎng)，結(jié)合其生理功能進行研究，從而進一步闡明鮑內(nèi)臟多肽對腸道微生物及宿主的影響，為海洋生物活性物質(zhì)的功效評價提供新思路。

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