豬·?！ぱ蛟葱猿煞謱崟r等溫擴增檢測方法的建立

邵長春 劉光瑞 田妮娜

摘要 [目的]建立一種快速檢測豬、牛、羊動物源性成分的實時熒光環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）方法。[方法]針對豬、牛、羊物種ND1、COXⅠ、cytB特異性基因分別設計LAMP引物，通過實時檢測熒光強度判斷反應結果。[結果]豬、羊源性成分的檢測靈敏度為10 pg，牛源性成分的檢測靈敏度為1 pg。對模擬摻雜肉制品檢測時，摻雜豬肉、牛肉、羊肉的檢出限為0.01%。[結論]該研究所建立的LAMP法特異性強、靈敏度高，能有效地對肉制品摻雜的豬、牛、羊源性成分進行檢測，可作為肉類鑒別的一種快速檢測方法。

關鍵詞 豬源性成分；牛源性成分；羊源性成分；環(huán)介導等溫擴增；可視化檢測

中圖分類號 TS207.3 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）09-0186-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.054

Abstract [Objective] The research aimed to establish a loopmediated isothermal amplification （ LAMP） method for porcin， bovine and sheepderived materials in meat products. [Method]LAMP primers were designed for ND1， COXI and cytB specific genes of pig， cattle and sheep， and the reaction results were judged by realtime detection of fluorescence intensity.[Result]The analytical sensitivity of the LAMP assay for porcin and sheep DNA were 10 pg，1 pg for bovine DNA. The detection limits for adulterated meat products could reach 0.01% for porcin， bovine and sheep.[Conclusion]This method exhibits a very high specificity and sensitivity for porcin， bovine，and sheepderived ingredients and can be used in filed studies ，and does not require any gelelectrophoresis apparatus.

Key words Porcinderived component；Bovinederived component；Sheepderived component；Loopmediated isothermal amplification；Visual detection

2013年的馬肉風波在瑞典、德國、法國的部分牛肉中都發(fā)現(xiàn)摻雜馬肉，國內(nèi)媒體也多次曝光鴨肉冒充牛羊肉、假肉丸魚丸等肉類食品摻假事件，肉類食品摻假問題是目前國際國內(nèi)都比較關注的一個問題，美國《FDA食品安全現(xiàn)代化法案》已將摻假行為列入需要重點防范的食品安全風險之一，為了維護消費者權益，很多國家都對肉類產(chǎn)品含量標示做了明確要求，比如歐盟、美國都要求肉制品需標識所有成分及凈含量，我國食品安全法也規(guī)定預包裝食品包裝上應標明名稱、凈含量、成分配料表等。

肉類摻假是目前研究的一個熱點問題，各種檢測方法的開發(fā)也應運而生，主流的檢測方法主要是基于蛋白質和核酸而開發(fā)的方法，基于蛋白檢測的方法有諸多的局限性，尤其是在深加工食品領域，蛋白在食品加工過程中結構發(fā)生了變化，變得不容易被識別，而以核酸為基礎的方法就可以避免這些缺點，因為核酸在所有的生物組織基本都存在，在加工過的食品中不容易被降解，仍然可以被檢測到，所以以核酸檢測為基礎的方法應用更為廣泛。

目前國家也制定了一些肉類成分鑒定的標準[1-2]，這些標準都是通過DNA的檢測技術來制定的，主要采用熒光定量和普通PCR的方法，常需要昂貴的儀器、專業(yè)的操作人員。環(huán)介導等溫擴增技術是2000年日本學者發(fā)明的一種新技術，此技術自出現(xiàn)以來在細菌、病毒、轉基因等領域得到了廣泛的應用[3]，也有很多成型的商品試劑盒，比較適合應用到基層的實驗室當中。

筆者根據(jù)豬、牛、羊物種ND1、COXⅠ、cytB特異性基因序列，設計特異性引物，優(yōu)化試驗條件建立肉制品中豬、牛、羊源性成分的LAMP檢測方法，旨在為肉類摻假鑒別提供方法依據(jù)及技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉、兔肉、狗肉、驢肉、鵝肉、鹿肉、魚肉、狐貍肉、貂肉、鼠肉、蝦肉、馬血；馬血由甘肅省食品檢驗研究院提供。

1.2 主要儀器與試劑

實時熒光PCR儀（QuantStudio7熒光定量PCR儀），超微量分光光度計（eppendorf Biospectrometer basic 系列），通用性LAMP試劑盒（廣州雙螺旋基因有限公司），血液組織DNA提取試劑盒（Qiagen）。

1.3 DNA提取

試驗樣品DNA提取采用試劑盒（QIAGEN），提取DNA的濃度及純度用超微量分光光度計測定。

1.4 引物設計

從GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索獲得豬、牛、羊物種ND1、COXⅠ、cytB特異性基因，利用BLAST在線比對軟件進行分析，采用LAMP專用引物設計軟件Primer Explorer Version 4設計LAMP引物，由大連寶生物有限公司合成，引物序列見表1。

1.5 LAMP反應體系

LAMP反應體系均設為25 μL，內(nèi)引物、環(huán)引物與外引物比例為8∶4∶1，其中內(nèi)引物終濃度為1.6 μmol/L，環(huán)引物終濃度為0.8 μmol/L，外引物終濃度為0.2 μmol/L，并在體系中加入12.5 μL 2×LAMP反應預混液、適量的Bst DNA 聚合酶及DNA模板。將混勻的反應體系置入熒光定量PCR儀中于63 ℃恒溫反應40 min。

1.6 LAMP引物特異性分析

為了驗證所選引物的特異性，分別使用豬、牛、羊的LAMP引物對豬肉、牛肉、羊肉，雞肉、鴨肉、兔肉、狗肉、驢肉、鵝肉、鹿肉、魚肉、狐貍肉、貂肉、鼠肉、蝦肉、馬肉樣品的DNA進行LAMP反應，判斷LAMP引物的針對目標物種的特異性。

1.7 LAMP引物靈敏度檢測試驗

將10倍梯度稀釋的豬、牛、羊源性成分基因組DNA（10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg）分別用于LAMP方法檢測樣品核酸的靈敏度。

1.8 肉制品中目標成分含量測定

為了確定所建立的方法對模擬摻假肉樣品的最低檢出限，分別把鴨、馬、肉3個物種摻入牛肉中，制備成不同摻假比例（10%、1%、0.1%、0.01%）的模擬混合肉樣品，確定摻假肉制品中的最低檢出濃度。

2 結果與分析

2.1 特異性試驗

用設計的3種動物源性成分引物對16種動物的總DNA進行LAMP反應，其擴增結果見圖1，僅針對豬、牛、羊3種動物源性成分產(chǎn)生了擴增曲線，其他混入的動物成分均未出現(xiàn)擴增曲線，表明該試驗設計的LAMP引物具有較好的特異性。

2.2 靈敏度試驗

將10倍梯度稀釋的豬、牛和羊源性成分基因組DNA（10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg）分別用于LAMP反應，其擴增結果見圖2，豬、羊源性成分的檢測靈敏度可達10 pg DNA，牛源性成分的檢測靈敏度為1 pg DNA。

2.3 模擬混合肉中目標成分含量測定

人工制備10%、1%、0.1%和 0.01%摻假比例的模擬樣品，用上述設計的LAMP引物進行檢測，結果如圖3所示，豬、牛、羊源性成分檢測均能檢出0.01%的摻假樣品，而陰性及空白對照反應管擴增呈現(xiàn)陰性。

3 討論與結論

環(huán)介導等溫擴增技術主要是根據(jù)特異性靶序列設計3對特異性引物，分別是外引物（F3/B3）、內(nèi)引物（FIP/BIP）、環(huán)引物（FLP 和 BLP），其中環(huán)引物的加入使得擴增速度明顯提高。該技術所需設備簡單，不需要重復的降溫升溫的循環(huán)過程，具有操作簡便、快速特異的優(yōu)點。自從2000年LAMP技術發(fā)明以來，經(jīng)過近20年的時間，LAMP技術從醫(yī)學領域逐漸延伸到食品、農(nóng)學等更多的領域，在很多領域都建立了一些檢測方法，食品領域主要集中在食品摻雜摻假[4-6]、轉基因[7-10]、過敏原[11]等領域。

基于核酸水平的動物源性成分檢測比較關鍵的一點是選擇合適的靶基因，核染色體基因、線粒體基因以及重復基因序列是常用的靶基因，這其中用的最多的是線粒體基因，首先線粒體基因拷貝數(shù)多，在食品加工過程中遭受的降解程度低[12-13]，其次在不同物種間具有特異性[14]。環(huán)介導等溫擴增技術作為近幾年新興的一項技術有很多優(yōu)點，但是由于在一個片段內(nèi)需要同時設計6個引物，對于引物設計的要求較高，同時需要避免多條引物之間引物二聚體的形成及不同物種間的交叉反應，同時由于敏感性較高，在操作過程中盡量避免氣溶膠污染，產(chǎn)生假陽性，操作過程盡量不要開蓋。

該研究選取線粒體ND1、COXⅠ、cytB基因，經(jīng)DNA軟件比對選取的序列具有種間特異性，可用于區(qū)分不同物種動物。

該研究建立的豬、牛和羊源性成分的實時熒光LAMP檢測方法具有較高的特異性，僅對含有目標DNA的樣品有擴增，對其他動物源性成分的DNA沒有交叉反應。實時熒光 LAMP 法對豬、羊源性成分的檢測靈敏度均可達10 pg，牛源性成分的檢測靈敏度可達1 pg。對模擬摻雜肉檢測時，實時熒光LAMP法對摻雜豬肉、牛肉和羊肉的檢測靈敏度可達0.01%。

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